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문제 정의
- 환삼덩굴에 관한 연구로는 환삼덩굴의 항산화성(Park 등 1994)과 식용유지의 항산화 및 항돌연변이에 대한 효과(Park 등 1995)에 대하여 보고한 바 있다. 따라서 본 연구는 식물자원으로 풍부하게 존재하는 환삼덩굴을 메탄올로 추출하여 다양한 항산화 활성 및 항암활성을 측정하여 기능성소재로서의 이용가능성을 보고자 하였다.
가설 설정
- 2) Values followed by different letters are significantly different at p<0.05.
제안 방법
- DPPH radical 소거활성은 Blois MS(1958)의 방법을 변형하여 측정하였다. 추출물 0.
- 본 실험에서 사용한 암세포는 인체 대장암세포(HCT-116), 폐암세포(A-549), 위암세포(AGS) 및 간암세포(Hep-G2)를 한국세포주은행(KCLB)에서 분양 받아 사용하였다. 각각의 세포는 10% fetal bovine serum(FBS)와 100 U/㎖ penicillin G, 50 ㎍/㎖ streptomycin을 첨가한 RPMI-1640(Gibco Co., NY, USA)을 사용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였으며, 세포 밀도가 높아지면 5분간 trypsin-EDTA를 처리하여 계대배양을 실시하였다. 환삼덩굴 메탄올 추출물의 암세포주 증식에 미치는 영향은 Ishiyanma 등(1996)의 방법에 따라 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT) assay로 실험하였다.
- 즉, 1×105 cell/well 농도로 96 well plate에 100 ㎕씩 분주한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양 후, 전 배양에 사용된 배지를 제거하고 배지에 일정 농도로 희석된 추출물 100 ㎕를 첨가하여 다시 24시간 배양하였다. 배양 완료 후 2 ㎎/㎖ 농도의 MTT시약을 well당 10 ㎕씩 분주한 다음 37℃, 5% CO2 배양기에서 4시간 배양한 후 MTT시약이 포함된 배지를 제거하고, dimethyl sulfoxide(DMSO) 100 ㎕를 가한 다음 상온에서 발색시키고, ELISA microplate reader (ELx 808, BioTek Inc., Winooski, VT, USA)를 이용하여 540㎚에서 흡광도를 측정하였다. 각각의 암세포증식 억제율은 다음의 식에 따라 생존율로 표시하였다.
- 즉, 1×105 cell/well 농도로 96 well plate에 100 ㎕씩 분주한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양후, 전 배양에 사용된 배지를 제거하고 배지에 일정 농도로 희석된 추출물 100 ㎕를 첨가하여 다시 24시간 배양하였다.
- 천연식물 자원으로 풍부하게 존재하는 환삼덩굴의 기능성 소재로서의 가능성을 알아보기 위하여 환삼덩굴 메탄올 추출물에 대한 항산화활성 및 in vitro 항암활성을 측정하였다. 환삼덩굴 추출물의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량은 각각 30.
- 총 플라보노이드 함량은 추출물 250 ㎕에 증류수 1 ㎖와 5% NaNO2 75 ㎕를 첨가한 다음, 5분 후 10% AlCl3·6H2O 150 ㎕를 가하여 6분간 방치하고 1 N NaOH 500 ㎕를 가하였다.
- DPPH radical 소거활성은 Blois MS(1958)의 방법을 변형하여 측정하였다. 추출물 0.2 ㎖에 0.2 mM DPPH 용액(99.9% ethanol에 용해) 0.8 ㎖를 가한 후, vortex mixer로 10초간 진탕하고 30분 후에 분광광도계(UV-1650PC, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 525 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. Hydroxyl radical 소거활성은 Halliwell 등(1987)의 방법에 의거하여 10 nM FeSO4․EDTA 200 ㎕, 10 mM 2-deoxyribose 200 ㎕, 0.
- 추출물에 대한 총 폴리페놀 함량은 Folin-Ciocalte reagent가 추출물의 폴리페놀성 화합물에 의해 환원된 결과, 몰리브덴 청색으로 발색하는 것을 원리로 분석하였다(Dewanto 등 2002). 추출물 50 ㎕에 2% Na2CO3 용액 1 ㎖를 가한 후 3분간 방치 하여 50% Folin-Ciocalteu reagent 50 ㎕를 가하였다. 30분 후, 반응액의 흡광도 값을 750 ㎚에서 측정하였고, 표준물질인 gallic acid를 사용하여 검량선을 작성하였으며, 시료 g 중의㎎ gallic acid equivalent(GAE, dry basis)로 나타내었다.
- 추출물에 대한 총 폴리페놀 함량은 Folin-Ciocalte reagent가 추출물의 폴리페놀성 화합물에 의해 환원된 결과, 몰리브덴 청색으로 발색하는 것을 원리로 분석하였다(Dewanto 등 2002). 추출물 50 ㎕에 2% Na2CO3 용액 1 ㎖를 가한 후 3분간 방치 하여 50% Folin-Ciocalteu reagent 50 ㎕를 가하였다.
대상 데이터
- 본 실험에서 사용한 암세포는 인체 대장암세포(HCT-116), 폐암세포(A-549), 위암세포(AGS) 및 간암세포(Hep-G2)를 한국세포주은행(KCLB)에서 분양 받아 사용하였다. 각각의 세포는 10% fetal bovine serum(FBS)와 100 U/㎖ penicillin G, 50 ㎍/㎖ streptomycin을 첨가한 RPMI-1640(Gibco Co.
- 본 연구에 사용된 시료는 2010년에 한국식물추출물은행에서 환삼덩굴메탄올 추출물을 분양을 받아서 사용하였고, 시약은 Folin-Ciocalteu reagent, gallic acid, DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl), EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid), 2-deoxyribose, TCA(trichloroacetic acid), TBA(tribromoacetic acid) 등은 SigmaAldrich(St. Louis, MO, USA) 제품을 사용하였으며, 모든 시약은 특급시약을 사용하였다.
데이터처리
- 실험 결과는 평균값과 표준편차로 나타내었으며, 통계처리는 SPSS(statistical package for social sciences, version 12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 one-way ANOVA 분석을 실시한 후 Duncan's multiple range test로 유의성을 p<0.05수준에서 검증하였다.
이론/모형
- 8 ㎖를 가한 후, vortex mixer로 10초간 진탕하고 30분 후에 분광광도계(UV-1650PC, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 525 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. Hydroxyl radical 소거활성은 Halliwell 등(1987)의 방법에 의거하여 10 nM FeSO4․EDTA 200 ㎕, 10 mM 2-deoxyribose 200 ㎕, 0.1M 인산완충액 1.39 ㎖에 추출물 10 ㎕를 넣고 10 mM H2O2 200㎕ 용액으로 radical 생성을 유도하여 37℃에서 4시간 반응하였다. 2.
- , NY, USA)을 사용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였으며, 세포 밀도가 높아지면 5분간 trypsin-EDTA를 처리하여 계대배양을 실시하였다. 환삼덩굴 메탄올 추출물의 암세포주 증식에 미치는 영향은 Ishiyanma 등(1996)의 방법에 따라 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT) assay로 실험하였다. 즉, 1×105 cell/well 농도로 96 well plate에 100 ㎕씩 분주한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양 후, 전 배양에 사용된 배지를 제거하고 배지에 일정 농도로 희석된 추출물 100 ㎕를 첨가하여 다시 24시간 배양하였다.
성능/효과
- 61 ㎎/g으로 나타났다. 환삼덩굴 메탄올 추출물에 대한 DPPH radical 및 hydroxyl radical 소거활성을 농도의존적으로 비례하는 경향을 보였으며, IC50% 측정한 각각 4.64, 5.18의 소거활성을 보였다. 환삼덩굴 메탄올 추출물에 대한 in vitro 항암활성을 측정한 결과, 간암세포주의 0.
- 18의 소거활성을 보였다. 환삼덩굴 메탄올 추출물에 대한 in vitro 항암활성을 측정한 결과, 간암세포주의 0.5 ㎎/㎖ 농도에서 50% 암세포 성장억제를 보였지만, 다른 암세포에서는 억제효과를 나타내지 않았다.
- DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) assay는 빠르고 간단하게 이용할 수 있는 측정법으로, 식물이나 식품 추출물 또는 단일 화합물의 항산화능을 측정하기 위해 널리 사용되는 방법이다(Shi 등 2009). 환삼덩굴 메탄올 추출물의 DPPH radical 소거능의 결과는 2 ㎎/㎖에서 60%의 소거능을 보였다(Table 2). Kim 등(2006)은 해조류 메탄올 추출물 7종의 DPPH radical 소거능(6 ㎎/㎖) 결과, 괭이 모자반(Sargassum horneri)은 83%로 가장 높았고, 참김(Porphyra tenera)에서 32%로 가장 낮게 나타났다.
- 천연식물 자원으로 풍부하게 존재하는 환삼덩굴의 기능성 소재로서의 가능성을 알아보기 위하여 환삼덩굴 메탄올 추출물에 대한 항산화활성 및 in vitro 항암활성을 측정하였다. 환삼덩굴 추출물의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량은 각각 30.13 및 13.61 ㎎/g으로 나타났다. 환삼덩굴 메탄올 추출물에 대한 DPPH radical 및 hydroxyl radical 소거활성을 농도의존적으로 비례하는 경향을 보였으며, IC50% 측정한 각각 4.
- 페놀성 화합물은 식물계에 널리 분포되어 있는 물질로 다양한 구조와 분자량을 가지며, 페놀성 화합물의 phenolic hydroxyl 기가 단백질과 같은 거대분자와의 결합을 통해 항산화, 항암 및 항균 등의 생리기능을 가지는 것으로 알려져 있다(Choi 등 2003). 환삼덩굴의 총 폴리페놀 함량과 플라보노이드 함량은 각각 30.13, 13.61 ㎎/g으로 나타났다(Table 1). Lee 등(2012)은 황국과 백국 메탄올 추출물에서 총 폴리페놀 함량이 각각 5.
후속연구
- Lee 등(1999)은 국화인 에키네시아 꽃봉우리, 잎줄기 및 뿌리의 메탄올 추출물이 간암, 폐암, 인간유래 백혈암 및 마우스 백혈암 등 4종의 암세포주에 대하여 강한 억제 활성을 나타내었다고 보고하였다. 이상의 결과를 종합해보면, 환삼덩굴이 특히 간암세포에서 항암활성이 높게 나타나서 항암활성의 물질을 분리하고 특성을 규명하기 위한 추가적인 연구가 수행되어야 할 것 같다.
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