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문제 정의
- 최근 산야초를 이용한 건강식품이 점차 확대되고 있는 반면에, 이들 산야초 식품에 대한 식품학적 성분 분석 및 항산화 활성 등에 대한 연구는 아직 초기단계에 불과하다. 따라서 본 연구에서는 전통발효 공정을 이용한 산야초 발효액의 특성 및 항산화 활성에 대한 기초자료를 제공하고자 산야초 발효액의 일반성분, 색도, 총 페놀 함량 등의 품질특성을 분석하였고 또한 다양한 항산화 평가방법을 이용하여 항산화 효과를 비교하였다.
- 본 연구에서는 산야초 발효액의 품질특성 및 항산화 효과를 평가하였다. 산야초 발효액의 수분함량은 49.
제안 방법
- 3T3-L1 세포는 실험 전날 1×106 cell 농도로 96-well plate에 seeding하고, 시료 10, 100 및 500 ㎍/㎖를 처리하여 24시간 동안 배양하였다.
- 3T3-L1 전지방세포를 실험목적에 따라 24-well plate에 각각 11×106 cell 농도로 seeding한 후, 10% BS 및 1% P/S를 함유한 고농도 포도당 DMEM(89%)에서 100% confluence 될 때까지 배양하였다.
- 7.4 mM ABTS와 2.6 mM potassium persulphate를 제조한 후, 암소에 하루동안 방치하여 양이온(ABTS · +)을 형성시킨 후, 734 nm에서 흡광도의 값이 1.5 이하가 되도록 희석하고, 희석된 ABTS · + 용액 1 ml에 시료 20 μl를 가하여 흡광도의 변화를 정확히 30분 후에 측정하였다.
- Benzie & Stranin(1996)의 방법을 변형하여 Ferric ion reducing antioxidant power(FRAP) assay를 통한 산야초 발효액의 항산화능을 측정하였다.
- 그 후－20℃에 보관 중인 XTT 및 PMS(N-methylphenazonium methyl sulfate) reagent를 37℃에서 완전히 해동시킨 후, 1 ㎖의 XTT reagent와 20 ㎕ PMS reagent를 혼합하여 working solution을 준비하여 놓고, 96-well medium 부피의 20% 되는 양 만큼 취하여 각각의 well에 조심스럽게 첨가하여 plate를 바닥에 붙인 상태로 가볍게 흔들면서 혼합하였다. CO2 incubator에서 4시간 동안 배양한 후 450 ㎚ 흡광도 값에서 690 ㎚의 흡광도 값을 뺀 결과 값으로 세포 독성을 계산하였다.
- 발효액의 환원력은 Oyaizu(1986)의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료 1 ㎖에 pH 6.
- 본 항산화 실험에서 사용한 시료는 –58℃에서 72시간 동결 건조하여 분말화 한 산야초 발효액을 증류수를 용매로 이용하여 10, 50 및 100 ㎎/㎖의 농도로 제조하여 사용하였다.
- 분화 과정에 따른 3T3-L1 세포 내 지방축적량을 측정하고자 각각의 시료를 처리하여 24-well에서 8일 동안 분화된 3T3-L1 세포의 배양액을 제거한 후, 10% formalin 용액 500 ㎕를 첨가하여 5분간 실온에서 방치한 뒤 제거하였다. 그 후 동량의 formalin 용액으로 분화된 3T3-L1 세포 1시간 이상 실온에서 방치한 후, formalin을 제거하고 60% isopropanol 용액 500 ㎕로 세척하여 세포를 완전히 건조시켰다.
- 산야초 발효액을 이용하여 성분분석을 실시하였으며, –58℃에서 72시간 동결건조하여 분말화한 후, 항산화 활성 및 항비만 효과의 시료로 이용하였다.
- 이로부터 2일 후에, 지방세포 분화유도 물질(10 ㎍/㎖ insulin, 1 μM DEX, 0.5 mM IBMX)과 10% FBS 및 10% P/S를 함유한 DMEM으로 전지방세포를 지방세포로 분화 유도하였다.
- 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl radical(DPPH)는 free radical에 대한 시료의 항산화 효능을 확인하기 위하여 사용한다. 전자공여능 측정은 Kim 등(2002)의 방법을 변형하여 측정하였다. Ethanol에 용해시킨 0.
- 즉, 산야초 발효액을 1 ㎎/㎖의 농도로 제조한 뒤, 2% sodium carbonate 용액 1 ㎖와 10% Folin-Ciocalteu's reagent 1 ml를 혼합하여 1시간 방치 후 Microplate Reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA USA)로 750 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, gallic acid를 이용하여 작성한 표준곡선(y=15.851x+0.0492, R2=0.9992)으로 부터 함량을 구하였다.
- 5 mM IBMX)과 10% FBS 및 10% P/S를 함유한 DMEM으로 전지방세포를 지방세포로 분화 유도하였다. 지방세포 분화(day 0)시 DMEM에 시료를 각각 10 및 100 ㎍/㎖로 처리하였고, 이때 산야초 발효액의 효과를 관찰하기 위하여 negative control에는 아무것도 처리하지 않았다. 지방세포의 분화는 분화유도 물질을 처리한 후, 2일마다 지속적으로 10 ㎍/㎖ insulin, 1% P/S, 10% FBS가 함유된 배지에 각각의 시료를 처리하였다.
- 지방세포 분화(day 0)시 DMEM에 시료를 각각 10 및 100 ㎍/㎖로 처리하였고, 이때 산야초 발효액의 효과를 관찰하기 위하여 negative control에는 아무것도 처리하지 않았다. 지방세포의 분화는 분화유도 물질을 처리한 후, 2일마다 지속적으로 10 ㎍/㎖ insulin, 1% P/S, 10% FBS가 함유된 배지에 각각의 시료를 처리하였다.
- 모든 측정은 3회 반복하여 실시하였으며, 평균값±표준편차로 나타내었다. 총 폴리페놀 함량은 Folin-Ciocalteau의 방법을 변형하여 측정하였다(Sato 등 1996). 즉, 산야초 발효액을 1 ㎎/㎖의 농도로 제조한 뒤, 2% sodium carbonate 용액 1 ㎖와 10% Folin-Ciocalteu's reagent 1 ml를 혼합하여 1시간 방치 후 Microplate Reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA USA)로 750 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, gallic acid를 이용하여 작성한 표준곡선(y=15.
대상 데이터
- 3T3-L1 지방세포의 분화 과정 중, 산야초 발효액에 의한 지방세포 분화를 관찰하였다(Furukawa 등 2004; Blumberg 등 2006). 마우스 유래 3T3-L1 세포주는 American Type Culture Collection(ATCC, CL-173, Manassas, VA, USA)으로부터 분양 받아 사용하였다. 3T3-L1 전지방세포를 실험목적에 따라 24-well plate에 각각 11×106 cell 농도로 seeding한 후, 10% BS 및 1% P/S를 함유한 고농도 포도당 DMEM(89%)에서 100% confluence 될 때까지 배양하였다.
- 본 실험에서 사용한 산야초(솔잎, 쑥, 쇠비름, 곰취, 엄나무, 더덕, 둥글레)는 강원도 고성군에서 채취한 것으로 잎, 뿌리와 줄기를 세척 후 항아리에 담은 뒤, 설탕을 첨가하여 상온에서 180일간 식물들의 엑기스 및 성분을 침출시켰다. 그 후 거름망을 이용하여 여과한 여과액을 다시 180일간 자연 발효시켰다.
- 본 연구에서 사용된 시약은 N-acetyl-L-cysteine(NAC), insulin, 3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX), nitroblue tetrazolium(NBT), Oil Red O(ORO), dexamethasone(DEX), 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical(DPPH), acetic acid, gallic acid, 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt(ABTS), isopropanol, Folin & Ciocalteu's phenol reagent, sodium carbonate, 2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine(TPTZ), trichloroacetic acid(TCA), potassium ferricyanide, potassium persulfate 등은 Sigma(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였고, Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM), bovine serum(BS), fetal bovine serum(FBS), penicillin-streptomycin(P/S), phosphate-buffered saline(PBS) 및 trypsin-EDTA는 Gibco(Gaithersburg, MD, USA)로 부터 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- Statistical analysis was performed using the one-way ANOVA(p<0.05).
- 모든 측정은 3회 반복하여 실시하였으며, 평균값±표준편차로 나타내었다.
- 실험결과는 SAS package(release 9.2)를 이용하여 one-way ANOVA 분석 수행하였고, 평균값의 통계적 유의성은 p<0.05 수준에서 검정하였다.
이론/모형
- 3T3-L1 지방세포에 대한 산약초 발효액의 세포 독성평가는 XTT {2,3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium5-carboxanilide innersalt} assay kit를 이용하여 측정하였다 (Furukawa 등 2004; Blumberg 등 2006). 3T3-L1 세포는 실험 전날 1×106 cell 농도로 96-well plate에 seeding하고, 시료 10, 100 및 500 ㎍/㎖를 처리하여 24시간 동안 배양하였다.
- ABTS 라디칼 소거능 측정은 Roberta 등(1999)의 방법으로 측정하였다. 7.
- Effect of fermented wild grass extracts on cell viability. Cell viability was measured by XTT assay. The exponentially growing cells were plated into 96-well plates at a density of 1×10 6 cells/well in DMEM/BS medium and incubated for 24 h prior to treatment at 37℃ in 5% CO2.
- 산야초 발효액의 일반성분 분석은 AOAC법에 준하여 실시하였다. 수분정량은 105℃ 상압가열건조법을 이용하였다.
- 산야초 발효액의 일반성분 분석은 AOAC법에 준하여 실시하였다. 수분정량은 105℃ 상압가열건조법을 이용하였다. 조지방 정량은 diethylether로 추출하는 Soxhlet으로, 조단백질은 semi-micro Kjeldahl법, 조회분은 550℃ 회화로를 이용한 건식회화법으로 각각 분석하였다.
- 수분정량은 105℃ 상압가열건조법을 이용하였다. 조지방 정량은 diethylether로 추출하는 Soxhlet으로, 조단백질은 semi-micro Kjeldahl법, 조회분은 550℃ 회화로를 이용한 건식회화법으로 각각 분석하였다. 모든 측정은 3회 반복하여 실시하였으며, 평균값±표준편차로 나타내었다.
성능/효과
- 그리고 산야초 발효액의 총 페놀함량 분석 결과, 1,185±159 ㎍ GAE/g으로 나타났다.
- 53으로 측정되었다. 다양한 항산화 평가 모델(DPPH, FRAP, 환원력, ABTS)을 통하여 산야초 발효액의 항산화 활성을 측정한 결과, 산야초 발효액의 농도가 증가함에 따라 항산화능이 유의적으로 증가하는 것으로 나타났다. 한편, 산야초 발효액은 지방세포에 대한 세포독성을 나타내지 않은 반면, 지방세포 분화에 대한 억제 효능은 미비하게 나타났다.
- 1(d)과 같다. 산야초 발효액의 10, 50 및 100 ㎎/㎖의 농도에서 ABTS radical 소거활성은 각각 21.5, 55.51 및 81.07%로 유의적으로 증가하는 경향이 나타났다. 항산화능을 평가하는 네 종류의 실험에서 산야초 발효액의 경우, 농도별로 항산화능이 유의적으로 증가하는 것으로 보아 항산화 효과가 있는 것으로 생각된다.
- 산야초 발효액의 10, 50 및 100 ㎎/㎖의 농도에서 DPPH radical 소거활성은 각각 34.9±0.8, 55.37±1.0 및 74.61±2.0%로 산야초 추출물의 농도가 증가함에 따라 DPPH radical 소거활성도 유의적으로 증가하는 것으로 나타났다.
- 이상의 결과로 볼 때, 산야초 발효액은 페놀성 화합물을 함유하고 있으며, 다양한 항산화 실험 모델에서 활성을 나타내었다. 그러나 지방세포 분화 억제를 통한 항비만 활성에는 나타내지 않았다.
- 따라서 산야초 발효액의 경우 10, 100 및 500 ㎍/㎖에서는 세포 독성을 가지지 않을 것으로 생각된다. 한편, 3T3-L1 세포는 분화과정을 거쳐 세포 내 중성지방을 축적하는 특징을 가지는데, 이때 산야초 발효액에 의한 지방세포의 분화 억제 정도를 Oil Red O staining 방법으로 평가한 결과(Fig. 3), 3T3-L1 지방세포의 분화에 대한 산야초 발효액의 항비만 효과는 미비하게 나타났다.
- 다양한 항산화 평가 모델(DPPH, FRAP, 환원력, ABTS)을 통하여 산야초 발효액의 항산화 활성을 측정한 결과, 산야초 발효액의 농도가 증가함에 따라 항산화능이 유의적으로 증가하는 것으로 나타났다. 한편, 산야초 발효액은 지방세포에 대한 세포독성을 나타내지 않은 반면, 지방세포 분화에 대한 억제 효능은 미비하게 나타났다. 따라서 산야초의 발효액을 제조시 기능성 향상을 위한 발효공정의 개선 및 최적화 등의 추후 연구가 필요한 것으로 사료된다.
- 07%로 유의적으로 증가하는 경향이 나타났다. 항산화능을 평가하는 네 종류의 실험에서 산야초 발효액의 경우, 농도별로 항산화능이 유의적으로 증가하는 것으로 보아 항산화 효과가 있는 것으로 생각된다.
후속연구
- 한편, 산야초 발효액은 지방세포에 대한 세포독성을 나타내지 않은 반면, 지방세포 분화에 대한 억제 효능은 미비하게 나타났다. 따라서 산야초의 발효액을 제조시 기능성 향상을 위한 발효공정의 개선 및 최적화 등의 추후 연구가 필요한 것으로 사료된다.
- 그러나 지방세포 분화 억제를 통한 항비만 활성에는 나타내지 않았다. 향후, 산야초 발효액의 활성 증대를 위해서는 산야초 발효공정의 개선 및 발효원료의 선별 등을 통하여 효능이 증대된 발효액의 개발이 필요한 것으로 사료되었다.
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