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문제 정의
- 버섯균사체 대량생산기법을 통하여 생산된 상황버섯 균사체를 활용하여 면역증진용 건강기능식품 및 사료첨가제 등을 개발하기 위하여 상황버섯 균사체 추출물(PLM)의 세포독성평가 및 면역증진효능을 조사하였다. 마우스 섬유아세포주 L-929 cell을 대상으로 실시한 세포독성 실험결과 상황버섯 균사체 추출물(PLM)은 10 µg/ml의 모든 농도에서 L-929 세포의 증식에 영향을 주지 못하였다.
- 그러나 자실체를 이용한 인공재배는 수년의 시간이 소요되고 가격도 상당히 고가여서 대중화의 어려움이 많았으나 최근 버섯균사체에 생산기법이 발달하여 균사체를 이용한 상황버섯 기능 연구도 진행되고 있다. 이에 저자 등은 버섯균사체 대량생산 공정을 확립하고 표준화를 통해 생산된 상황버섯 균사체 추출물의 면역 활성에 대한 기전작용을 연구하고 향후 균사체 추출물을 활용한 건강기능식품 뿐만 아니라 적용범위를 확대하여 사료첨가제 같이 신소재개발에 활용하고자 본 연구를 수행하였다.
제안 방법
- PCR은 Maxime PCR PreMix Kit (INTRON, Korea)로 VeritiTM 96well Thermal Cycler(Applied Biosystems, USA)를 이용하였으며 TNF-α, Forward(5'-CAG CCT CTT CTC CTT CCT GAT-3') Reverse(5'-GCC AGA GGG CTG ATT AGA GA-3') and IL-6, Forward (5'-GAT GAG TAC AAA AGT CCT GAT CCA-3') Reverse(5'-CTG CAG CCA CTG GTT CTG T-3')를 60℃에서 35회 반응시켰다. PCR 후 sample은 1.5% agarose gel에서 전기영동하여 Chemidoc XRS system(Bio-rad, USA)으로 분석하였다.
- PCR은 Maxime PCR PreMix Kit (INTRON, Korea)로 VeritiTM 96well Thermal Cycler(Applied Biosystems, USA)를 이용하였으며 TNF-α, Forward(5'-CAG CCT CTT CTC CTT CCT GAT-3') Reverse(5'-GCC AGA GGG CTG ATT AGA GA-3') and IL-6, Forward (5'-GAT GAG TAC AAA AGT CCT GAT CCA-3') Reverse(5'-CTG CAG CCA CTG GTT CTG T-3')를 60℃에서 35회 반응시켰다.
- PLM이 복강 대식세포 (peritoneal macrophage)에 PLM을 동일한 방식으로 처리한 후 IL-6 및 TNF-α의 분비량을 ELISA cytokine kit (R&D system, USA)를 이용하여 측정하였다(Fig. 4).
- PLM이 직접적으로 T세포 및 B세포의 증식에 미치는 영향을 살펴보기 위하여 비장세포에 0.001, 0.01, 0.1, 1 µg/ml의 농도의 상황버섯 균사체 추출물(PLM)과 Con A(5 µg/ml) 및 LPS (15 µg/ml)을 각각 첨가하여 배양하였다.
- Rat 복강 대식세포의 사이토카인(TNF-α, IL-6) 분비능 측정 − SD rat의 복강 내 대식세포를 추출하여 배양시킨 다음 배양 상층액으로 부터 분비되는 사이토카인(IL-6, TNF-α) 분비량을 각각 측정하였다.
- 각 plate는 37℃, 5% CO2 incubator(Thermo)에서 72시간 배양한 후 세포증식능을 MTS assay(CellTiter 96®AQUEOUS Non-Radioactive Cell Proliferation Assay, Promega, USA)로 측정하였다.
- 각 well에 상황버섯 균사체 추출물(PLM)을 농도별(0.1, 1, 10 µg/ml)로 첨가하여 각각 72시간 배양하였다.
- 1, 1 µg/ml의 농도의 상황버섯 균사체 추출물(PLM)과 Con A(5 µg/ml) 및 LPS (15 µg/ml)을 각각 첨가하여 배양하였다. 대조군으로는 PLM 대신 동량의 배양액 (10% FBS-RPMI 1640)을 첨가하였다. 또한 T세포를 선택적으로 증가시키는 Con A (5 µg/ml) 단독투여군 및 B세포를 선택적으로 증가시키는 LPS(15 µg/ml) 단독 투여군을 각각 양성대조군으로 하였다.
- 또한 T세포를 선택적으로 증가시키는 Con A (5 µg/ml) 단독투여군 및 B세포를 선택적으로 증가시키는 LPS(15 µg/ml) 단독 투여군을 각각 양성대조군으로 하였다.
- 배양 상층액을 분리하여 배양액 중 IL-6, TNF-α 량을 ELISA 사이토카인kit(R&D system, USA)를 이용하여 측정하였다.
- 배양 후 배양액을 버리고, dimethylsulfoxide(DMSO)를 200 µl/well씩 넣어 5 분간 shaking한 후 ELISA reader (540 nm)로 MTT의 흡광도를 측정하여, 대조군과 비교 조사하였다.
- 비장세포 증식능 측정 − 각 군별로 Rat 비장세포 현탁액을 5.0 × 106 cell/ml이 되도록 희석하여 96 well plate의 각 well 당 90 µl씩 분주하고, 각 군당 mitogen으로 ConA(5 µg/ml) 및 LPS (15 µg/ml)를 10 µl 씩 각각 분주하고, 대조군에는 배지를 동량으로 분주하였다.
- 상황버섯 균사체 추출물(PLM)의 세포 증식능 평가 − PLM의 세포 증식 및 세포 독성평가를 위해 마우스 섬유아세포주 L-929에 PLM을 각각 0, 0.01, 0.1 µg/ml 농도로 24시간 동안 처리한 후 세포 증식 및 membrane integrity의 변화를 확인하였다.
- 세포 독성 평가 − 마우스 섬유아세포주 L-929 cell을 96 well에 1 × 105 cells/ml 씩 넣고, 24 시간 배양 후 상황버섯 균사체 추출물(PLM)를 농도별(0.001, 0.01, 0.1, 1, 10 µg/ ml)로 첨가하여 24, 48, 72시간 동안 배양하였다.
- RBC lysis buffer에 5분간 처리하여 적혈구를 제거하였다. 적혈구가 제거된 비장세포는 다시 RPMI 1640 용액에 분산시켜, trypan blue solution으로 염색한 후 hemocytometer를 이용하여 세포수를 측정하였다. 세포농도 5.
대상 데이터
- Rat 비장세포의 분리 및 배양11) − 본 실험에서 사용된 SD rat은 나라 바이오텍(경기도 평택)에서 구입한 6주령 수컷을 사용하였다.
- 74106, Qiagen, Germany)를 이용하여 total mRNA를 분리하였다. cDNA는 Maxime RT PreMix Kit(INTRON, Korea)를 이용하여 합성하였다. PCR은 Maxime PCR PreMix Kit (INTRON, Korea)로 VeritiTM 96well Thermal Cycler(Applied Biosystems, USA)를 이용하였으며 TNF-α, Forward(5'-CAG CCT CTT CTC CTT CCT GAT-3') Reverse(5'-GCC AGA GGG CTG ATT AGA GA-3') and IL-6, Forward (5'-GAT GAG TAC AAA AGT CCT GAT CCA-3') Reverse(5'-CTG CAG CCA CTG GTT CTG T-3')를 60℃에서 35회 반응시켰다.
- 실험재료 − 상황버섯 균사체는 경북 안동의 (주)류충현 약용버섯에서 공급받아 사용하였다.
- 이 분말 5g을 정제수 50 ml에 녹여 4℃에서 24시간 동안 투석하였다(MW cut off 3,500; Pierce Biotechnology, Rockford, IL). 투석액은 48시간 동안 동결건조(-55℃, 6 Torr.)시켜 미황색 분말 3.5g(수율 : 0.7%)을 얻었으며 냉동보관 후 실험 시 증류수에 녹여 균사체 추출물(PLM) 시료로 사용하였다.
이론/모형
- Rat 비장세포의 증식능은(Proliferation Index % = Sample의 흡광도/Control의 흡광도 ×100)의 공식에 의해 계산되었다.
성능/효과
- 14) THP-1를 macrophage로 분화를 유도시킨 후 PLM을 각각 0, 0.1, 1.0, 10 µg/ml 농도로 처리하고 72 시간 배양 후 TNF-α 및 IL-6의 분비량을 각각 reverse transcriptase PCR (RT-PCR) 방법으로 측정하여 본 결과 상황버섯 균사체 추출물 (PLM)을 처리하지 아니한 대조군에 비하여 PLM 투여군에서는 농도 의존적으로 TNF-α 및 IL-6의 분비량이 증가되는 경향을 관찰할 수 있었다(Fig. 2).
- Con A 단독 투여군의 경우에는 대조군에 비하여 세포증식능이 크게 증가되었으며 Con A와 함께 PLM을 병용 투여한 경우에는 모든 농도에서 세포 증식능이 더욱 증가되었으며 특히 PLM을 0.001-1 µg/ml의 농도로 투여한 경우에는 Con A 단독 투여군에 비하여 세포 증식능이 20% 정도 증가되었다.
- PLM을 농도별로 처리 후 세포생존율의 변화을 MTT assay 방법에 준하여 측정하여 본 결과 상황버섯 균사체 추출물(PLM) 투여군은 모든 농도영역에서 세포의 증식을 증가시키는 것을 확인하였으며, 0.1 µg/ml을 처리한 세포의 증식능은 대조군에 비해 1.2배 이상 증가한 것을 확인하였다(Fig.
- 그 결과 대식세포를 대상으로 실시한 연구결과와 유사하게 PLM 처리군은 대조군 및 LPS 단독 투여군에 비하여 IL-6 및 TNF-α의 분비량이 각각 농도 의존적으로 증가하였다.
- 따라서 PLM은 0.1 µg/ml 이하의 농도에서는 섬유아세포주 L-929의 증식능을 활성화 시키며, membrane integrity에 전혀 영향을 주지 않는 것을 확인하였다.
- 001-1 µg/ml의 농도로 투여한 경우에는 Con A 단독 투여군에 비하여 세포 증식능이 20% 정도 증가되었다. 따라서 PLM은 특이적으로 T세포의 활성을 촉진시켜 면역 반응을 증가시킬 가능성이 있을 것으로 사료된다. 일반적으로 많은 면역 활성 물질은 기본적으로 마이토젠 활성을 가지고 있기 때문에 기능성 식품으로의 실제적인 응용이 가능하며, 이와 같은 연구결과는 상황버섯 추출물이 T세포 관련 면역활성을 증가시킨다는 기존의 보고와 잘 일치하고 있다.
- 상황버섯 균사체가 splenocyte의 증식에 미치는 영향 − 비장세포는 면역복합세포로서 면역세포 중에서도 세포성 면역에 관여하는 T 세포, 마크로파지 및 체액성 면역에 관여하는 B 세포로 구성되어 있으며, 면역 활성 물질에 자극을 받으면 증식이 증가한다. 따라서 상황버섯 균사체 추출물이 면역계에 주요한 세포인 비장세포의 활성화에 미치는 영향을 검토하여 우수한 면역활성을 가지고 있음을 확인하였다(Fig. 5). PLM이 직접적으로 T세포 및 B세포의 증식에 미치는 영향을 살펴보기 위하여 비장세포에 0.
- 상황버섯 균사체 추출물(PLM)은 human monocyte cell (THP-1)로부터 염증성 사이토카인, IL-6 및 TNF-α의 분비를 농도 의존적으로 증가시켰으나 증가폭은 미미한 수준이었다. 또 상황버섯 균사체 추출물(PLM)은 rat 복강대식세포로부터 IL-6 및 TNF-α의 분비를 농도 의존적으로 증가시켰으며 특히 10 µg/ml 농도의 상황버섯 균사체 추출물을 처리했을 IL-6 및 TNF-α의 분비량은 2-3배 증폭되었다. 아울러 상황버섯 균사체 추출물(PLM)은 Con A로 자극한 rat 복강대식세포의 증식을 특이적으로 촉진시켰으며 이는 상황버섯 균사체 추출물(PLM)이 T 세포 증식에 영향을 주고 있으리라 사료된다.
- 1(A)). 또한, PLM에 의한 membrane integrity의 변화에 대한 평가 결과 PLM 투여군은 모든 농도영역에서 LDH level이 나타나지 않음을 확인하였다(Fig. 1(B)).
- 마우스 섬유아세포주 L-929 cell을 대상으로 실시한 세포독성 실험결과 상황버섯 균사체 추출물(PLM)은 10 µg/ml의 모든 농도에서 L-929 세포의 증식에 영향을 주지 못하였다.
- 또한 T세포를 선택적으로 증가시키는 Con A (5 µg/ml) 단독투여군 및 B세포를 선택적으로 증가시키는 LPS(15 µg/ml) 단독 투여군을 각각 양성대조군으로 하였다. 비장세포의 증식을 통한 림프구의 활성 측정 결과, Fig. 5에서 보이는 바와 같이 LPS 단독 투여군의 경우 대조군과 비교하여 뚜렷한 세포 증식효과가 관찰되지 아니 하였으나 LPS와 더불어 PLM을 병용 투여한 경우에는 미미하게나마 세포증식능이 향상됨을 관찰할 수 있었다. Con A 단독 투여군의 경우에는 대조군에 비하여 세포증식능이 크게 증가되었으며 Con A와 함께 PLM을 병용 투여한 경우에는 모든 농도에서 세포 증식능이 더욱 증가되었으며 특히 PLM을 0.
후속연구
- 또 상황버섯 균사체 추출물(PLM)은 rat 복강대식세포로부터 IL-6 및 TNF-α의 분비를 농도 의존적으로 증가시켰으며 특히 10 µg/ml 농도의 상황버섯 균사체 추출물을 처리했을 IL-6 및 TNF-α의 분비량은 2-3배 증폭되었다. 아울러 상황버섯 균사체 추출물(PLM)은 Con A로 자극한 rat 복강대식세포의 증식을 특이적으로 촉진시켰으며 이는 상황버섯 균사체 추출물(PLM)이 T 세포 증식에 영향을 주고 있으리라 사료된다.
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