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문제 정의
- , 1998). 본 연구에서는 IEX-1이 세포 종류에 따라 어떻게 다양한 기능을 가질 수 있는지, 어떻게 세포사멸을 유도할 수 있는지 확인하고자 새로운 결합 단백질을 찾고자 하였다. 선행연구에서 본 연구자들은 yeast two-hybrid 시스템으로 IEX-1을 bait로 하여 human ovarian cDNA library에서 IEX-1과 결합하는 단백질을 확인하였다.
제안 방법
- 3A)을 사용하여 pCMV-Myc-CATHEPSIN B 유전자와 함께 세포에 과다 발현시켰다. 12시간 배양 후, anti-HA 항체로 면역침강법을 수행한 후 및 anti-Myc 항체 western blot을 실시하였다. 그 결과, CATHEPSIN B 단백질은 IEX-1-ΔNLS와 IEX-1-ΔTM 모두에 결합함을 확인하였다(Fig.
- 2종류의 돌연변이체, pCDNA3-HAIEX-1-ΔNLS(Δ58-64), pCDNA3-HA-IEX-1-ΔTM(Δ83-99) (Fig. 3A)을 사용하여 pCMV-Myc-CATHEPSIN B 유전자와 함께 세포에 과다 발현시켰다.
- 50 μg의 단백질을 10% 또는 15% SDS 단백질 전기영동을 실시하였다.
- , 2009). Human ovarian cDNA로부터 Pfu DNA polymerase(Takara)를 이용한 PCR을 통해 Human CATHEPSIN B(BC010240) open reading frame을 증폭시켰다. 사용된 프라이머는 CTSB-(SfiI)- F(5'- ATG GCC ATG GAG GCC ATG TGG CAG CTC TGG GCC TCC), CTSB-(XhoⅠ)-R (5'-ACC TCG AGA TTA GAT CTT TTC CCA GTA CTG)이다.
- 50 μg의 단백질을 10% 또는 15% SDS 단백질 전기영동을 실시하였다. NC membrane에 단백질을 transfer한 후 anti-IEX-1(Yoon et al., 2009) 또는 anti-CATHEPSIN B, anti-HA(Satacruz), anti-Myc 항체를 이용하여 단백질을 확인하였다. 세포에서 IEX-1과 CATHEPSIN B 단백질의 결합을 확인하기 위해서 면역침강법(Immunoprecipitation)을 실시하였으며, 실험방법은 기존에 발표된 논문에 설명되었다(Yoon et al.
- 사용된 프라이머는 CTSB-(SfiI)- F(5'- ATG GCC ATG GAG GCC ATG TGG CAG CTC TGG GCC TCC), CTSB-(XhoⅠ)-R (5'-ACC TCG AGA TTA GAT CTT TTC CCA GTA CTG)이다. PCR product는 제한효소 XhoІ과 SfiІ(Takara)을 이용하여 pCMV-Myc vector로 클로닝하여 염기분석하였다.
- Yeast two-hybrid system의 결합을 다시 한번 확인하기 위해서 인간 암 세포주에서 면역침강법을 수행하였다. 두 단백질을 암 세포주에서 과다발현(overexpression)시킨 후 결합을 확인하기 위해 pCDNA3-HA-IEX-1과 pCMV-Myc-CATHEPSIN B 두 플라스미드를 리포좀 방법을 이용하여 293T 세포주에 transfection하였다.
- Yeast two-hybrid system의 결합을 다시 한번 확인하기 위해서 인간 암 세포주에서 면역침강법을 수행하였다. 두 단백질을 암 세포주에서 과다발현(overexpression)시킨 후 결합을 확인하기 위해 pCDNA3-HA-IEX-1과 pCMV-Myc-CATHEPSIN B 두 플라스미드를 리포좀 방법을 이용하여 293T 세포주에 transfection하였다. 12시간 배양 후 수거한 전체 세포 lysate 250 μg에 anti- HA 또는 anti-Myc 항체를 이용하여 면역침강법을 수행하고, anti-Myc 항체 또는 anti-HA항체를 이용하여 western blot를 실시하였다.
- 본 연구에서 293 세포주와 HeLa 세포주를 사용하였다. 세포 배양을 위해 DMEM(Welgene) 배지를 이용하였으며, 10% fetal bovine serum(Welgene)과 1% penicillin streptomycin(Welgene)을 첨가하여 사용하였다. 37℃, 5% CO2 환경의 세포 배양기를 이용하여 배양하였다.
- 이 결과를 바탕으로 하여 HeLa 세포에서 endogenous IEX-1과 CATHEPSIN B의 결합을 알아보기 위해 전체 세포 lysate 500 μg에 antirabbit IgG 또는 anti-IEX-1(Yoon et al., 2009) 그리고 antigoat IgG 또는 anti-CATHEPSIN B로 4℃ 조건에서 면역침강시킨 후 anti-CATHEPSIN B 또는 anti-IEX-1을 이용하여 western blot를 수행하였다.
대상 데이터
- 그러나 아직까지 알려진 consensus domain은 존재하지 않으며, 종간에 염기서열이 잘 보존되어 있는 것으로 알려져 있다. IEX-1 단백질의 CATHEPSIN B 단백질과의 결합도메인을 결정하기 위해 IEX-1 돌연변이체 단백질을 사용하였다. 2종류의 돌연변이체, pCDNA3-HAIEX-1-ΔNLS(Δ58-64), pCDNA3-HA-IEX-1-ΔTM(Δ83-99) (Fig.
- 본 연구에서 293 세포주와 HeLa 세포주를 사용하였다. 세포 배양을 위해 DMEM(Welgene) 배지를 이용하였으며, 10% fetal bovine serum(Welgene)과 1% penicillin streptomycin(Welgene)을 첨가하여 사용하였다.
- 사용된 프라이머는 CTSB-(SfiI)- F(5'- ATG GCC ATG GAG GCC ATG TGG CAG CTC TGG GCC TCC), CTSB-(XhoⅠ)-R (5'-ACC TCG AGA TTA GAT CTT TTC CCA GTA CTG)이다.
이론/모형
- 12시간 배양 후 수거한 전체 세포 lysate 250 μg에 anti- HA 또는 anti-Myc 항체를 이용하여 면역침강법을 수행하고, anti-Myc 항체 또는 anti-HA항체를 이용하여 western blot를 실시하였다.
- , 2009) 또는 anti-CATHEPSIN B, anti-HA(Satacruz), anti-Myc 항체를 이용하여 단백질을 확인하였다. 세포에서 IEX-1과 CATHEPSIN B 단백질의 결합을 확인하기 위해서 면역침강법(Immunoprecipitation)을 실시하였으며, 실험방법은 기존에 발표된 논문에 설명되었다(Yoon et al., 2009).
- 15M NaCl, 1% NP-40)을 이용하여 세포 내 전체 단백질을 추출하였다. 추출된 단백질의 정량을 위해 Bradford protein assay(Bio-rad)를 실시하였다. 50 μg의 단백질을 10% 또는 15% SDS 단백질 전기영동을 실시하였다.
성능/효과
- 12시간 배양 후 수거한 전체 세포 lysate 250 μg에 anti- HA 또는 anti-Myc 항체를 이용하여 면역침강법을 수행하고, anti-Myc 항체 또는 anti-HA항체를 이용하여 western blot를 실시하였다. Fig. 1처럼, 과다 발현된 IEX-1과 CATHEPSIN B 두 단백질이 인간 세포주에서 직접적으로 결합함을 확인할 수 있었다. 이 결과를 바탕으로 하여 HeLa 세포에서 endogenous IEX-1과 CATHEPSIN B의 결합을 알아보기 위해 전체 세포 lysate 500 μg에 antirabbit IgG 또는 anti-IEX-1(Yoon et al.
- IEX-1이 어떻게 세포의 생장과 사멸을 유도하는지 알아보기 위한 방법으로, IEX-1의 세포 내 새로운 파트너를 찾기 위해 선행연구에서 yeast two-hybrid assay를 수행하였다. IEX-1과 결합하는 DNA insert를 염기 분석하였고, NCBI blast search를 수행한 결과, IEX-1과 강한 결합을 보이는 cystein protease인 CATHEPSIN B를 최종 검출하였다.
- 그 결과, CATHEPSIN B 단백질은 IEX-1-ΔNLS와 IEX-1-ΔTM 모두에 결합함을 확인하였다(Fig. 3B).
- 그 중에서 ‘lysosomal pathway of apoptosis’에서 중요한 역할을 하는 cystein protease member인 CATHEPSIN B가 IEX-1과 강하게 결합력을 나타냄을 확인하였으며, yeast two-hybrid 결과를 바탕으로 인간 암세포주에서 두 단백질이 직접적으로 결합하는 것을 확인하였다.
- 즉, 미토콘드리아를 통한 세포사멸 조절과정에서 두 단백질은 서로의 기능에 직접적으로 영향을 미칠 가능성이 크다고 예측할 수 있으며 이를 통해 IEX-1은 CATHEPSIN B의 새로운 기질일 가능성을 제시할 수 있다. 이번 연구를 통해 IEX-1은 한 가지의 정해진 공통적 경로를 통하기보다는 lysosome-mediated apoptotic 경로를 포함한 여러 신호전달경로에 의해 그 기능이 조절됨을 알 수 있다. 또한 IEX-1의 하위메커니즘을 예측할 수 있으며, 나아가 세포의 생존을 결정하는 새로운 조절네트워크를 밝히기 위해 한발 더 나아갔음을 의미한다.
- 그러나 세포사멸 동안 IEX-1은 활성산소의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다. 즉, 미토콘드리아를 통한 세포사멸 조절과정에서 두 단백질은 서로의 기능에 직접적으로 영향을 미칠 가능성이 크다고 예측할 수 있으며 이를 통해 IEX-1은 CATHEPSIN B의 새로운 기질일 가능성을 제시할 수 있다. 이번 연구를 통해 IEX-1은 한 가지의 정해진 공통적 경로를 통하기보다는 lysosome-mediated apoptotic 경로를 포함한 여러 신호전달경로에 의해 그 기능이 조절됨을 알 수 있다.
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