미역(Undaria pinnatifada)은 낮은 칼로리 및 요오드의 원료로써 천연체중조절식품으로 알려져 있다. 미역이 체중조절식품으로 알려져 있음에도 불구하고, 지방세포 분화 및 지방축적에 관한 저해 기작은 연구가 미비하다. 본 연구에서는 3T3-L1에서 지방세포로 분화가 일어나는 단계에서 미역에탄올추출물의 효과 및 기작을 확인하였다. 미역에탄올추출물의 독성과 지방축적저해효과는 MTT assay, Oil red O staining, RT-PCR과 western blot으로 분석하였다. 미역에탄올추출물은 50 ${\mu}g/ml$의 농도에서 독성을 띄지 않았다. 3T3-L1의 분화 및 지방세포에서 triglyceride축적과정동안 50 ${\mu}g/ml$의 미역에탄올추출물을 처리하였으며, 미역에탄올추출물은 지방세포에서 triglyceride의 축적을 40% 감소시켰다. 지방세포 특이적 단백질인 Peroxisome proliferator activated receptor${\gamma}$ ($PPAR{\gamma}$), leptin과 Hormone sensitive lipase (HSL)의 발현은 RT-PCR과 western blot으로 확인하였다. $PPAR{\gamma}$의 과발현은 지방세포의 분화를 촉진시킨다. 또한 지방세포 크기의 증가와 세포 내 triglyceride의 함량에 따라 leptin은 세포 외로 분비된다. 그러므로 $PPAR{\gamma}$와 leptin은 비만의 지표로 사용된다. 첨가한 미역에탄올추출물의 농도가 높아질수록 $PPAR{\gamma}$와 leptin의 발현이 억제되었다. 이상의 결과를 통하여, 미역의 에탄올 추출물은 지방전구세포의 분화를 억제시키며, 지방세포 내 triglyceride의 축적을 저해하는 것으로 판단된다.
미역(Undaria pinnatifada)은 낮은 칼로리 및 요오드의 원료로써 천연체중조절식품으로 알려져 있다. 미역이 체중조절식품으로 알려져 있음에도 불구하고, 지방세포 분화 및 지방축적에 관한 저해 기작은 연구가 미비하다. 본 연구에서는 3T3-L1에서 지방세포로 분화가 일어나는 단계에서 미역에탄올추출물의 효과 및 기작을 확인하였다. 미역에탄올추출물의 독성과 지방축적저해효과는 MTT assay, Oil red O staining, RT-PCR과 western blot으로 분석하였다. 미역에탄올추출물은 50 ${\mu}g/ml$의 농도에서 독성을 띄지 않았다. 3T3-L1의 분화 및 지방세포에서 triglyceride축적과정동안 50 ${\mu}g/ml$의 미역에탄올추출물을 처리하였으며, 미역에탄올추출물은 지방세포에서 triglyceride의 축적을 40% 감소시켰다. 지방세포 특이적 단백질인 Peroxisome proliferator activated receptor ${\gamma}$ ($PPAR{\gamma}$), leptin과 Hormone sensitive lipase (HSL)의 발현은 RT-PCR과 western blot으로 확인하였다. $PPAR{\gamma}$의 과발현은 지방세포의 분화를 촉진시킨다. 또한 지방세포 크기의 증가와 세포 내 triglyceride의 함량에 따라 leptin은 세포 외로 분비된다. 그러므로 $PPAR{\gamma}$와 leptin은 비만의 지표로 사용된다. 첨가한 미역에탄올추출물의 농도가 높아질수록 $PPAR{\gamma}$와 leptin의 발현이 억제되었다. 이상의 결과를 통하여, 미역의 에탄올 추출물은 지방전구세포의 분화를 억제시키며, 지방세포 내 triglyceride의 축적을 저해하는 것으로 판단된다.
Undaria pinnatifada has been used as a natural diet food with few calories and as a source of iodine. Even though U. pinnatifida has been regarded as a diet food, the mechanisms of its inhibitory effects on adipocyte differentiation and the accumulation of fat in adipocytes are poorly understood. In...
Undaria pinnatifada has been used as a natural diet food with few calories and as a source of iodine. Even though U. pinnatifida has been regarded as a diet food, the mechanisms of its inhibitory effects on adipocyte differentiation and the accumulation of fat in adipocytes are poorly understood. In this study, the effect and mechanism of U. pinnatifida ethanol extract on 3T3-L1 differentiation into adipocytes were investigated. The effects of U. pinnatifida ethanol extract on cell viability and the anti-adipogenic effect were investigated via MTT assay, Oil red O staining, RT-PCR, and western blot. The U. pinnatifida ethanol extract did not show toxicity up to a concentration of 50 ${\mu}g/ml$. The addition of U. pinnatifida ethanol extract decreased triglyceride contents by 40% when 50 ${\mu}g/ml$ of U. pinnatifida ethanol extract was added during 3T3-L1 differentiation and adipocyte triglyceride formation. The transcription and expression of peroxisome proliferator-activated receptor ${\gamma}$ ($PPAR{\gamma}$), leptin, and hormone-sensitive lipase (HSL) as adipocyte-specific proteins were determined by RT-PCR and western blot. The overexpression of $PPAR{\gamma}$ could accelerate adipocyte differentiation. Also, leptin was secreted for triglyceride accumulation in the adipocytes and the increase of adipocyte cell size. Thus, $PPAR{\gamma}$ and leptin were used as indicators of obesity. $PPAR{\gamma}$ and leptin were repressed by the increased addition of U. pinnatifida ethanol extract. This indicates that U. pinnatifida was effective as an anti-obesity agent by repressing the differentiation of 3T3-L1 into adipocytes and inhibiting triglyceride formation in adipocytes.
Undaria pinnatifada has been used as a natural diet food with few calories and as a source of iodine. Even though U. pinnatifida has been regarded as a diet food, the mechanisms of its inhibitory effects on adipocyte differentiation and the accumulation of fat in adipocytes are poorly understood. In this study, the effect and mechanism of U. pinnatifida ethanol extract on 3T3-L1 differentiation into adipocytes were investigated. The effects of U. pinnatifida ethanol extract on cell viability and the anti-adipogenic effect were investigated via MTT assay, Oil red O staining, RT-PCR, and western blot. The U. pinnatifida ethanol extract did not show toxicity up to a concentration of 50 ${\mu}g/ml$. The addition of U. pinnatifida ethanol extract decreased triglyceride contents by 40% when 50 ${\mu}g/ml$ of U. pinnatifida ethanol extract was added during 3T3-L1 differentiation and adipocyte triglyceride formation. The transcription and expression of peroxisome proliferator-activated receptor ${\gamma}$ ($PPAR{\gamma}$), leptin, and hormone-sensitive lipase (HSL) as adipocyte-specific proteins were determined by RT-PCR and western blot. The overexpression of $PPAR{\gamma}$ could accelerate adipocyte differentiation. Also, leptin was secreted for triglyceride accumulation in the adipocytes and the increase of adipocyte cell size. Thus, $PPAR{\gamma}$ and leptin were used as indicators of obesity. $PPAR{\gamma}$ and leptin were repressed by the increased addition of U. pinnatifida ethanol extract. This indicates that U. pinnatifida was effective as an anti-obesity agent by repressing the differentiation of 3T3-L1 into adipocytes and inhibiting triglyceride formation in adipocytes.
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문제 정의
본 연구에서는 미역 에탄올 추출물의 항비만 효과를 3T3-L1 세포에서 지방세포로의 분화를 촉진시키는 PPARr, 지방세포에서 분비되는 호르몬인 leptin, HSL의 mRNA와 단백질 발현량을 분석하여, 미역 에탄올 추출물에 의한 3T3-L1의 분화 유도능 억제에 관한 mRNA 전사 및 단백질 발현에 관한 연구를 수행하였다.
제안 방법
Oil Red O solution을 제거하고 증류수로 4회 세척하여 완전히 건조하였다. 100% isopropyl alcohol을 사용하여 염색된 지방을 추출하였으며, ELISA reader를 이용하여 490 nm의 흡광도에서 지방함량을 분석하였다.
그 결과, 지방전구 세포인 3T3-L1 세포와 지방세포에서 생존율에 영향을 미치지 않는 50 μg/ml의 농도까지를 실험 조건으로 설정하였다.
단백질을 추출하기 위해 Radioimmunoprecipitation assay(RIPA) buffer [150 mM NaCl, 1.0% Triton X-100, 0.5% Sodium deoxycholate, 0.1% Sodium dodecyl sulfate (SDS), 50 mM Tris (pH 8.0)]를 지방세포에 첨가하였다. 4℃에서 30분간 반응시킨 후 14,240ｘ g에 20분간 상등액을 원심 분리하였다.
이렇게 분화된 세포는 lipid droplet 생성 및 세포의 크기 증가 등 형태학적인 특징과 더불어 특이적인 유전자의 발현을 유발함으로서 지방 세포의 특징을 지니게 된다. 따라서 미역의 에탄올 추출물이 PPARr, leptin과 HSL의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 western blot과 RT-PCR을 이용하여 mRNA 및 단백질 단계에서 확인하였다. Fig.
미역 에탄올 추출물 처리에 따른 3T3-L1 세포 및 성숙지방세포에서의 생존율을 알기 위하여 MTT assay를 실시하였다. Fig.
미역 에탄올 추출물은 분화 과정의 각 단계마다 분화배지에 0, 10, 20, 30, 40, 50 μg/ml의 농도로 첨가하였다.
미역 에탄올 추출물이 지방세포의 분화 및 triglyceride 축적에 미치는 영향을 확인하기 위하여 3T3-L1 세포를 성숙지방 세포로 유도하여 0~50 μg/ml의 농도로 미역의 에탄올 추출물을 첨가하였다.
kit (GeneAll, Seoul, Korea)를 사용하여 분리하였다. 분리된 RNA를 각각의 primer, DEPC water와 Takara (Dalian, Japan)의 One step SYBR PrimeScriptTM RT-PCR Kit를 넣고 Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad)을 이용하여 증폭하였다. RT-PCR에 사용된 Primer의 서열은 Table 1에 나타내었으며, β-actin 유전자는 internal control로 사용하였다.
분리된 상등액을 0.45 μm filter로 여과하여 감압 농축과정과 동결건조를 통해 미역 에탄올 추출물을 제조하였다.
미역 에탄올 추출물이 지방세포의 분화 및 triglyceride 축적에 미치는 영향을 확인하기 위하여 3T3-L1 세포를 성숙지방 세포로 유도하여 0~50 μg/ml의 농도로 미역의 에탄올 추출물을 첨가하였다. 분화 유도 8일째, 분화가 완료된 성숙지방세포에 Oil red O 염색을 하였으며, 염색된 lipid droplet을 isopropanol로 추출한 후 ELISA reader를 이용하여 triglyceride 함량을 분석하였다. Fig.
지방전구세포 분화 시에 형성된 지방의 함량은 Oil Red O staining을 이용하여 측정하였다. 미역 에탄올 추출물은 분화 과정의 각 단계마다 분화배지에 0, 10, 20, 30, 40, 50 μg/ml의 농도로 첨가하였다.
RT-PCR에 사용된 Primer의 서열은 Table 1에 나타내었으며, β-actin 유전자는 internal control로 사용하였다. 첫 번째 단계에서 반응 조건은 42℃, 5분, 95℃에서 10초간 반응 시키고, 두 번째 단계의 반응 조건은 95℃, 5초, 60℃에서 20초 간격으로 cycle을 35번 반복하여 수행하였다. 결과 분석법으로는 2-(∆∆CT) method를 이용하였으며[7], mRNA의 상대적 발현량은 control에 대한 sample의 상대적 유전자 발현 값으로 나타내었다.
대상 데이터
DMSO (Sigma Aldrich)를 100 μl 첨가하여 생성된 formazan을 녹였다.
본 실험에 사용된 3T3-L1 지방전구세포는 미국세포은행(American Type Culture Collection: ATCC, USA)에서 분양받아 사용하였다. 세포배양은 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)에 10% bovine serum (Gibco BRL)과 100 units/ml의 penicillin, 0.
본 실험에 사용된 미역은 ㈜기장물산에서 제공 받았으며, 건조된 미역은 Hammer mill을 이용하여 잘게 분쇄 하였다. 건조 미역 100 g당 에탄올 1 l를 첨가하여 70℃, 3시간 동안 추출하였다.
세포배양은 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)에 10% bovine serum (Gibco BRL)과 100 units/ml의 penicillin, 0.1 mg/ml의 streptomycin 및 0.25 μg/ml의 amphotericin B(Sigma Aldrich, St. Luis, MO, USA)을 첨가하여 37℃, 5% CO2조건에서 배양하였다.
이론/모형
3T3-L1과 지방세포에서 미역 에탄올 추출물의 세포독성은 MTT assay로 분석하였다[1]. 6 well plate에서 confluent 상태가 될 때까지 배양된 3T3-L1 지방전구세포에 미역 에탄올 추출물을 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100 μg/ml의 농도로 첨가하여 24시간 배양하였다.
Cells were incubated for 24 hr in cell culture medium with various concentrations of extract. Cell viability was determined by MTT assay. Values are expressed as percentage of the viability of control.
첫 번째 단계에서 반응 조건은 42℃, 5분, 95℃에서 10초간 반응 시키고, 두 번째 단계의 반응 조건은 95℃, 5초, 60℃에서 20초 간격으로 cycle을 35번 반복하여 수행하였다. 결과 분석법으로는 2-(∆∆CT) method를 이용하였으며[7], mRNA의 상대적 발현량은 control에 대한 sample의 상대적 유전자 발현 값으로 나타내었다.
4℃에서 30분간 반응시킨 후 14,240ｘ g에 20분간 상등액을 원심 분리하였다. 상등액의 총 단백질량은 Bicinchoninic acid (BCA) method에 따라 Bio-Rad protein assay (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 정량하였다. 동량의 단백질을 12% SDS – polyacrylamide gel에서 전기영동 하였으며, 전기 영동 후 gel 내의 단백질을 Nitrocellulose membrane (PALL, Washington, NY, USA)으로 100 V에서 1시간 동안 전사시켰다.
성능/효과
50 μg/ml의 미역 에탄올 추출물 농도에서 지방 축적이 약 40%로 감소되었으며, 미역 에탄올 추출물에 의한 triglyceride 축적 억제효과를 확인할 수 있었다.
Fig. 1에 나타난 바와 같이 지방전구 세포인 3T3-L1세포와 성숙지방세포에서 모두 50 μg/ml의 농도 까지는 세포의 생존율에 영향을 미치지 않았지만 60 μg/ml 이상의 농도부터는 생존율이 급격히 감소하였으며, 100 μg/ml에서는 약 40%의 생존율을 나타내었다.
본 연구에서는 미역 에탄올 추출물의 항 비만 효과를 유전자적 단계에서 PPARr, leptin과 HSL을 통해 3T3-L1의 분화 유도능 억제에 관한 mRNA 전사 및 단백질 발현에 관한 연구를 수행하였으며, 그 결과 미역 에탄올 추출물이 지방세포의 감소와 지방축적에 영향을 미쳐 결과적으로 지방세포의 수와 세포 내 triglyceride의 함량이 감소되는 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
비만이 야기하는 병의 종류는?
국내에서도 식습관 및 생활습관의 서구화로 인해 비만인구가 증가하고 있으며, 비만의 효과적인 치료 및 예방법에 대해 많은 연구가 수행되고 있다[13,15,16]. 비만은 섭취되는 열량이 소모되는 열량보다 많아 체내에 지방이 과도하게 축적되어, 제 2형 당뇨병, 심혈관계 질환, 각종 암 및 고지혈증과 같은 성인병의 발병원인으로 간주된다[9,14]. 비만은 지방전구세포의 분화 및 adipogenesis 과정에 의하여 지방세포의 세포 내 triglyceride 축적으로 발생되며, 이러한 기작을 조절하는 것이 비만 억제의 치료 방법으로 알려져 있다[9].
미역이란?
해조류는 다양한 생리활성 물질을 가진 자원으로 한국, 일본 및 중국과 같은 아시아 국가에서는 식품 및 민간요법으로 질병의 치료제로 사용되고 있다[8]. 우리나라 연안에서 많이 양식되고 있는 미역(Undaria pinnatifida)은 갈조류로써 천연카로티노이드계 색소와 같은 생리활성물질을 함유하고 있으며[5], 효과적인 식이조절제로서 알려져 있다. 미역 에탄올 추출물이 동물실험을 통해 지방조직의 증가를 억제시키는 효과가 알려져 있지만 항 비만 효과에 따른 유전자적 단계에서 연구가 미비한 실정이다.
미역의 에탄올 추출물이 지방세포 분화 조절인자들의 발현에 미치는 영향을 조사한 결과는?
Fig. 3(A)와 (B)에 나타난 바와 같이, 분화유도 과정에서 미역 에탄올 추출물을 처리한 경우 HSL의 발현은 mRNA와 단백질 수준에서 유의적인 차이가 없었다. 그러나 PPARγ와 leptin의 발현은 미역 에탄올 추출물의 농도가 증가함에 따라 감소하였다. 이와 같은 결과는 미역 에탄올 추출물 처리에 의해 PPARγ의 발현이 저해되며 이로 인해 지방세포분화, 지방축적 및 leptin의 발현이 저해되는 것으로 판단된다.
참고문헌 (16)
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