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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 3가지 품종의 현미에 함유된 γ-oryzanol 성분조성 및 함량을 조사하고, 이들이 나타내는 항산화 효과, 콜레스테롤 저하 효과 및 항균 효과를 탐구하여 비교하고자 하였으며, 나아가 우리나라 쌀 소비를 증진시키는데 도움이 되고자 하였다.
제안 방법
- γ-Oryzanol 추출물에 대한 1,1-dipheny l-2- picrylhydrazyl(이하 DPPH) radical 소거 활성을 측정하기 위해 Blois MS(1958)의 방법에 따라 다음과 같이 측정하였다. Ethanol을 이용하여 4가지 단계(1, 0.5, 0.2, 0.1)로 시료를 제조한 뒤, 시료 100 ㎕와 DPPH 용액 900 ㎕를 혼합 후 10초간 진탕해 37℃에서 30 분간 방치한 후 517 nm에서 흡광도를 UV spectrophotometer(DU 730, Beckman Coulter, USA)로 측정하였다. 이때 DPPH radical 소거활성은 시료첨가구와 무첨가구의 흡광도 차이를 비교하여 나타내었으며, 양성 대조군으로 buthylhydroxytoluene(이하 BHT)를 사용하였다.
- γ-Oryzanol의 HPLC 분석조건은 Table 1에 요약되어있다. methanol:acetonitrile:dichloromethane:acetic acid를 50:44:3:3의비로 혼합한 단일 용매를 이동상으로 사용하여 50분간 분석하였으며, 유속은 1.4 ㎖/min, 주입량은 20 ㎕, 검출기는 PDA(photodiode array detector)로 325 nm 파장에서 분석하였다.
- 고콜레스테롤 혈청 Sample 1(M/325 ㎎/100 ㎖), Sample 2(M/288 ㎎/100 ㎖), Sample 3(F/327 ㎎/100 ㎖)에 γ-oryzanol 추출물을 처리한 후 T-CHO 측정을 진행하였다.
- γ-Oryzanol 추출물을 ethanol에 용해시켜 시료를 제조한 다음, 농도별로 20 ㎕ 씩 paper disc에 분주한 뒤 5분 정도 건조하였다. 균이 충분히 배양되어 있는 페트리 접시에 4군데 영역을 지정하여 paper disc를 놓고 세균을 24시간 배양한 후 4종의 세균(E. coli, Salmanella, Bacillius, Staphylococcus)의 증식이 억제된 정도를 상대적으로 비교하여 항균 효과를 측정하였다.
- 2)로 여과시켰다. 남아있는 침전물에 추출용매 30 ㎖, 20 ㎖를 순차적으로 처리하여 위 방법을 2회 반복한 다음 수집된 최종 여과액을 질소 농축기로 농축시켰다. 질소 농축 후 남아있는 침전물에 ethanol 2 ㎖를 넣어 용해시킨 다음 syringe filter(PVDF, 0.
- 이후 40분 이내에 시약 blank를 대조한 후 파장 500 nm에서 흡광도를 측정하였다. 동일한 방법으로 표준물질의 흡광도를 측정한 후 검량선을 작성하고, 콜레스테롤의 총량을 계산하였다. 대조군은 혈청 20 ㎕와 ethanol 10 ㎕의 혼합물을 사용하였다.
- 1)로 시료를 제조한 뒤, 시료 100 ㎕와 DPPH 용액 900 ㎕를 혼합 후 10초간 진탕해 37℃에서 30 분간 방치한 후 517 nm에서 흡광도를 UV spectrophotometer(DU 730, Beckman Coulter, USA)로 측정하였다. 이때 DPPH radical 소거활성은 시료첨가구와 무첨가구의 흡광도 차이를 비교하여 나타내었으며, 양성 대조군으로 buthylhydroxytoluene(이하 BHT)를 사용하였다. 항산화 효과는 시료를 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 그래프로 나타내었다.
- 남아있는 침전물에 추출용매 30 ㎖, 20 ㎖를 순차적으로 처리하여 위 방법을 2회 반복한 다음 수집된 최종 여과액을 질소 농축기로 농축시켰다. 질소 농축 후 남아있는 침전물에 ethanol 2 ㎖를 넣어 용해시킨 다음 syringe filter(PVDF, 0.45 ㎛)로 여과하여 HPLC 분석에 사용하였다.
- 현미(추청벼, 흑진주벼, 신동진벼)에서 추출한 γ-oryzanol을 항산화 및 콜레스테롤 저하 효과 측정 방법과 마찬가지로 동일단계로 희석한 후, 농도별로 paper disc에 침지시킨 다음 세균이 자라고 있는 NA 배지 위에 놓고 24시간 후 관찰된 세균 생육 저해환(clear zone)의 크기를 상대적으로 비교하였다.
- 실험에 사용한 혈청 시료는 의정부 성모병원에서 고콜레스테롤(250～300 ㎎/100 ㎖) 환자의 혈청을 연구용으로 기증받았다. 혈청 출처와 콜레스테롤 수치는 각각 M/325, M/288, F/327(㎎/100 ㎖)(M: male, F: female)이며, 순서대로 혈청 1, 2, 3으로 표기하였고, 정상인의 혈청 콜레스테롤 수치는 130～250(㎎/100 ㎖)에 비해 콜레스테롤 수치가 높은 혈청을 사용하였다. 기타 시약으로 methanol, ethanol, acetonitrile, dichloromethane, acetic acid 등(J.
- 흑진주벼, 추청벼, 신동진벼의 현미상태에서 ethanol을 이용하여 γ-oryzanol 추출물을 제조한 다음, 이들의 조성 및 함량을 HPLC로 분석하고 생리활성을 측정하여 비교한 결과는 다음과 같다.
대상 데이터
- subtilis(KCTC-1021), Staphylococcus aureus subsp. aureus(KCTC-1928)를 생명자원센터에서 분양받아 사용하였다.
- 혈청 출처와 콜레스테롤 수치는 각각 M/325, M/288, F/327(㎎/100 ㎖)(M: male, F: female)이며, 순서대로 혈청 1, 2, 3으로 표기하였고, 정상인의 혈청 콜레스테롤 수치는 130～250(㎎/100 ㎖)에 비해 콜레스테롤 수치가 높은 혈청을 사용하였다. 기타 시약으로 methanol, ethanol, acetonitrile, dichloromethane, acetic acid 등(J. T. Baker, USA)이 사용되었으며, 항산화실험에서 대조군으로 BHT(Aldrich, USA)를 사용하였다.
- 동일한 방법으로 표준물질의 흡광도를 측정한 후 검량선을 작성하고, 콜레스테롤의 총량을 계산하였다. 대조군은 혈청 20 ㎕와 ethanol 10 ㎕의 혼합물을 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 벼 품종은 국내에서 생산된 추청벼(Chucheong), 흑진주벼(Heukjinju), 신동진벼(Sindongjin) 3종이며(이하 순서대로 C, H, S 표기), 농촌진흥청 국립농업과학원 농식품자원부 기능성식품과에서 2011년 6월에 분양받았다. 간이 제현기로 직접 왕겨를 벗겨 현미를 준비한 다음, 분쇄기(HR 2860, PHILIPS, China)를 이용하여 분말로 만들어 실험에 사용하였으며, 분쇄한 현미가루는 밀봉하여 －20℃ 냉동고에 보관하였다.
- 분석기기는 YMC AM303(4.6 ㎜×250 ㎜, 5 ㎛) column이 장착된 Alliance e2695 HPLC system(Waters Co. Milford, MA, USA)을 사용하였다.
- 실험에 사용한 혈청 시료는 의정부 성모병원에서 고콜레스테롤(250～300 ㎎/100 ㎖) 환자의 혈청을 연구용으로 기증받았다. 혈청 출처와 콜레스테롤 수치는 각각 M/325, M/288, F/327(㎎/100 ㎖)(M: male, F: female)이며, 순서대로 혈청 1, 2, 3으로 표기하였고, 정상인의 혈청 콜레스테롤 수치는 130～250(㎎/100 ㎖)에 비해 콜레스테롤 수치가 높은 혈청을 사용하였다.
- γ-Oryzanol 추출물의 콜레스테롤 저하 효과를 측정하기 위해 고콜레스테롤 혈청 20 ㎕와 γ-oryzanol 추출물 10 ㎕를 혼합하여 측정용 시료를 만들었다(Wilson 등 2007). 측정용 시약은 효소 시약 1병과 완충액(120 ㎖) 용해시켜 사용하였다. 혈청과 추출물의 혼합물에서 20 ㎕를 취해 분주하고, 측정용 시약 3.
- 항산화 효과 측정용 시약으로는 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)(WAKO, Japan)를 사용하였으며, 혈청 중 함유된 총콜레스테롤 성분을 측정하기 위해 V-Cholesterol(아산제약㈜, Korea)을 사용하였다. 항균 실험에 사용한 균주는 그람 음성균인 Escherichia coli(KCTC-1039), Salmonella enterica sub.
이론/모형
- γ-Oryzanol 추출물에 대한 1,1-dipheny l-2- picrylhydrazyl(이하 DPPH) radical 소거 활성을 측정하기 위해 Blois MS(1958)의 방법에 따라 다음과 같이 측정하였다.
- γ-Oryzanol 추출물의 항균 효과는 Disc agar diffusion 법(James & Sherman 1978)을 사용하여 측정하였다.
성능/효과
- γ-Oryzanol 총함량은 흑진주벼, 추청벼, 신동진벼의 순으로 나타났으며, 이들 γ-oryzanol 추출물에 대한 DPPH 라디칼 소거율, 콜레스테롤 저하 효과, 항균효과 역시 흑진주벼, 추청벼, 신동진벼 순으로 나타나 γ-oryzanol이 이들 활성에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 판단되었다.
- HPLC 분석 결과, 추청벼, 흑진주벼 및 신동진벼 현미로부터 Xu & Godber(1999)의 연구결과와 마찬가지로 γ-oryzanol의 10개 peak을 확인할 수 있었으며, 이들의 머무름 시간(retention time, RT)은 15분에서 30분 사이에 나타났다(Fig. 1).
- 또한 γ-oryzanol의 농도 순위와 유사하게 흑진주벼>추청벼>신동진벼의 순으로 항산화 효과가 높게 나타나 추출물에 함유되어 있는 γ-oryzanol이 항산화 효과에 많은 영향을 미치는 것을 알 수 있었다(Fig. 2).
- 역상 HPLC 분석법으로 γ-oryzanol 총함량을 확인한 결과, 추청벼, 흑진주벼, 신동진벼는 각각 1,038.6, 1,587.7, 472.3 ppm으로 나타났으며, 추청벼에는 24-methylenecycloartanyl ferulate의 비중이 cycloartenyl ferulate보다 큰 반면, 흑진주벼와 신동진벼에는 cycloartenyl ferulate의 비중이 24-methylencycloartanyl ferulate보다 큰 것으로 나타났다(Table 2).
- 흑진주벼, 추청벼, 신동진벼의 현미상태에서 ethanol을 이용하여 γ-oryzanol 추출물을 제조한 다음, 이들의 조성 및 함량을 HPLC로 분석하고 생리활성을 측정하여 비교한 결과는 다음과 같다. 인용문헌을 바탕으로 총 10종의 개별 성분을 분리 및 확인하였으며, 이 중 cycloartenyl ferulate, 24-methylenecycloartanyl ferulate, campesteryl ferulate, sitosteryl ferulate이 주요 성분으로 확인되었다. γ-Oryzanol 총함량은 흑진주벼, 추청벼, 신동진벼의 순으로 나타났으며, 이들 γ-oryzanol 추출물에 대한 DPPH 라디칼 소거율, 콜레스테롤 저하 효과, 항균효과 역시 흑진주벼, 추청벼, 신동진벼 순으로 나타나 γ-oryzanol이 이들 활성에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 판단되었다.
- 추청벼 γ-oryzanol 추출물의 농도 1,000 ppm과 동일하게 제조한 합성항산화제 BHT에 대하여 라디칼 소거능을 비교한 결과, 추청벼가 대조군인 BHT에 비해 더 높은 활성을 나타내어 현미 중 γ-oryzanol이 항산화 활성을 나타내는 주요 물질임을 추정할 수 있었다.
- 효소 반응 후측정된 흡광도를 이용하여 콜레스테롤 수치를 측정한 결과, 흑진주벼>추청벼>신동진벼>대조군(에탄올)의 순서로 콜레스테롤 수치가 감소하였다(Table 3).
후속연구
- 앞으로 γ-oryzanol이 고지혈증 및 심혈관계 질환 치료를 위한 의약품 원료로 사용될 수 있음을 밝히기 위해서는 생체 내(in vivo) 실험이 추가적으로 수행되어야 할 것이다.
- 이 실험을 통해 γ-oryzanol이 합성 항산화제를 대체할 수 있을 뿐만 아니라, 인체에 무해한 식품 보존료, 화장품 제조 등에 활용될 수 있을 것으로 기대되었다.
- 특히 항산화 효과에 있어 합성항산화제와 비교하였을 때 전반 적으로 매우 높게 나타나, 이러한 결과들을 바탕으로 현미에 함유된 γ-oryzanol이 식품, 제약, 의료 분야 등 다방면에서 활용될 수 있을 것으로 기대한다.
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