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문제 정의
- 본 연구는 거머리말속 중 왕거머리말의 항암활성효과를 알아보기 위해 인체 암세포주를 이용하여 암세포에 미치는 세포독성을 측정하여, 앞으로 항암제 개발의 새로운 원천으로의 활용 가능성을 탐색하고자 하였다. 이를 위해 인체 암세포인 AGS (위암세포), HT-29 (결장암세포), MCF-7 (유방암세포), HT-1080 (섬유육종암세포)을 이용하여 왕거머리말이 각종 암세포 증식에 미치는 영향을 알아보았다.
제안 방법
- 본 실험에 사용한 암세포주인 AGS 인체 위암세포 (AGS human gastric adenocarcinoma cell)와 HT-29 인체 결장암세포 (HT-29 human colon cancer cell), MCF-7 인체 유방암세포 (MCF-7 human breast cancer cell), HT-1080 인체 섬유육종세포 (HT-1080 human fibrosarcoma cell)는 한국 세포주 은행 (서울의대)으로부터 분양받아 배양하면서 실험에 사용하였다. AGS와 HT-29 암세포는 RPMI 1640 배지를 사용하였고, MCF-7과 HT-1080 암세포는 DMEM 배지를 사용하였으며, 각 배지에는 100 units/mL의 penicillin-streptomycin과 10%의 FBS를 첨가하였다. 실험에 사용된 암세포는 37℃, 5% CO2 incubator (Forma Scientific, Japan)에서 배양하였으며, 배양된 각각의 암세포는 일주일에 2-3회 refeeding하고 6-7일 만에 PBS로 세척한 후 0.
- 따라서 acetone/methylene chloride (A + M)와 methanol (MeOH) 추출물들을 혼합하여 극성에 따라 H2O, n-BuOH, 85% aq. MeOH, n-hexane 용매 분획물을 얻었으며 각각의 분획물을 이용하여 인체 암세포의 성장에 미치는 영향을 관찰하였다.
- 24시간 배양 후 시료가 첨가된 배지를 제거한 뒤 5 mg/mL의 농도로 제조한 MTT 용액 100 μL를 첨가하여 동일한 배양 조건에서 4시간 동안 더 배양하였다. 생성된 formazan결정은 DMSO로 충분히 녹여낸 후 ELISA reader (Bio-Tek instruments, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하여 억제율 (%)을 구하였다.
- 추출 후 남은 잔사에 methanol (MeOH)을 사용하여 위와 동일한 과정을 반복하여 추출액을 얻었다. 얻어진 추출액은 40℃ 수욕 상에서 회전 진공증발기 (EYELA JAPAN, N-N series)를 이용하여 농축하여 두 가지 조추출물을 얻었다 (A + M 추출물 : 15.12 g, methanol 추출물 : 229.33 g). 두 조추출물을 합한 후에 용매극성에 따라 순차적으로 분획하고 각 분획층을 감압농축한 후 건조하여 사용하였다.
- 왕거머리말로부터 암세포를 억제하는 효과가 있는 생리활성물질을 탐색하기 위해 조추출물을 200, 100, 50, 10, 5, 1 μg/mL의 농도로 희석한 후 암세포 AGS, HT-29, MCF-7, HT-1080에 처리하여 왕거머리말 조추출물이 암세포의 증식 억제에 미치는 효과를 관찰하였다.
- 응달에 건조한 왕거머리말을 -25℃의 냉동고에 보관하였다가 해빙한 후, methylene chloride (CH2Cl2)와 acetone을 1：1로 혼합한 용매 (A + M)를 사용하여 24시간 추출한 후 여과하였으며, 이 과정을 2번 반복하였다. 추출 후 남은 잔사에 methanol (MeOH)을 사용하여 위와 동일한 과정을 반복하여 추출액을 얻었다.
- 본 연구는 거머리말속 중 왕거머리말의 항암활성효과를 알아보기 위해 인체 암세포주를 이용하여 암세포에 미치는 세포독성을 측정하여, 앞으로 항암제 개발의 새로운 원천으로의 활용 가능성을 탐색하고자 하였다. 이를 위해 인체 암세포인 AGS (위암세포), HT-29 (결장암세포), MCF-7 (유방암세포), HT-1080 (섬유육종암세포)을 이용하여 왕거머리말이 각종 암세포 증식에 미치는 영향을 알아보았다.
대상 데이터
- 거머리말과는 잎 정단부의 형태, 엽맥 및 섬유가닥 (fibrous strands)의 수, 열매의 종피 등에 근거하여 분류되며 [2,3], 한반도 연안에서는 왕거머리말 (Zostera asiatica), 애기거머리말 (Zostera japonica), 포기거머리말 (Zostera caespitosa), 수거머리말 (Zostera caulescens) 등이 자생하는 것으로 알려져 있으며 [4,5], 동해안과 남해안의 수심 3~10 m깊이의 모래바닥에서 자생한다. 그 중 본 연구에 사용한 왕거머리말은 강원도 장호, 추암, 용화항과 경상북도 마산리항, 경상남도 창원시 명동에 분포하는 것으로 알려져 있다 [2]. 거머리말속에 속하는 종에 대한 연구는 서식지에 따른 생태 및 형태적 특성에 대한 연구가 대부분이며 [6-13], 천연물화학적인 연구는 거의 이루어지지 않았다.
- 본 실험에 사용한 암세포주인 AGS 인체 위암세포 (AGS human gastric adenocarcinoma cell)와 HT-29 인체 결장암세포 (HT-29 human colon cancer cell), MCF-7 인체 유방암세포 (MCF-7 human breast cancer cell), HT-1080 인체 섬유육종세포 (HT-1080 human fibrosarcoma cell)는 한국 세포주 은행 (서울의대)으로부터 분양받아 배양하면서 실험에 사용하였다. AGS와 HT-29 암세포는 RPMI 1640 배지를 사용하였고, MCF-7과 HT-1080 암세포는 DMEM 배지를 사용하였으며, 각 배지에는 100 units/mL의 penicillin-streptomycin과 10%의 FBS를 첨가하였다.
- 세포배양을 위해 DMEM, RPMI 1640, Fetal bovine serum (FBS), 0.05% Trypsin-0.02% EDTA 그리고 100 units/mL Penicillin-Streptomycin과 phosphate buffered saline (PBS)는 GIBCO사 (USA)로부터 구입하였으며, 그외 연구에 사용된 용매 및 시약은 특급 또는 일급을 사용하였다.
- AGS와 HT-29 암세포는 RPMI 1640 배지를 사용하였고, MCF-7과 HT-1080 암세포는 DMEM 배지를 사용하였으며, 각 배지에는 100 units/mL의 penicillin-streptomycin과 10%의 FBS를 첨가하였다. 실험에 사용된 암세포는 37℃, 5% CO2 incubator (Forma Scientific, Japan)에서 배양하였으며, 배양된 각각의 암세포는 일주일에 2-3회 refeeding하고 6-7일 만에 PBS로 세척한 후 0.05% Trypsin - 0.02% EDTA로 부착된 세포를 분리하여 원심분리한 후 집적된 암세포에 배지를 넣고 피펫으로 암세포가 골고루 분산되도록 잘 혼합하여 75 mL cell culture flask에 10 mL씩 일정 수 분할하여 주입하고 계속 6-7일마다 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.
- 실험에 사용한 왕거머리말 (Zostera asiatica)은 2007년 7월 경상남도 창원시 진동면 다구리 해변에서 직접 채집하였으며 응달에서 건조한 후 추출하기 전까지 -25℃에서 냉동보관하였다.
데이터처리
- a-dMeans with the different letters are significantly different (p < 0.05) by Duncan’s multiple range test.
- a-fMeans with the different letters are significantly different (p < 0.05) by Duncan’s multiple range test.
- a-kMeans with the different letters are significantly different (p < 0.05) by Duncan’s multiple range test.
- a-fMeans with the different letters are significantly different (p < 0.05) by Duncan’s multiple range test.
- 대조군과 각 시료로부터 얻은 실험 결과들의 유의성을 검정하기 위하여 분산분석 (ANOVA)을 행한 후 p < 0.05 수준에서 Duncan’s multiple range test를 실시하였으며, 그 결과는 평균 (Mean) ± 표준편차 (Standard deviation, SD)로 표시하였다.
- 05 수준에서 Duncan’s multiple range test를 실시하였으며, 그 결과는 평균 (Mean) ± 표준편차 (Standard deviation, SD)로 표시하였다. 모든 통계 분석은 Statistic Analysis System (v8.2 SAS Institute Inc., NC, USA) 통계프로그램을 이용하여 처리하였다.
성능/효과
- A + M 추출물은 200, 100 μg/mL 농도로 처리한 인체 위암세포의 생존율은 대조군에 비해 각각 19, 24%로 높은 항암효과를 나타내었다.
- O 분획물에서는 82, 83, 83, 84, 91, 90%의 낮은 암세포 성장 억제율을 보였고, n-BuOH 분획물에서는 39, 43, 46, 56, 64, 78%의 생존율을, 85% aq. MeOH 분획물에서는 20, 28, 41, 45, 58, 69%의 생존율을, n-hexane 분획물에서는 14, 34, 69, 71, 80, 82%의 생존율을 보여 H2O 분획물을 제외한 3가지 분획물에서 농도 의존적으로 높은 암세포 증식 억제율을 보였다 (Fig. 3).
- 반면에 85% aq. MeOH 분획물에서는 20, 43, 78, 87, 90, 95%의 생존율을 보였고, n-hexane 분획물에서는 11, 53, 86, 90, 90, 96%의 생존율을 보여 농도 의존적으로 높은 암세포 증식 억제율을 보였다.
- MeOH 추출물은 200, 100 μg/mL 농도에서 52, 58%의 생존율을 보였으며, 이는 A + M 추출물 보다는 높지 않았지만 비교적 높은 생존율을 보였다.
- 이상의 결과로부터 암세포의 종류에 따라 각기 다른 암세포 증식 억제율을 보였지만, 왕거머리말의 높은 항암활성을 확인할 수 있었으며 특히 용매분획들중에 극성이 낮은 85% aq. MeOH과 n-hexane 분획물에서 공통적으로 높은 암세포 증식 억제율이 농도에 의존적으로 나타나, 이들 분획층에 항암물질의 존재 가능성을 확인할 수 있었다. 따라서 수중에서도 꽃을 피우는 해양 현화식물 중 하나인 왕거머리말이 기존 해조류와는 매우 다른 이차 대사물질을 함유할 가능성이 매우 높을 것으로 여겨지며, 집중적인 연구를 통해 새로운 항암물질의 발견이 기대된다.
- 결장암세포인 HT-29에서 A + M 추출물 200, 100 μg/mL 농도에서 21, 36%의 낮은 생존율이 관찰되었고, methanol 추출물은 동일농도에서 65, 78%의 생존율이 관찰되어 AGS 암세포에서와 같이 A + M 추출물에서 보다 더 뛰어난 암세포 증식 억제 효과를 보였다.
- 동일한 조건하에서 왕거머리말의 용매 분획물을 1, 5, 10, 50, 100 및 200 μg/mL의 농도로 MCF-7 인체 유방암 세포에 처리하고 세포독성을 확인한 결과 H2O 분획물에서는 102, 99, 114, 103, 111, 97%의 생존율을 보여 암세포 증식 억제 효과가 거의 없는 것으로 나타났다 (Fig. 4).
- 두 가지 조추출물 중에 비교적 극성이 낮은 A + M 추출물이 실험에 사용한 4가지 암세포에서 모두 높은 암세포 증식 억제 효과가 관찰된 것으로 보아, 비교적 극성이 낮은 여러 가지 생리활성 물질들이 인체 암세포 증식을 억제하는 것으로 여겨진다.
- 또다른 인체 암세포인 HT-29, MCF-7, HT-1080에도 동일한 농도의 시료를 처리한 결과, 모두 AGS 세포와 유사하게 농도 의존적으로 암세포 생존율이 감소함을 관찰할 수 있었다.
- 섬유육종암세포인 HT-1080에서의 A + M 추출물은 200, 100 μg/mL 농도에서 20, 44%의 낮은 생존율이 관찰된 것에 반해, MeOH 추출물은 동일농도에서 76, 89%의 높은 생존율이 관찰되어 낮은 암세포 증식 억제 효과를 보였다.
- 왕거머리말로부터 암세포를 억제하는 효과가 있는 생리활성물질을 탐색하기 위해 조추출물을 200, 100, 50, 10, 5, 1 μg/mL의 농도로 희석한 후 암세포 AGS, HT-29, MCF-7, HT-1080에 처리하여 왕거머리말 조추출물이 암세포의 증식 억제에 미치는 효과를 관찰하였다. 실험결과, 각 암세포에 처리한 시료의 농도가 증가할수록 암세포 증식율이 농도의존적으로 억제되는 경향을 보였다 (Fig. 1).
- 2와 같다. 실험결과는 대조군과 비교하여 H2O 분획물에서는 81, 80, 81, 92, 96, 95%의 생존율을 보였고, n-BuOH 분획물에서는 71, 75, 78, 92, 93, 100%의 생존율을 보여 암세포 증식 억제에 큰 효과를 보이지 못했다. 반면에 85% aq.
- 유방암세포인 MCF-7에서 A + M 추출물은 200, 100 μg/mL 농도에서 21, 29%, MeOH 추출물은 동일농도에서 12와 27%의 생존율을 보여 두 가지 추출물에서 모두 뛰어난 암세포 증식 억제 효과를 관찰할 수 있었다.
- 이상의 결과로부터 암세포의 종류에 따라 각기 다른 암세포 증식 억제율을 보였지만, 왕거머리말의 높은 항암활성을 확인할 수 있었으며 특히 용매분획들중에 극성이 낮은 85% aq. MeOH과 n-hexane 분획물에서 공통적으로 높은 암세포 증식 억제율이 농도에 의존적으로 나타나, 이들 분획층에 항암물질의 존재 가능성을 확인할 수 있었다.
- 인체 결장암세포인 HT-29에서도 동일한 농도의 시료를 처리하여 실험한 결과, H2O 분획물에서는 82, 83, 83, 84, 91, 90%의 낮은 암세포 성장 억제율을 보였고, n-BuOH 분획물에서는 39, 43, 46, 56, 64, 78%의 생존율을, 85% aq. MeOH 분획물에서는 20, 28, 41, 45, 58, 69%의 생존율을, n-hexane 분획물에서는 14, 34, 69, 71, 80, 82%의 생존율을 보여 H2O 분획물을 제외한 3가지 분획물에서 농도 의존적으로 높은 암세포 증식 억제율을 보였다 (Fig.
- 인체 섬유육종 암세포인 HT-1080에도 동일한 농도의 시료를 처리한 결과 (Fig. 5), H2O 분획물에서는 92, 103, 109, 101, 115, 105%의 생존율을 보여 MCF-7과 마찬가지로 암세포 증식 억제에 효과가 없는 것으로 나타났다. n-BuOH 분획물에서는 46, 57, 63, 83, 91, 98%의 생존율을 보였고, 85% aq.
- 인체 위암세포인 AGS에 시료를 처리한 결과, 암세포의 생존율은 농도 의존적으로 감소함을 보였다. A + M 추출물은 200, 100 μg/mL 농도로 처리한 인체 위암세포의 생존율은 대조군에 비해 각각 19, 24%로 높은 항암효과를 나타내었다.
후속연구
- MeOH과 n-hexane 분획물에서 공통적으로 높은 암세포 증식 억제율이 농도에 의존적으로 나타나, 이들 분획층에 항암물질의 존재 가능성을 확인할 수 있었다. 따라서 수중에서도 꽃을 피우는 해양 현화식물 중 하나인 왕거머리말이 기존 해조류와는 매우 다른 이차 대사물질을 함유할 가능성이 매우 높을 것으로 여겨지며, 집중적인 연구를 통해 새로운 항암물질의 발견이 기대된다.
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