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제안 방법
- ICP/MS는 기기의 최적 상태에서 연구하기 위해서 실험 전 Y 용액으로 최적조건을 구하고 10 ppb 셀레늄 표준 용액을 사용하여 셀레늄의 자연 동위원소 존재비에 맞는지를 확인한 뒤 실험을 진행하였다. 기존의 시료 운반기체에 Ar/O2 혼합 기체(Ar 80%, O2 20%)를 추가로 사용하여 탄소를 산화시켰다.
- 따라서 분리능을 높이기 위하여 2D 크로마토그라피등이 이용된다. Mcsheehy22는 SEY 시료를 trypsin으로 분해시켜 추출한 단백질과 펩티드들을 SEC를 이용하여 분리시키고 nano HPLC ESI-MS/MS로 구조를 확인하였다. 하지만 trypsin의 사용으로 단백질들이 일부 가수분해될 수 있다.
- ICP/MS는 기기의 최적 상태에서 연구하기 위해서 실험 전 Y 용액으로 최적조건을 구하고 10 ppb 셀레늄 표준 용액을 사용하여 셀레늄의 자연 동위원소 존재비에 맞는지를 확인한 뒤 실험을 진행하였다. 기존의 시료 운반기체에 Ar/O2 혼합 기체(Ar 80%, O2 20%)를 추가로 사용하여 탄소를 산화시켰다. Ar/O2의 양은 0.
- 팔중극자 반응셀(ORC; octopole reaction cell)이 장착되어 있는 ICP MS 7500ce (Agilent Technology, Tokyo, Japan)에 HPLC (Wufeng, Shanghai, China)를 이용하고 음이온 교환 컬럼인 PRP-X100 SAX (Hamilton, MA, USA)를 사용하여 이스트에 함유된 셀레노 단백질을 분리하였다. 또한, 분리된 단백질은 단백질 분해효소를 이용하여 가수분해시키고 C18 역상 컬럼 (Discovery, Supelco, PA, USA)으로 seleno-amino acid를 분석하였다.
- 본 연구에서는 전기영동법이나 SEC를 사용하지 않고 이스트에서 단백질만을 분리 추출한 뒤, 이들을 음이온 교환 크로마토그라피로 간단히 분리하고 이들 중에 셀레늄이 포함된 셀레노 단백질들을 찾아내었다. 즉, 단백질 분리시약인 Trizol®로서 단백질과 RNA를 분리하고 분리된 단백질만을 음이온 교환컬럼을 통하여 분리한 뒤 ICP/MS로 분석하는 것이다.
- 하지만 이스트에 흡착된 여러 셀레늄과 대사물질들 그리고 수용성 단백질만 추출이 되며, 그 효율이 높지 않기 때문에 일반적으로 사용할 수는 없지만 정성적인 정보는 제공할 수 있을 것이다. 우선 일차적으로 초음파를 사용한 추출물에 대하여 AE HPLC-ICP/MS를 적용하고 그 결과를 나타내었다(Fig. 1). 단백질은 25 분경에 한 개의 피크만 나타났으며 앞부분에서 일찍 나오는 피크들은 분자량이 작은 셀렌을 포함한 셀레늄 아미노산이나 대사물질로 추정된다.
- 전처리 과정에서 단백질만을 남기고 다른 물질들은 모두 제거하여 분광학적 방해를 최소화하였다. 추출된 단백질을 AE HPLC-ICP/MS를 사용하여 5개의 셀레노 단백질로 분리하고 검출하였다. 또한 각 단백질을 가수분해시키고 RP HPLC-ICP/MS로 분리 검출하여 각 단백질은 셀레늄을 포함한 단백질임을 재확인하였고 단백질에 대한 정보를 더 얻을 수 있었다.
- 추출된 단백질을 AE HPLC를 이용하여 5 개의 피크로 분리하였다. 분리된 셀레늄 단백질들을 효소를 이용하여 가수분해시켜 셀레노 아미노산으로 만든 뒤 C18 RP HPLC-ICP/MS를 이용하여 분리시켜 검출하고그 결과를 Fig.
- 팔중극자 반응셀(ORC; octopole reaction cell)이 장착되어 있는 ICP MS 7500ce (Agilent Technology, Tokyo, Japan)에 HPLC (Wufeng, Shanghai, China)를 이용하고 음이온 교환 컬럼인 PRP-X100 SAX (Hamilton, MA, USA)를 사용하여 이스트에 함유된 셀레노 단백질을 분리하였다. 또한, 분리된 단백질은 단백질 분해효소를 이용하여 가수분해시키고 C18 역상 컬럼 (Discovery, Supelco, PA, USA)으로 seleno-amino acid를 분석하였다.
대상 데이터
- SEY에서 단백질을 추출하기 위하여 사용한 Trizol® reagent, guanidine hydrochloride, sodium dodecyl sulfate(approx. 99%), N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine (99%)는 모두 Sigma-Aldrich에서 구입하여 사용하였고, 추출된 단백질을 가수분해 하기 위해 protease XIV(bacterial, from streptomyces griseus)을 사용하였다.
- SEY의 단백질 분리에 사용된 이동상은 ammonium acetate (95%)를 탈이온수에 묽혀 사용하였다. 단백질들을 가수분해시켜 얻은 아미노산을 역상 이온쌍 크로마토그라피로 분리할 때는 5% 메탄올 (pH 2.
- SEY의 단백질 분리에 사용된 이동상은 ammonium acetate (95%)를 탈이온수에 묽혀 사용하였다. 단백질들을 가수분해시켜 얻은 아미노산을 역상 이온쌍 크로마토그라피로 분리할 때는 5% 메탄올 (pH 2.5)을 사용하였고 이온쌍 시약은 0.05% nonafluorovaleric acid (TCI, Tokyo, Japan)를 사용하였다.
- 초기의 0~3 min은 A가 100%, 그리고 3~6 min은 기울기로 B가 0-100%, 그리고 마지막 6~20 min은 B를 100%로 하였을 때 가장 좋은 분리도를 보여 주었다. 단백질을 가수분해시킨 뒤에 얻은 아미노산의 분리에서는 역상 이온쌍 크로마토그라피를 사용하였는데 컬럼은 C18이었고 용리액은 5% MeOH, 이온쌍 시약은 0.05% NFVA (nonafluorovaleric acid)를 사용하였다. 용리액의 흐름 속도는 1.
- 본 연구에서는 Se-enriched yeast에서 효과적으로 단백질을 추출하기 위하여 Trizol® reagent를 사용하였다.
- 모든 용기와 기구는 산세척 후 탈이온수로 세척하여 사용하였다. 셀레늄 표준용액은 Sel-plex(2000 ppm, Alltech, USA)를 사용하였다. 별도로 기술되지 않은 시약들은 가능한 최고 순도의 분석급 또는 이와 동일한 순도의 제품을 사용하였다.
- 셀레늄 화학종 표준용액은 Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, USA)에서 구입한 sodium selenite (Se IV, 99%)와 sodium selenate (Se VI, 99.999%), DL-SeMet (selenomethionine), L-SeCys(selenocyetein), MeSeCys(methylselenocystein)을 탈이온수에 묽혀 사용하였다. SEY에서 단백질을 추출하기 위하여 사용한 Trizol® reagent, guanidine hydrochloride, sodium dodecyl sulfate(approx.
- 시약의 제조에 사용된 물(18.2 MΩ cm−1)은 Milli-Q System (Millepore Co., USA)에서 제조된 탈이온수를 사용하였다.
- 5 mL/min으로 하였다. 이동상은 25 mM ammonium acetate (A)와 250 mM ammonium (B)이며 완충용액으로 pH 5.5에 맞추어 사용하였다. 셀레노 단백질들은 다음의 기울기 용매법으로 추출되었는데 그 조건은 다음과 같다.
이론/모형
- 이 방법은 비록 추출효율이 10% 내외이지만 비교적 간단하므로 Trizol®방법과 비교하기 위하여 사용하였다.
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