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문제 정의
- 전술한 바와 같이 종이포장재용 다층판지는 전분을 다량 함유하고 있어 가용성 잔류물질 중 전분 보정을 통한 새로운 시험방법의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다. 이에 본 연구에서는 다층판지로부터 용출되는 전분의 함량을 분석하고자 물을 용매로 이용한 속슬렛 추출을 통해 전분 용출을 유도하여 자외선/가시광선 분광분석기(UV/Vis spectroscopy) 및 고속액체 크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)를 이용한 분석법을 접목하고자 하였으며, 또한 전분으로 인한 수용성 잔류물질 및 기타 환경 호르몬물질 분석 시 발생할 수 있는 오차를 최소화하고 정확한 전분 정량법을 구축하기 위한 기초 연구를 실시하였다.
제안 방법
- α-아밀라아제는 1 M phosphate buffer solution 10 ml에 0.2%(w/v)으로 농도를 조절하였으며 최적 투입농도와 온도조건을 탐색하기 위해 호화된 산화전분 용액 10 ml에 α-아밀라아제의 첨가 농도를 1∼5 g/L로 조절하고 온도를 40℃∼70℃로 조절 하여 반응시켰다.
- 다층판지의 표면층에서 약 590 nm의 파장에서 흡광도를 나타내는 산화전분이 존재한다는 연구 보고4)에 따라 산화전분 용액을 α-아밀라아제로 효소가수분해 시키기 위해 산화전분과 효소의 최적 반응조건을 탐색하였다. 0.1 M Phosphate buffer solution 제조를 위해 제일인산칼륨(KH2PO4, Potassium phosphate monobasic, pH 4.5)과 제이인산칼륨(K2HPO4, Potassium phosphate dibasic, pH 8.5)을 사용하여, 혼합 후 pH가 6, 7, 8이 되도록 제조하였다. 산화전분은 오토클레이브(autoclave)에서 121℃의 조건으로 15분간 액화시켰으며, α-아밀라아제 첨가 후 진탕 배양기 (shaking incubator)에서 말토오스(maltose), 말토트리오스(maltotriose), 글루코오스(glucose)로 가수분해14)를 실시하였다.
- 16) 각각의 양성전분과 산화전분은 요오드와의 비색 반응을 통해 청남색으로 발색되어 흡 광도 값에 대한 Beer's 법칙을 근거하여 추세선을 작성하고 기울기에 대한 검량식을 얻었다.
- 식품의약품안전처 고시 제2010-11호에서는 종이포장재에서 용출되는 증발잔류물 시험법을 제시하고 그 함량을 30 mg/kg 이하로 규제하였으나, 2011년 종이포장재에 대한 용출시험 규격의 합리적 개선의 일환으로 삭제하였다. 다만 종이컵 등 가공지제 중 식품과 직접 접촉되는 면이 합성수지제로 도장된 경우에는 도장된 합성수지제의 용출규격을 적용하도록 하였다.6) 상기 언급된 식품의약품안전처 제2010-11호에 고시된 증발잔류물 시험 법으로 다층판지로 부터 가용성 잔류물질 함량 분석을 실시할 경우 제지공정에서 첨가된 전분이 최종제품 중에 함유되어 다양한 성상의 전분 용출로 인해 총 증발 잔류물 함량의 오류를 발생시킬 가능성이 높아지게 된다.
- 이때 용출된 용액내의 전분과 요오드의 반응온도를 조절하여 최적 온도조건을 탐색하였다. 다층판지의 수용성 잔류 물질 내 전분의 흡광도를 파장에 따라 검량식에 대입하여 다층판지의 수용성 용출물질에 잔존하는 산화전분의 함량을 분석4)하였다. 따라서 최종적으로 전분의 α-아밀라아제 가수분해에 의한 당정량 분석을 위해 HPLC(Alltech, Prevail Carbohydrate Column)의 ELSD 검출을 하였다.
- 또한 전분 이외의 물질로 기인한 전분의 발색저하를 방지하기 위해 2100 rpm에서 30분간 원심분리를 실시한 후 상등액을 취해 흡광도를 분석하였다. 다층판지의 수용성 잔류물질에 용해된 상태로 존재하는 이물질의 발색에 의한 흡광도 증가를 고려하여 요오드를 첨가 하지 않은 다층판지의 수용성 잔류물질 흡광도를 구하여 보정하였다. 이때 용출된 용액내의 전분과 요오드의 반응온도를 조절하여 최적 온도조건을 탐색하였다.
- 다층판지의 표면층에서 약 590 nm의 파장에서 흡광도를 나타내는 산화전분이 존재한다는 연구 보고4)에 따라 산화전분 용액을 α-아밀라아제로 효소가수분해 시키기 위해 산화전분과 효소의 최적 반응조건을 탐색하였다.
- 이에 따라 다층판지로부터 용출된 수용성 잔류물질 내에 잔존하는 전분은 다수의 산화전분이 포함된 것을 확인할 수 있었다. 따라서 HPLC를 이용하여 전분의 보다 정확한 당 정량분석을 위해 산화전분을 토대로 효소가수분해 최적조건을 탐색하였다.
- 할 수 있다. 따라서 다층판지의 용출 후 용매에 잔존하는 전분을 정량하기 위해 양성전분과 산화전분의흡광도와 고유의 파장범위를 탐색하였다. 파우더 형태의 양성전분과 산화전분을 90℃에서 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm, 200 ppm, 250 ppm으로 농도를 조절하여 30분간 호화하였다.
- 기존에 적용되었던 종이포장재용 증발잔류물 분석 방법(식품의약품안전처 고시 제 2010-11호)에 대한 오류 가능성의 확인에 따라 이를 개선시킬 수 있는 방안이 요구되고 있다. 따라서 본 연구에서는 UV/Vis 분광 분석기 및 HPLC를 이용하여 종이 포장재용 다층판지에서 용출되는 수용성 잔류물질로부터 전분 함량 보정을 통한 정량 분석을 실시하였다. 실험 결과, UV/Vis 분광분석기를 이용하여 요오드와 α-아밀라아제 반응 및 전분 가수분해에 따른 흡광도 분석을 통해 다층판지로부터 용출한 수용성 잔류물질 중에 산화전분이 다량 존재함을 확인하였고, 산화전분을 효소 가수분해시켜 보정함으로써 잔류물 함량이 감소되는 것을 확인하였다.
- 따라서 최종적으로 전분의 α-아밀라아제 가수분해에 의한 당정량 분석을 위해 HPLC(Alltech, Prevail Carbohydrate Column)의 ELSD 검출을 하였다.
- 또한 전분 이외의 물질로 기인한 전분의 발색저하를 방지하기 위해 2100 rpm에서 30분간 원심분리를 실시한 후 상등액을 취해 흡광도를 분석하였다. 다층판지의 수용성 잔류물질에 용해된 상태로 존재하는 이물질의 발색에 의한 흡광도 증가를 고려하여 요오드를 첨가 하지 않은 다층판지의 수용성 잔류물질 흡광도를 구하여 보정하였다.
- 산화전분은 오토클레이브(autoclave)에서 121℃의 조건으로 15분간 액화시켰으며, α-아밀라아제 첨가 후 진탕 배양기 (shaking incubator)에서 말토오스(maltose), 말토트리오스(maltotriose), 글루코오스(glucose)로 가수분해14)를 실시하였다.
- 8은 효소의 가수분해 반응온도에 따른 흡광도를 나타낸 결과이다. 산화전분의 가수분해 시 온도조건에 의한 영향을 탐색하기 위하여 40℃, 50℃, 60℃, 70℃로 설정하여 가수분해 반응을 실시하였다. 효소가수분해 온도가 높을수록 흡광도는 저하되었으나, 590 nm 파장에서 70℃ 조건의 흡광도는 40℃와 50℃조건의 흡광도와 유사한 결과를 나타냈다.
- 양성전분과 산화전분을 각각 50∼250 ppm 농도로 조절하여 호화된 전분용액 10 mL에 0.1 N 트리요오드화물 0.1 mL와 반응시켜 UV/Vis 분광분석기를 이용하여 최대 흡광도를 분석하였다.
- 다층판지의 수용성 잔류물질에 용해된 상태로 존재하는 이물질의 발색에 의한 흡광도 증가를 고려하여 요오드를 첨가 하지 않은 다층판지의 수용성 잔류물질 흡광도를 구하여 보정하였다. 이때 용출된 용액내의 전분과 요오드의 반응온도를 조절하여 최적 온도조건을 탐색하였다. 다층판지의 수용성 잔류 물질 내 전분의 흡광도를 파장에 따라 검량식에 대입하여 다층판지의 수용성 용출물질에 잔존하는 산화전분의 함량을 분석4)하였다.
- 종이 포장재의 수용성 잔류물질 함량은 식품의약품안전처에 고시된 ‘기구 및 용기·포장의 기준 및 규격’에 의거하여 물을 용매로 25℃ 항온수조에서 10 분간 용 출시킨 후 증발 건조시켜 그 함량을 측정하였으며, 다음 식을 이용하여 증발잔류물 함량을 계산하였다.
- 종이포장재용 다층판지 2 g을 물을 용매로 속슬렛 추출 기를 사용하여 용출실험을 실시한 후 α-아밀라아제를 이용한 효소 가수분해를 실시하였다.
- 종이포장재용 다층판지로 부터 용출된 수용성 잔류 물질 내 산화전분의 최적 가수분해 조건을 탐색하기 위해 효소의 pH, 첨가량, 반응온도 조건을 설정하여 반응을 실시하였다. Fig.
- 따라서 다층판지의 용출 후 용매에 잔존하는 전분을 정량하기 위해 양성전분과 산화전분의흡광도와 고유의 파장범위를 탐색하였다. 파우더 형태의 양성전분과 산화전분을 90℃에서 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm, 200 ppm, 250 ppm으로 농도를 조절하여 30분간 호화하였다. 호화된 양성전분과 산화전분 10 mL에 0.
- 호화된 양성전분과 산화전분 10 mL에 0.1 N 트리요오드화물 0.1 mL을 첨가하여 자외선/가시광선 분광분석기(Optizen POP, Mecasys)를 이용하여 400∼800 nm의 가시광선 흡광도를 측정하였다.
- 종이포장재용 다층판지 2 g을 물을 용매로 속슬렛 추출 기를 사용하여 용출실험을 실시한 후 α-아밀라아제를 이용한 효소 가수분해를 실시하였다. 효소 가수분해후 다층판지의 수용성 잔류물질 용액내의 전분 농도를요오드법15)으로 UV/Vis 분광분석기를 이용하여 정량하였으며, 기존의 다층판지의 수용성 잔류물질 함량측정법에 의해 얻은 결과를 보정하였다.
대상 데이터
- 또한 효소는 α-아밀로오스 (Junsei chemical, Japan)를 사용하였으며, 분광분석법을 이용한 비색정량 시 양성전분과 산화전분을 청남색으로 발색시키기 위하여 0.1 N 트리요오드화물 (triiodide)를 제조하여 사용하였다.
- 본 연구에서 사용된 공시 판지 시료는 A사의 다층판지를 사용하였으며, 전분은 정량분석용 검량선 작성을 위해 B 사로부터 파우더 형태의 양성전분과 산화전분을 분양받아 사용하였다. 또한 효소는 α-아밀로오스 (Junsei chemical, Japan)를 사용하였으며, 분광분석법을 이용한 비색정량 시 양성전분과 산화전분을 청남색으로 발색시키기 위하여 0.
이론/모형
- 분광분석법을 이용한 전분 함량의 분석은 빛을 이용하여 화합물의 농도를 측정하는 방법으로서 가시광선 흡수를 기초로 한 비색법으로서 Beer's 법칙으로 해석할 수 있다.
성능/효과
- 온도 변화와 관계없이 산화전분은 모두 약 590 nm에서 최대 흡광도를 나타냈으며, 아밀로오스와 요오드의 반응온도가 낮아질 수록 흡광도는 증가하였다. 5℃ 조건에서 효소의 반응속도가 증가하는 것으로 나타났으며, 이에 아밀로오스와 요오드의 비색 정량을 위한 최대 흡광도는 5℃ 조건을 가장 적합한 온도 조건으로 설정할 수 있었다.
- Fig. 6의 결과에서와 같이 모든 pH 조건에서 산화전분은 가수분해가 되었으며, pH 7의 조건에서 가장 낮은 흡광도를 나타냈으며, 이는 α-아밀라아제가 pH 7에서 가장 우수한 가수분해 능력을 나타내는 것으로 판단할 수 있다.
- 5는 종이포장재용 다층판지로부터 용출한 수용성 잔류물질 내에 잔존하는 전분의 분광분석법에 의한 흡광도 결과이다. 그림에서와 같이 흡광도 변곡 결과는 산화전분을 나타내는 590 nm의 흡광도를 보였으며, 최대 흡광도 0.511를 나타내 검량식에 대입한 결과 전분 함량은 71.32 ppm으로 계산되었다. 이에 따라 다층판지로부터 용출된 수용성 잔류물질 내에 잔존하는 전분은 다수의 산화전분이 포함된 것을 확인할 수 있었다.
- 따라서 α-아밀라아제 첨가량이 1 g/L일 때 가수분해 효과가 가장 우수함을 확인하였다.
- 이는 전분의 아밀로오스와 요오드 비색반응을 통한 간접적인 전분 정량분석에 따른 분광분석법과 달리 HPLC를 이용한 보다 정밀한 당 분석 결과에서는 α-아밀라아제가 아밀로오스와 아밀로펙틴의 가수분해를 충분히 이루지 못한 것으로 판단되며, 낮은 전분 함량을 나타낸 것으로 사료된다. 따라서 HPLC를 이용한 전분 내의 정밀한 당 정량 분석을 위해서는 아밀로오스와 아밀로펙틴 모두 글루코오스만으로 가수분해시켜 글루코오스의 높은 당화 수율을 기대할 수 있는 아밀로글루코시드가 수분해 효소를 적용하는 것이 타당하다고 판단된다. 이에 종이포장재용 다층판지로부터 용출된 전분 함량보정을 통한 수용성 잔류물질의 보다 정확한 정량분석이 가능할 것으로 사료된다.
- 또한 α-아밀라아제로 산화전분을 구성하는 아밀로오스와 아밀로펙틴의 α-1,4-글리코시드 결합을 가수분해 시켜 HPLC를 이용하여 전분 함량을 보정함으로서 수용성 잔류물질의 함량이 낮아짐을 확인할 수 있었다.
- 10은 다층판지로부터 용출된 수용성 잔류물질 내의 산화전분 함량 계산에 따른 보정된 수용성 잔류물질 정량분석 결과이다. 속슬렛 추출기를 이용하여 다층판지로부터 용출된 수용성 잔류물질은 159.2 ppm 으로 나타났으며, 용출된 용액의 아밀로오스-요오드의 비색 반응에 의한 분광분석법을 이용한 수용성 잔류 물질 내의 전분 함량은 71.32 ppm 으로 나타났다. Fig.
- 실험 결과, UV/Vis 분광분석기를 이용하여 요오드와 α-아밀라아제 반응 및 전분 가수분해에 따른 흡광도 분석을 통해 다층판지로부터 용출한 수용성 잔류물질 중에 산화전분이 다량 존재함을 확인하였고, 산화전분을 효소 가수분해시켜 보정함으로써 잔류물 함량이 감소되는 것을 확인하였다.
- 9는 고온, 상온, 저온의 온도조건 설정에 따른 산화전분 50 ppm에 존재하는 아밀로오스와 요오드를 반응시켜 얻은 흡광도 결과이다. 온도 변화와 관계없이 산화전분은 모두 약 590 nm에서 최대 흡광도를 나타냈으며, 아밀로오스와 요오드의 반응온도가 낮아질 수록 흡광도는 증가하였다. 5℃ 조건에서 효소의 반응속도가 증가하는 것으로 나타났으며, 이에 아밀로오스와 요오드의 비색 정량을 위한 최대 흡광도는 5℃ 조건을 가장 적합한 온도 조건으로 설정할 수 있었다.
- 13 및 14는 다층판지로부터 용출된 수용성 잔류 물질 내 산화전분의 함량을 HPLC 분석법을 이용하여 나타낸 결과이다. 크로마토그램 분석 결과에서 다층판지로부터 용출된 잔류물질 내 산화전분의 가수분해 된 당의 총 함량은 52.5 ppm을 나타냈다. 단순히 아밀로오스와 요오드의 비색반응에 의한 흡광도로 정량을 분석하는 분광분석법과 비교했을 때 71.
- 7은 α-아밀라아제의 첨가량에 따른 산화전분가수분해 후 흡광도 결과이다. 효소의 첨가량이 증가할수록 산화전분 가수분해 후 흡광도가 증가하여 산화 전분에 대한 가수분해 효과가 낮아지는 것으로 나타났다. 따라서 α-아밀라아제 첨가량이 1 g/L일 때 가수분해 효과가 가장 우수함을 확인하였다.
후속연구
- 따라서 본 연구에서도 α-아밀라아제에 의한 산화전분이 완전히 가수분해 되지 않은 것으로 판단되어 HPLC를 이용하여 수용성 잔류물질에 잔존하는 산화 전분의 당 정량 분석을 위해 아밀로글루코시드가수분 해효소(amylo glucosidase)를 이용한 아밀로오스와 아밀로펙틴의 α-1,4-글리코시드 결합과 α-1,6-글리코시드 결합을 D-글로코오스 (D-glucose) 단량체로 가수분해할 수 있는 시험방법이 적용되어야 할 것이다.
- 이러한 보고와 마찬가지로 α-아밀라아제를 이용하여 전분 내의 아밀로오스를 당으로 분해시키는 과정으로서 다층판지로부터 용출된 수용성 잔류물질을 효소 처리 한 후 HPLC를 이용하여 산화전분의 당 정량 분석에 적용할 수 있을 것으로 판단한다.
- 따라서 HPLC를 이용한 전분 내의 정밀한 당 정량 분석을 위해서는 아밀로오스와 아밀로펙틴 모두 글루코오스만으로 가수분해시켜 글루코오스의 높은 당화 수율을 기대할 수 있는 아밀로글루코시드가 수분해 효소를 적용하는 것이 타당하다고 판단된다. 이에 종이포장재용 다층판지로부터 용출된 전분 함량보정을 통한 수용성 잔류물질의 보다 정확한 정량분석이 가능할 것으로 사료된다.
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