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문제 정의
- 본 연구는 난용성 인산염을 가용화시킬 수 있는 안전하고 효율적인 환경친화형 토양개량 미생물제를 개발하기 위한 기초연구로, 예로부터 식품으로 섭취하여 인체에 안전하며 고유의 미생물이 서식할 가능성이 높은 우리나라 전통 발효 식품재료에서 분리한 효모로부터 인산 가용화능을 지닌 균주를 선발하여 생리적 특성과 인산 가용화 효과를 확인하였다.
제안 방법
- 생육 온도는 96 well micro plate를 이용하여 액체배양으로 실시하였다. 100 uL 의 YM broth에 각 균주를 103/mL의 농도로 접종하고 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45℃의 항온기에 정치배양하면서 8시간 간격으로 균주의 생육정도를 측정하였다. 생육 측정은 Plate Reader (Molecular Devices Spectra Max 340)를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- rDNA PCR 증폭을 위한 genomic DNA는 Sambrook과 Russell(2001)의 방법을 변형하여 분리하였다. Genomic DNA의 분리를 위한 효모균은 Yeast Mold (YM) agar 배지에 3일간 배양한 균체를 멸균된 접종 loop로 긁어 1.5 mL의 소형 원심관에 넣은 후 멸균수로 현탁하여 12,000 rpm으로 3분간 원심 분리하여 균체만 모았다. 집균된 균체는 Triton/SDS 용액 0.
- 5 unit가 되도록 조제한 반응액을 94℃에서 5분간 template DNA를 denature 시킨 후 denature 94℃, 1분, annealing 55℃, 1분, extension 72℃, 1분의 조건으로 35 cycle 증폭하였고 최종적으로 72℃에서 10분간 extension 시켰다. PCR 증폭 여부는 1.2%의 agarose gel에 전기영동하여 확인하고 증폭된 PCR 산물은 PCR purification kit (Solgent co.)로 정제하여 염기서열 분석에 사용하였다.
- 5%의 tricalcium phosphate가 포함된 100 mL의 Pikovskaya's 액체배지에서 28, 150 rpm의 조건으로 진탕배양하면서 1, 2, 3, 5, 7, 9, 11, 13일 간격으로 배양액을 10 mL씩 취하여 pH와 유리인 산의 양을 측정하였다. pH는 휴대용 pH meter (Horiba D54)를 이용하여 측정하였으며, 유리인산의 양을 측정하기 위하여 각 배양액 2 mL을 12,000 rpm으로 10분간 원심분리하고 상청액을 0.45 um의 일회용 멸균 필터(Pall Corporation)로 여과하여 균체와 불용성 잔류물을 제거하였다. 배양액 중의 유리인산 농도는 Phosphate Colorimetric Assay Kit (BioVision Incorporated)를 이용하여 반응시키고 Plate Reader를 이용하여 650 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 얻어진 각 시료의 흡광도를 인산 표준용액으로 작성한 standard curve와 비교하여 유리 인산의 농도를 계산 하였다.
- 생육 측정은 Plate Reader (Molecular Devices Spectra Max 340)를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하였다. pH별 생육 측정은 Gomori(1955)의 완충액으로 pH 2~10으로 조정한 YM broth를 사용하였고, NaCl 내성 실험은 NaCl을 최종 농도 5, 10, 15, 20%가 되도록 첨가한 YM broth에 각 균주를 접종한 후 Bioscreen C (Labsystem Oy, Finland)를 이용하여 28℃에서 3일간 배양하여 균주의 생육 정도를 측정하였다. 생육 정도는 각 처리별로 3 반복으로 수행하여 얻은 흡광도의 평균값으로 하였다.
- 효모의 동정은 ribosomal DNA 염기서열 분석으로 수행하였다. rDNA PCR 증폭을 위한 genomic DNA는 Sambrook과 Russell(2001)의 방법을 변형하여 분리하였다. Genomic DNA의 분리를 위한 효모균은 Yeast Mold (YM) agar 배지에 3일간 배양한 균체를 멸균된 접종 loop로 긁어 1.
- 접종한 효모의 농도는 serial dilution법으로 희석한 희석액을 YM 배지에 도말하여 생균수를 계수하여 환산하였다. 균주를 혼합한 상토는 28℃에서 8주간 보관하면서 1주일 간격으로 생균수를 조사하였다. 생균수의 조사는 상토 1g을 취하여 serial dilution 법으로 104 배까지 희석하여 YM 고체 배지에 도말하여 28℃에 2일간 배양 후생장된 균체를 계수하여 상토 1 g 당 생균수를 조사하였다.
- 45 um의 일회용 멸균 필터(Pall Corporation)로 여과하여 균체와 불용성 잔류물을 제거하였다. 배양액 중의 유리인산 농도는 Phosphate Colorimetric Assay Kit (BioVision Incorporated)를 이용하여 반응시키고 Plate Reader를 이용하여 650 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 얻어진 각 시료의 흡광도를 인산 표준용액으로 작성한 standard curve와 비교하여 유리 인산의 농도를 계산 하였다. 유리 인산량 환산에 사용한 인산 표준용액은 토양 화학분석법(농촌진흥청)에 준하여 KH2PO4으로 50 mg P/L저장액을 조제하고 농도별로 희석하여 사용하였다.
- 인산가용화 미생물은 토양에 존재하는 불용성 인산을 식물체가 이용할 수 있도록 가용화하는 역할을 하므로 토양에 주로 적용하게 된다. 본 연구에서 선발한 인산 가용화 효모는 식품에서 유래한 것이므로 토양 내에서의 생존 여부를 확인하기 위하여 토양에 균 배양액을 혼합한 후 8주 동안 보관하면서 생균의 밀도를 조사하였다. 1.
- 균주를 혼합한 상토는 28℃에서 8주간 보관하면서 1주일 간격으로 생균수를 조사하였다. 생균수의 조사는 상토 1g을 취하여 serial dilution 법으로 104 배까지 희석하여 YM 고체 배지에 도말하여 28℃에 2일간 배양 후생장된 균체를 계수하여 상토 1 g 당 생균수를 조사하였다. 계수는 3 반복으로 실시한 평균값을 Log 값으로 표시하였다.
- pH별 생육 측정은 Gomori(1955)의 완충액으로 pH 2~10으로 조정한 YM broth를 사용하였고, NaCl 내성 실험은 NaCl을 최종 농도 5, 10, 15, 20%가 되도록 첨가한 YM broth에 각 균주를 접종한 후 Bioscreen C (Labsystem Oy, Finland)를 이용하여 28℃에서 3일간 배양하여 균주의 생육 정도를 측정하였다. 생육 정도는 각 처리별로 3 반복으로 수행하여 얻은 흡광도의 평균값으로 하였다.
- 100 uL 의 YM broth에 각 균주를 103/mL의 농도로 접종하고 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45℃의 항온기에 정치배양하면서 8시간 간격으로 균주의 생육정도를 측정하였다. 생육 측정은 Plate Reader (Molecular Devices Spectra Max 340)를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하였다. pH별 생육 측정은 Gomori(1955)의 완충액으로 pH 2~10으로 조정한 YM broth를 사용하였고, NaCl 내성 실험은 NaCl을 최종 농도 5, 10, 15, 20%가 되도록 첨가한 YM broth에 각 균주를 접종한 후 Bioscreen C (Labsystem Oy, Finland)를 이용하여 28℃에서 3일간 배양하여 균주의 생육 정도를 측정하였다.
- 선발된 효모의 토양 내에서의 생존력 검정은 실험실 내에서 원예용 상토(서울바이오, 한국)를 이용하여 실시하였다. 상토 50 g을 식물 배양용 사각 플라스틱 용기(72×72×100 mm)에 넣어 121℃에서 30분간 고압 증기 멸균시킨 후 24시간 YM broth에 배양한 인산가용화 균주의 배양액 5 mL을 0.
- 선발한 인산가용화 효모 5균주에 대한 생리적 특성을 확인하기 위하여 생육 온도와 생육 pH, NaCl 내성을 조사하였다. 배양 3일 후 조사한 생육 온도는 5균주 모두 20~35℃의 범위에서 잘 자라는 중온성 효모였다.
- 선별된 균주는 Pikovskaya’s 고체 배지에서 투명환 형성 여부를 수회 반복하여 활성을 확인 하여 선발하였다.
- 인산 가용화 활성의 정량분석을 위하여 불용성 인산 tri-calcium phosphate가 0.5% 함유된 액체배지에 공시 균주를 배양하면서 tricalcium phosphate가 가용화되어 유리된 인산의 양과 인산 가용화시 일어나는 배양액의 pH의 변화를 측정하였다. 시기별 인산 가용화에 의해 생성된 유리인산의 농도 변화 양상은 균주에 따라 차이가 나타났으며 유리인산의 농도가 높아질수록 pH가 낮아져 유리인산의 양과 pH는 역상관관계를 나타내었다.
- 인산 가용화 효모의 선발은 0.5%의 tricalcium phosphate가 포함된 Pikovskaya’s 고체배지를 사용하였으며 배지 조성은 glucose 1%, (NH4)2SO4 0.05%, MgSO4·7H2O 0.01%, KCl 0.02%, MnSO4 0.5%, Ca3(PO4)2 0.5%, Agar 1.8%로 조제하였으며 pH는 7.0으로 조정하였다(Pikovskaya, 1948).
- 인산가용화 활성을 나타내는 균주를 0.5%의 tricalcium phosphate가 포함된 100 mL의 Pikovskaya's 액체배지에서 28, 150 rpm의 조건으로 진탕배양하면서 1, 2, 3, 5, 7, 9, 11, 13일 간격으로 배양액을 10 mL씩 취하여 pH와 유리인 산의 양을 측정하였다.
- 인산가용화 효모의 생리적 특성을 분석하기 위하여 생육 온도, pH, NaCl 내성을 조사하였다. 생육 온도는 96 well micro plate를 이용하여 액체배양으로 실시하였다.
- 효모의 동정은 ribosomal DNA 염기서열 분석으로 수행하였다. rDNA PCR 증폭을 위한 genomic DNA는 Sambrook과 Russell(2001)의 방법을 변형하여 분리하였다.
- 효모의 동정을 위하여 26S rDNA D1-D2 영역을 PCR 증폭하고 염기서열을 분석하였다. 26S rDNA D1-D2 영역의 PCR 증폭을 위한 primer는 Kurtzman과 Robnett(1998)이 효모의 계통분류학적 분류에 사용한 NL-1 (5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3')과 NL-4 (5'-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3') primer를 합성하여 사용하였다.
대상 데이터
- 26S rDNA D1-D2 영역의 PCR 증폭을 위한 primer는 Kurtzman과 Robnett(1998)이 효모의 계통분류학적 분류에 사용한 NL-1 (5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3')과 NL-4 (5'-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3') primer를 합성하여 사용하였다.
- Pikovskaya’s 고체배지에 96 pin Microplate Replicator (Boekel Scientific, USA)로 균주를 접종하고 28℃에서 5일간 배양 하여 균체 주위에 불용성 인산이 용해되어 투명 환을 형성 하는 균주를 선별하였다.
- 발효식품에서 분리한 효모 약 1,100 균주를 대상으로 Pikovskaya's 고체 배지에서 인산가용화 활성을 검정하여 불용성 인산 tricalcium phosphate 분해능을 보이는 24균주를 1차 선발하였다.
- 배양액 중의 유리인산 농도는 Phosphate Colorimetric Assay Kit (BioVision Incorporated)를 이용하여 반응시키고 Plate Reader를 이용하여 650 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 얻어진 각 시료의 흡광도를 인산 표준용액으로 작성한 standard curve와 비교하여 유리 인산의 농도를 계산 하였다. 유리 인산량 환산에 사용한 인산 표준용액은 토양 화학분석법(농촌진흥청)에 준하여 KH2PO4으로 50 mg P/L저장액을 조제하고 농도별로 희석하여 사용하였다.
- 인산 가용화 활성 검정 균주는 메주, 된장 등의 장류 및 누룩 등 우리나라의 전통 발효식품에서 분리하여 국립농업과학원에 보존 중인 효모 약 1,100 균주를 사용하였다. 인산 가용화 효모의 선발은 0.
- 한국 전통 발효식품에서 분리한 효모로부터 인산 가용화 활성이 우수한 5균주를 선발하였다. 선발한 균주 중 2균주는 Pichia anomala로 동정되었고, 3균주는 각각 Pichia fari-nosa, Candida versatilis, Pichia subpelliculosa로 동정되었다.
데이터처리
- 각 균주의 염기서열은 Lasergene ver. 8.1.4 (DNASTAR Inc.) 프로그램을 이용하여 GenBank database의 염기서열과 비교 분석하여 동정하였으며, MEGA5.1 program을 이용하여 계통분류학적 위치를 분석하였다.
이론/모형
- Phylogenetic positions of phosphate solubilizing yeast strains based on the 26S rDNA domain D1-D2. The phylogenetic tree was constructed by the maximum parsimony method. Numerals indicate bootstrap values, expressed as percentages of 1,000 samples.
- 85%의 NaCl 용액 25 mL에 희석하여 상토에 고르게 혼합하였다. 접종한 효모의 농도는 serial dilution법으로 희석한 희석액을 YM 배지에 도말하여 생균수를 계수하여 환산하였다. 균주를 혼합한 상토는 28℃에서 8주간 보관하면서 1주일 간격으로 생균수를 조사하였다.
성능/효과
- 1.64~4.64×107 cfu/g soil의 농도로 접종한 균주의 밀도는 2주까지 1.38~3.73×108 cfu/g soil까지 증가하였다가 3주 이후부터는 점차 감소하는 경향을 나타내었다.
- farinosa Y669는 45℃의 고온에서도 생장하였다. C. versatilis Y907 균주는 pH 5~6의 좁은 pH 범위에서 생장하였고 15%의 NaCl 농도까지 내성을 나타내는 호염성 균주였다. 그 외 4균주는 pH 4.
- NaCl 내성 검정에서는 P. anomala Y394 및 Y524, P. fari-nosa Y669, P. subpelliculosa Y1101 균주가 NaCl 10% 농도까지 생장하여 내성을 나타내었으며, C. versatilis Y907 균주는 15%의 농도까지 내성을 보였고 NaCl 무첨가 배지에서보다 5%의 농도에서 생육이 양호한 것으로 미루어 약호 염성 균주로 판단된다(Fig. 5). Lages 등(1999)은 42종의 효모 표준 균주를 대상으로 NaCl 내성을 검정한 결과 P.
- 시기별 인산 가용화에 의해 생성된 유리인산의 농도 변화 양상은 균주에 따라 차이가 나타났으며 유리인산의 농도가 높아질수록 pH가 낮아져 유리인산의 양과 pH는 역상관관계를 나타내었다. 균주별 유리인산의 양과 pH의 변화는 P. anomala Y394와 Y524 균주의 유리인산량은 각각 접종 2일 후 453 ug/mL (pH 5.26)와 3일 후 440.8 ug/mL (pH 5.34)로 최고치를 나타냈었고, 그 이후에는 완만하게 감소되는 경향을 보였으며, P. farinosa Y669 균주는 9일 후 554.8 ug/mL (pH 4.9)로 최고치를 보였다가 그 이후에는 급격히 감소하였다. 반면에 C.
- 73×108 cfu/g soil까지 증가하였다가 3주 이후부터는 점차 감소하는 경향을 나타내었다. 균주별로는 P. anomala Y394및 Y524와 P. farinosa Y669는 2주까지 밀도가 증가하였다가 그 이후에는 감소하였으나 조사기간 8주까지 최초 접종 밀도보다 약간 높은 수준으로 유지되었다. C.
- 배양 3일 후 조사한 생육 온도는 5균주 모두 20~35℃의 범위에서 잘 자라는 중온성 효모였다. 균주별로는 Pichia farinosa로 동정된 Y669 균주는 40℃에서 가장 생육이 우수 하였고 45℃에서도 생장이 가능하였다. 고추장에서 분리한 P.
- 선발한 인산가용화 효모 5균주에 대한 생리적 특성을 확인하기 위하여 생육 온도와 생육 pH, NaCl 내성을 조사하였다. 배양 3일 후 조사한 생육 온도는 5균주 모두 20~35℃의 범위에서 잘 자라는 중온성 효모였다. 균주별로는 Pichia farinosa로 동정된 Y669 균주는 40℃에서 가장 생육이 우수 하였고 45℃에서도 생장이 가능하였다.
- 4%)의 NaCl 농도에서 내성을 보이는 것으로 보고하였다. 본 연구에서 선발한 P. anomala Y394와 Y524 균주는 Lages 등의 결과와 유사하였으나 P. farinosa Y669는 15%에서 생장이 매우 저조하였고 C. versatilis Y907 균주는 20%의 NaCl 농도에서 내성이 없어 차이를 보였다. 선발한 5균주는 10% 이상의 NaCl 농도에서 내성을 나타내어 염류집적 토양에 적용하는 데 문제가 없을 것으로 사료된다.
- 인산 가용화 균주는 토양에서도 8주 동안 107~108 cfu/g의 밀도를 유지하며 생존하였다. 분리균주 중 인산 가용화 활성은 P. subpelliculosa Y1101가 가장 우수하였으며 배양 11일 후 697.2 ug/mL의 유리인산을 생성하였다.
- 생육 pH는 4~7의 범위에서 생육이 우수하였고, P. ano-mala Y394, Y524 균주는 3~8, P. subpelliculosa Y1101는 3~9의 pH 범위에서 생육이 가능하였으며 P. farinosa Y669는 pH 4~8, C. versatilis Y907은 pH 5~6의 범위에서만 생육이 확인되었다(Fig. 4). 인산가용화를 일으키는 주요한 요인은 미생물 등이 생성하는 유기산으로서 유기산의 작용에 의하여 토양의 pH가 낮아지고 불용성 인산염이 분해되는 것으로 알려져 있다(Goldstein, 1995; Halder et al.
- 발효식품에서 분리한 효모 약 1,100 균주를 대상으로 Pikovskaya's 고체 배지에서 인산가용화 활성을 검정하여 불용성 인산 tricalcium phosphate 분해능을 보이는 24균주를 1차 선발하였다. 선발한 24균주는 수회 반복하여 활성을 확인하여 인산 가용화 활성이 우수한 것으로 판단된 5균주를 최종 선발하였는데, 분리원별로는 전통 발효법으로 발효된 메주에서 분리한 균주가 1균주(Y394), 누룩에서 분리된 균주가 2균주(Y524, Y669)였으며, 된장(Y907) 및 고추장(Y1101)에서 분리된 균주가 각각 1균주였다. 최종 선발된 5균주는 0.
- 한국 전통 발효식품에서 분리한 효모로부터 인산 가용화 활성이 우수한 5균주를 선발하였다. 선발한 균주 중 2균주는 Pichia anomala로 동정되었고, 3균주는 각각 Pichia fari-nosa, Candida versatilis, Pichia subpelliculosa로 동정되었다. 인산 가용화 효모는 20~35℃의 온도에서 잘 자라는 중 온성 효모였으며 P.
- 5% 함유된 액체배지에 공시 균주를 배양하면서 tricalcium phosphate가 가용화되어 유리된 인산의 양과 인산 가용화시 일어나는 배양액의 pH의 변화를 측정하였다. 시기별 인산 가용화에 의해 생성된 유리인산의 농도 변화 양상은 균주에 따라 차이가 나타났으며 유리인산의 농도가 높아질수록 pH가 낮아져 유리인산의 양과 pH는 역상관관계를 나타내었다. 균주별 유리인산의 양과 pH의 변화는 P.
- 7). 실험 균주 중에서는 P. subpelliculosa Y1101균주의 인산 가용화능이 가장 우수하였고, P. anomala로 동정된 2균주는 유리인산의 양은 적었으나 2~3일 만에 최고치에 이르러 가장 빠른 인산 가용화 속도를 나타내었다.
- 3). 온도 실험 결과 P. farinosa Y669균주는 45℃에서도 생장하므로 미생물 비료 등 고온 환경에서 적용시 더 유리할 것으로 판단된다.
- 이들 균주를 26S rDNA D1-D2 영역의 염기서열을 결정 하여 표준균주(type strain)의 염기서열과 상동성을 비교한 결과, Y394는 Pichia anomala와 99.8%의 상동성을 나타내었고, Y524는 100% 일치하였다. Y669는 Pichia farinosa와 Y907은 Candida versatilis, 그리고 Y1101은 Pichia subpelliculosa와 100% 일치하였다.
- Y669는 Pichia farinosa와 Y907은 Candida versatilis, 그리고 Y1101은 Pichia subpelliculosa와 100% 일치하였다. 이들 염기서열을 기초로 한 계통도 분석에서도 각 분류군에 속하는 것으로 판단되어 선발한 5균주는 4종으로 동정하였다(Fig. 2).
- 최종 선발된 5균주는 0.5%의 tricalcium phosphate가 함유된 Pikovskaya's 고체 배지에 배양했을 때 불용성 인산을 분해 하여 투명환을 형성하는 것이 확인되었다(Fig. 1).
후속연구
- , 1997; Kpomblekou and Tabatabai, 1994). 따라서 pH가 낮은 환경에서 생장이 가능한 P. anomala Y394및 Y524 균주와 P. subpelliculosa Y1101 균주가 인산 가용화 미생물제로 활용하는 데 더 적합할 것으로 사료된다.
- 토양에 적용하는 미생물제가 기능을 발휘하기 위해서는 토양 내에서 미생물의 밀도 유지가 매우 중요하다. 본 연구에서 선발한 인산가용화 효모는 식품에서 분리한 균주이지만 8주까지 107~108의 밀도로 토양내에서 생존하면서 밀도를 유지하는 것으로 보아 토양 개량이나 미생물 비료 등의 목적으로 토양에 적용이 가능할 것으로 사료된다.
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