본 연구에서는 미성숙 복분자 추출물의 항산화 효능과 타이로시네이즈 저해 활성을 평가하고 이들의 기능성 화장품 원료로서의 응용 가능성을 확인하였다. 모든 실험은 미성숙 복분자의 50% 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 분획, 아글리콘 분획을 이용하여 진행하였다. DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)법을 이용한 자유 라디칼 소거 활성($FSC_{50}$)은 에탄올 추출물(6.56 ${\mu}g/mL$)과 에틸아세테이트 분획(6.14 ${\mu}g/mL$)이 대표적인 지용성 항산화제인 (+)-${\alpha}$-tocopherol (8.98 ${\mu}g/mL$)보다 높은 것으로 나타났다. $Fe^{3+}-EDTA/H_2O_2$ 계에서 생성된 활성산소종에 대한 소거 활성($OSC_{50}$)은 에탄올 추출물(0.83 ${\mu}g/mL$), 에틸아세테이트 분획 (0.84 ${\mu}g/mL$), 아글리콘 분획(1.13 ${\mu}g/mL$) 세 분획 모두 대표적인 수용성 항산화제인 L-ascorbic acid (1.5 ${\mu}g/mL$)보다 높은 것으로 나타났다. Rose bengal로 광증감된 $^1O_2$에 의한 적혈구 파괴에 대하여, 세 분획 모두 농도 의존적(1 ~ 50 ${\mu}g/mL$)인 세포보호 활성을 나타내었다. 또한 50 ${\mu}g/mL$ 농도를 기준으로 비교하였을 때, 50% 에탄올 추출물의 ${\tau}_{50}$은 296.3 min으로 가장 높은 세포보호 활성을 나타내었다. 타이로시네이즈 저해 활성에서 에틸아세테이트 분획과 아글리콘 분획은 알부틴보다 높은 저해 효과를 나타내었다. 이상의 결과들로부터 미성숙 복분자 추출물은 라디칼을 포함한 활성산소종을 소거하는 항산화제로서, 알부틴을 대체하는 미백 기능성 원료로서 응용될 수 있음을 확인하였다.
본 연구에서는 미성숙 복분자 추출물의 항산화 효능과 타이로시네이즈 저해 활성을 평가하고 이들의 기능성 화장품 원료로서의 응용 가능성을 확인하였다. 모든 실험은 미성숙 복분자의 50% 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 분획, 아글리콘 분획을 이용하여 진행하였다. DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)법을 이용한 자유 라디칼 소거 활성($FSC_{50}$)은 에탄올 추출물(6.56 ${\mu}g/mL$)과 에틸아세테이트 분획(6.14 ${\mu}g/mL$)이 대표적인 지용성 항산화제인 (+)-${\alpha}$-tocopherol (8.98 ${\mu}g/mL$)보다 높은 것으로 나타났다. $Fe^{3+}-EDTA/H_2O_2$ 계에서 생성된 활성산소종에 대한 소거 활성($OSC_{50}$)은 에탄올 추출물(0.83 ${\mu}g/mL$), 에틸아세테이트 분획 (0.84 ${\mu}g/mL$), 아글리콘 분획(1.13 ${\mu}g/mL$) 세 분획 모두 대표적인 수용성 항산화제인 L-ascorbic acid (1.5 ${\mu}g/mL$)보다 높은 것으로 나타났다. Rose bengal로 광증감된 $^1O_2$에 의한 적혈구 파괴에 대하여, 세 분획 모두 농도 의존적(1 ~ 50 ${\mu}g/mL$)인 세포보호 활성을 나타내었다. 또한 50 ${\mu}g/mL$ 농도를 기준으로 비교하였을 때, 50% 에탄올 추출물의 ${\tau}_{50}$은 296.3 min으로 가장 높은 세포보호 활성을 나타내었다. 타이로시네이즈 저해 활성에서 에틸아세테이트 분획과 아글리콘 분획은 알부틴보다 높은 저해 효과를 나타내었다. 이상의 결과들로부터 미성숙 복분자 추출물은 라디칼을 포함한 활성산소종을 소거하는 항산화제로서, 알부틴을 대체하는 미백 기능성 원료로서 응용될 수 있음을 확인하였다.
In this study, the antioxidative effects and inhibitory activities of unripened fruit extract of Rubus coreanus Miquel (R. coreanus Miquel) on tyrosinase were investigated and the potential applicability as a cosmeceutical ingredients was evaluated. All experiments were performed with 50% ethanol ex...
In this study, the antioxidative effects and inhibitory activities of unripened fruit extract of Rubus coreanus Miquel (R. coreanus Miquel) on tyrosinase were investigated and the potential applicability as a cosmeceutical ingredients was evaluated. All experiments were performed with 50% ethanol extract, ethyl acetate fraction and aglycone fraction of unripened fruit extract of R. coreanus Miquel. The DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) scavenging activites ($FSC_{50}$) of 50% ethanol extract (6.56 ${\mu}g/mL$) and ethyl acetate fraction (6.14 ${\mu}g/mL$) of unripened fruit extract of R. coreanus Miquel were higher than (+)-${\alpha}$-tocopherol (8.98 ${\mu}g/mL$), which is known as a typical hydrophobic antioxidant. Reactive oxygen species (ROS) scavenging activities ($OSC_{50}$) of 50% ethanol extract (0.83 ${\mu}g/mL$), ethyl acetate fraction (0.84 ${\mu}g/mL$) and aglycone fraction (1.13 ${\mu}g/mL$) of R. coreanus Miquel on ROS generated in $Fe^{3+}-EDTA/H_2O_2$ system were higher than L-ascorbic acid (1.5 ${\mu}g/mL$), which is known as s typical hydrophilic antioxidant. The cellular protective effect of extract and fraction of unripened fruit extract of R. coreanus Miquel on the rose bengal sensitized photohemolysis of human erythrocytes was increased in a concentration dependent manner (1 ~ 50 ${\mu}g/mL$). And 50% ethanol extract in 50 ${\mu}g/mL$ showed the most protective effect among extracts (${\tau}_{50}$ = 296.3 min). The inhibitory effects on tyrosinase of ethyl acetate and agylcone fractions were higher than arbutin. These results indicate that unripened fruit extracts of R. coreanus Miquel can be applied to antioxidant scavenging ROS including radical as an alternative whitening agent to replace arbutin.
In this study, the antioxidative effects and inhibitory activities of unripened fruit extract of Rubus coreanus Miquel (R. coreanus Miquel) on tyrosinase were investigated and the potential applicability as a cosmeceutical ingredients was evaluated. All experiments were performed with 50% ethanol extract, ethyl acetate fraction and aglycone fraction of unripened fruit extract of R. coreanus Miquel. The DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) scavenging activites ($FSC_{50}$) of 50% ethanol extract (6.56 ${\mu}g/mL$) and ethyl acetate fraction (6.14 ${\mu}g/mL$) of unripened fruit extract of R. coreanus Miquel were higher than (+)-${\alpha}$-tocopherol (8.98 ${\mu}g/mL$), which is known as a typical hydrophobic antioxidant. Reactive oxygen species (ROS) scavenging activities ($OSC_{50}$) of 50% ethanol extract (0.83 ${\mu}g/mL$), ethyl acetate fraction (0.84 ${\mu}g/mL$) and aglycone fraction (1.13 ${\mu}g/mL$) of R. coreanus Miquel on ROS generated in $Fe^{3+}-EDTA/H_2O_2$ system were higher than L-ascorbic acid (1.5 ${\mu}g/mL$), which is known as s typical hydrophilic antioxidant. The cellular protective effect of extract and fraction of unripened fruit extract of R. coreanus Miquel on the rose bengal sensitized photohemolysis of human erythrocytes was increased in a concentration dependent manner (1 ~ 50 ${\mu}g/mL$). And 50% ethanol extract in 50 ${\mu}g/mL$ showed the most protective effect among extracts (${\tau}_{50}$ = 296.3 min). The inhibitory effects on tyrosinase of ethyl acetate and agylcone fractions were higher than arbutin. These results indicate that unripened fruit extracts of R. coreanus Miquel can be applied to antioxidant scavenging ROS including radical as an alternative whitening agent to replace arbutin.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 미성숙 복분자를 이용하여 50% 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 분획, 아글리콘 분획을 제조하였으며, 이들 분획의 항산화 활성 및 1O2로 유도된 세포 손상에 대한 보호 작용과 멜라닌 형성에 직접적으로 관여하는 타이로시네이즈의 저해 활성을 평가하였다. 이와 같은 미성숙 복분자의 분획별 비교 연구를 통해 미성숙 복분자 추출물의 항산화 및 항노화 화장품 소재로서의 이용 가능성을 검토하였다.
로 유도된 세포 손상에 대한 보호 작용과 멜라닌 형성에 직접적으로 관여하는 타이로시네이즈의 저해 활성을 평가하였다. 이와 같은 미성숙 복분자의 분획별 비교 연구를 통해 미성숙 복분자 추출물의 항산화 및 항노화 화장품 소재로서의 이용 가능성을 검토하였다.
제안 방법
가장 우수한 세포보호 효과를 나타내었던 50 µg/mL를 기준으로 미성숙 복분자의 세 분획과 지용성 항산화제인 (+)-α-tocopherol (74.3 ± 6.4 min)의 τ50을 비교 하였다(Figure 4).
광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한 50 cm × 20 cm × 25 cm 크기의 상자 안에 20 W 형광등을 장치하고, 형광등으로부터 5 cm 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 파이렉스 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열한 후 15 min 동안 광조사 하였다.
광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한 50 cm × 20 cm × 25 cm 크기의 상자 안에 20 W 형광등을 장치하고, 형광등으로부터 5 cm 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 파이렉스 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열한 후 15 min 동안 광조사 하였다. 광조사가 끝난 후 암반응(post-incubation) 시간에 따른 적혈구의 파괴정도를 15 min 간격으로 700 nm에서 투광도(transmittance, %)로부터 구하였다. 이 파장에서 적혈구 현탁액의 투광도 증가는 적혈구의 용혈정도에 비례한다.
2 mM DPPH 용액 1 mL에 에탄올 1 mL를 첨가하고 여러 농도의 미성숙 복분자 추출물 1 mL을 첨가하여 섞은 다음 실온에서 10 min 동안 방치 후 spectrophotometer로 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 활성의 크기는 시료를 넣지 않은 경우를 대조군(control)으로 하고 시료를 넣은 것을 실험군(experiment)으로 하였다. 자유 라디칼 소거 활성은 DPPH의 농도가 50% 감소되는데 필요한 시료의 농도(free radical scavenging activity, FSC50, µg/mL)로서 표기하였으며, 자유 라디칼(DPPH) 소거 활성(%)을 계산하는데 사용한 식은 다음과 같다.
이어서 화학발광기의 cell holder에 튜브를 넣고 5 min 동안 항온 시킨 후 150 mM H2O2 40 µL를 넣고 화학발광을 25 min 동안 측정하였다. 대조군(control)은 시료용액 대신에 증류수를 넣고, 공시험(blank)은 시료군과 조건이 동일하나 FeCl3ㆍ6H2O와 H2O2 대신 증류수를 첨가하였다. 화학발광기 6-channel LB9505 LT의 각 채널은 실험 전에 보정하여 채널 간의 차이가 거의 없도록 하였다.
또한 에틸아세테이트 분획 파우더 일부를 산 가수 분해 반응을 이용하여 당을 제거시켜 아글리콘 분획을 제조하였다. 실험 방법은 에틸아세테이트 가용분 일정량에 H2SO4 및 아세톤 용액을 넣고, 4 h 동안 중탕 가열하면서 환류ㆍ냉각시킨다.
이 여액을 감압 건조하여 50% 에탄올 파우더를 얻었다. 또한 에틸아세테이트 분획을 얻기 위해, 50% 에탄올 추출물을 감압 농축한 후 물과 n-헥산을 이용하여 비극성 성분을 제거하고 이를 감압ㆍ농축하여 파우더를 얻었다.
미성숙 복분자 추출물의 광용혈에 미치는 효과는 postincubation 시간과 용혈정도로 구성된 그래프로부터 적혈구의 50%가 용혈되는 시간인 τ50을 구하여 비교 하였다.
이러한 이유로 타이로시네이즈 저해 활성은 미백 활성을 평가하는데 매우 중요한 요소이다. 본 실험에서는 미성숙 복분자 추출물 및 분획과 대표적인 미백제로 알려져 있는 알부틴을 비교 물질로 하여 타이로시네이즈 저해 활성을 비교하였다(Figure 5).
이러한 결과를 체내에 존재하는 대표적인 수용성 항산화제인 L-ascorbic acid (OSC50 = 1.50 ± 0.85 µg/mL)와 비교하였다.
추출물을 농도별로 각각 50 µL씩 첨가하고 암소에서 30 min 동안 pre-incubation 시킨 후, 광증감제 rose-bengal (12 µM) 0.5 mL를 가하고 파라필름(Whatman laboratory sealing film, UK)으로 입구를 막은 후 15 min 동안 광조사 하였다.
대상 데이터
50% 에탄올 추출물은 비교 물질로 사용한 알부틴 (226.9 ± 1.6 µg/mL)과 유사한 타이로시네이즈 저해 활성을 나타내었다.
EDTA, luminol, heparin, 증감제로 사용된 rose ben-gal, DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) radical은 Sigma Chemical Co. (USA)에서 구입하여 사용하였다. 기타 FeCl3ㆍ6H2O는 Junsei Chemical Co.
HPLC 용매 제조에 사용된 Acetonitrile은 J. T. Baker사와 B&J사의 HPLC grade 제품을 사용하였다.
Baker사와 B&J사의 HPLC grade 제품을 사용하였다. L-타이로신과 N-succinyl-(Ala)3-p-nitroanilide와 타이로시네이즈(11.9 mg solid, 4,276 units/mg solid)는 Sigma Chemical Co. (USA)에서 구입하여 사용하였다. 비교물질로 사용한 (+)-α-tocopherol (1,000 IU vitamin E/g), L-ascorbic acid, 알부틴은 Sigma (USA)에서 구입하였다.
UV-visible spectrophotometer는 Varian (Australia)사의 Cary 50, 적혈구 광용혈에 사용한 Spectronic 20D는 Milton Roy Co. (USA) 제품, 화학발광 실험에 사용된 6-channel LB9505 LT는 Berthold (Germany)사의 제품, pH meter는 Istek (Korea)사 제품을 사용하였다.
기타 FeCl3ㆍ6H2O는 Junsei Chemical Co. (Japan) 제품을, H2O2는 Dae Jung Chemical & Metals (Korea)사 제품을 사용하였다.
비교물질로 사용한 (+)-α-tocopherol (1,000 IU vitamin E/g), L-ascorbic acid, 알부틴은 Sigma (USA)에서 구입하였다. 본 실험에 사용한 미성숙 복분자는 2013년 5월 경동시장에서 구입하여 사용하였다.
비교물질로 사용한 (+)-α-tocopherol (1,000 IU vitamin E/g), L-ascorbic acid, 알부틴은 Sigma (USA)에서 구입하였다.
실험에 사용된 적혈구 현탁액은 700 nm에서 O.D. 값이 0.6이었으며 이때 적혈구 수는 1.5 × 107 cells/mL이었다.
(Japan) 제품을, H2O2는 Dae Jung Chemical & Metals (Korea)사 제품을 사용하였다. 완충용액제조에 사용된 Na2HPO4ㆍ12H2O, NaH2PO4ㆍ2H2O, NaCl, trizma base, HCl 그리고 에탄올, 메탄올, 에틸아세테이트, n-헥산 등 각종 용매는 시판 특급 시약을 사용하였다. HPLC 용매 제조에 사용된 Acetonitrile은 J.
적혈구는 건강한 성인 남녀 2명으로부터 얻었다. 채혈 즉시 heparin이 첨가된 시험관에 넣은 후, 3,000 rpm으로 5 min 동안 원심분리하여 적혈구와 혈장을 분리하고, 분리한 적혈구는 0.
데이터처리
결과는 각 실험그룹별 평균 표준편차(S.D)로 표기 하였고 실험데이터는 대조군과 샘플처리 그룹간 Student’s t-test법을 이용하여 처리하였다.
이론/모형
본 실험에서는 루미놀 발광법을 이용하여 여러 가지 ROS에 대한 총항산화능을 측정하였다. 루미놀은 Fe3+-EDTA/H2O2 계에서 생성된 ROS에 의해 산화되고 들뜬 상태의 아미노프탈산이 된다.
성능/효과
1) 미성숙 복분자 추출물의 자유 라디칼 소거 활성(FSC50) 측정 결과, 에틸아세테이트 분획(6.14 µg/mL)> 50% 에탄올 추출물(6.56 µg/mL) > (+)-α-tocopherol(8.98 µg/mL) > 아글리콘 분획(18.75 µg/mL) 순서로 나타났다.
3) 미성숙 복분자 추출물의 1O2로 유도된 적혈구 파괴에 대한 효과 실험에서 세 분획 모두 농도 의존적인 세포보호 효과를 나타내었다. 또한 50 µg/mL 농도를 기준으로 50% 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 분획 및 아글리콘 분획의 τ50은 각각 296.
4) 자유 라디칼 소거 활성, 활성산소 소거 활성 및 1O2로 유도된 적혈구 파괴에 대한 효과에 대하여 50% 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획은 당을 제거시킨 아글리콘 분획보다 우수한 활성을 나타내었다. 이를 통해 미성숙 복분자 추출물 중 수상 추출 조건과 에틸아세테이트를 이용한 유효성분을 정제한 분획이 우수한 항산화 활성 및 세포보호 효과를 나타내는 유효성분 추출에 적합한 조건으로 사료된다.
따라서 에틸아세테이트 분획과 아글리콘 분획은 (+)-α-tocopherol보다 높은 라디칼 소거 활성을 갖는 것으로 확인되었다.
또한 50 µg/mL 농도를 기준으로 50% 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 분획 및 아글리콘 분획의 τ50은 각각 296.3, 177.5, 158.8 min으로 비교 물질인 (+)-α-tocopherol (74.3 min)보다 매우 높은 세포보호 활성을 나타내었다.
모든 경우의 실험에서 대조군은 τ50이 29.30 min으로 오차범위 ± 1 min 이내로 재현성이 양호하게 나타났다.
85 µg/mL)와 비교하였다. 미성숙 복분자 50% 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 분획 및 아글리콘 분획은 각각 L-ascorbic acid보다 약 1.78, 1.76 및 1.34 배 더 큰 활성산소 소거 활성을 나타내었다.
미성숙 복분자의 50% 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획의 IC50은 각각 235.9 ± 7.4, 173.0 ± 0.7 µg/mL 로 나타났다.
50 µg/mL) 순서로 나타났다. 세 분획 모두 비교 물질인 L-ascorbic acid보다 높은 활성산소 소거 활성을 갖는 것으로 확인되었다.
위의 결과를 통해 미성숙 복분자의 50% 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획은 (+)-α-tocopherol을 대체하는 라디칼 소거제로서 사용될 수 있음을 확인하였다.
이는 비교 물질인 (+)-α-tocopherol보다 각각 4.0, 2.4, 2.1 배 높은 세포보호 효과로서, 이러한 결과를 통해 미성숙 복분자의 세 분획 모두 높은 세포보호 효과를 통해 항산화제로서의 높은 응용 가능성을 확인하였다.
로 유도된 적혈구 파괴에 대한 효과에 대하여 50% 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획은 당을 제거시킨 아글리콘 분획보다 우수한 활성을 나타내었다. 이를 통해 미성숙 복분자 추출물 중 수상 추출 조건과 에틸아세테이트를 이용한 유효성분을 정제한 분획이 우수한 항산화 활성 및 세포보호 효과를 나타내는 유효성분 추출에 적합한 조건으로 사료된다.
9 µg/mL) 순서로 확인되었다. 특히 에틸아세테이트 분획과 아글리콘 분획은 비교물질인 알부틴보다 약 1.3, 1.6 배 높은 저해 활성을 나타내었다.
후속연구
이상의 결과로 미루어 볼 때 미성숙 복분자 추출물은 항산화 및 미백 기능성 원료로서 응용 가능성이 있다고 사료되며, 추가적으로 이러한 활성을 갖는 유효성분의 분리ㆍ정제 및 구조분석에 관한 연구와 성숙 시기별 복분자에 대한 항산화 및 타이로시네이즈 활성 비교 연구가 이루어져야 할 것이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
복분자란 무엇인가?
본 연구에서 사용한 복분자(Rubus coreanus Miquel)는 장미과에 속하는 야생 딸기나무의 생약명으로, 동남아시아의 한국, 중국 및 일본에만 자생하는 식물이다[13]. 복분자는 여드름 원인균에 대한 항균 활성 및 지루성 피부염에 대한 항염 효과, B16 세포주를 이용한 미백효능 등에 관한 연구들이 있다[14-17].
복분자는 어떤 효과가 있는가?
본 연구에서 사용한 복분자(Rubus coreanus Miquel)는 장미과에 속하는 야생 딸기나무의 생약명으로, 동남아시아의 한국, 중국 및 일본에만 자생하는 식물이다[13]. 복분자는 여드름 원인균에 대한 항균 활성 및 지루성 피부염에 대한 항염 효과, B16 세포주를 이용한 미백효능 등에 관한 연구들이 있다[14-17]. 또한 함유성분으로는 페놀성 화합물, 트리테르페노이드, 플라보노이드 및 탄닌 등이 보고되고 있다[18,19].
활성산소종이란 무엇인가?
특히 자외선으로부터 유도되어 생성되는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 피부의 광산화적 손상을 유발할 수 있다. ROS는 큰 산화력을 갖는 산소종으로 superoxide anioin radical (O2∙-), hydroxyl radical (ㆍOH)과 같은 산소 중심의 라디칼뿐만 아니라 hydrogen peroxide (H2O2), singlet oxygen (1O2)과 같은 비라디칼 종을 포함한다. ROS는 대사과정에서도 생성될 수 있지만 지속적인 자외선 노출이나 스트레스는 과잉의 ROS 생성을 유발시킨다[1-3].
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