To reduce the production cost of Lactobacillus, discarded red ginseng starch was collected from a factory of red ginseng extract in order to develop the Lactobacillus culture medium. According to the analysis of the gensenoside composition of red ginseng starch, the total gensenoside content of star...
To reduce the production cost of Lactobacillus, discarded red ginseng starch was collected from a factory of red ginseng extract in order to develop the Lactobacillus culture medium. According to the analysis of the gensenoside composition of red ginseng starch, the total gensenoside content of starch was 2.73 mg/g, and the gensenoside $Rb_1$, $Rb_2$ and $Rg_3$ contents were 0.1, 0.29 and 0.52 mg/g, respectively. For the preparation of the liquid media, red ginseng starch was added at rates of 0, 5, 10 and 20%. Further, Lactobacillus plantarum 15357 and Leuconostoc mesenteroides sub sp. strains were then inoculated to these prepared broths. With the red ginseng starch medium, the growth rates ($1.42{\times}10^7$ and $2.96{\times}10^{10}$ CFU/mL) and the final cell concentrations were higher than the MM medium ($1.0{\times}10^7$ CFU/mL). The optimal concentration of red ginseng starch and yeast extract as a medium were 20% and 10 g/L, respectively. Under these conditions, the cell mass of L. plantarum 15357 and L. mesenteroides sub sp. reached $5.11{\times}10^{10}$ and $8.17{\times}10^{10}$ CFU/mL. These results show a great possibility for the utilization of red ginseng starch as economic medium sources in the production of cell mass of lactic acid bacteria. This is the first trial of development of economic LAB growth medium using discarded red ginseng starch.
To reduce the production cost of Lactobacillus, discarded red ginseng starch was collected from a factory of red ginseng extract in order to develop the Lactobacillus culture medium. According to the analysis of the gensenoside composition of red ginseng starch, the total gensenoside content of starch was 2.73 mg/g, and the gensenoside $Rb_1$, $Rb_2$ and $Rg_3$ contents were 0.1, 0.29 and 0.52 mg/g, respectively. For the preparation of the liquid media, red ginseng starch was added at rates of 0, 5, 10 and 20%. Further, Lactobacillus plantarum 15357 and Leuconostoc mesenteroides sub sp. strains were then inoculated to these prepared broths. With the red ginseng starch medium, the growth rates ($1.42{\times}10^7$ and $2.96{\times}10^{10}$ CFU/mL) and the final cell concentrations were higher than the MM medium ($1.0{\times}10^7$ CFU/mL). The optimal concentration of red ginseng starch and yeast extract as a medium were 20% and 10 g/L, respectively. Under these conditions, the cell mass of L. plantarum 15357 and L. mesenteroides sub sp. reached $5.11{\times}10^{10}$ and $8.17{\times}10^{10}$ CFU/mL. These results show a great possibility for the utilization of red ginseng starch as economic medium sources in the production of cell mass of lactic acid bacteria. This is the first trial of development of economic LAB growth medium using discarded red ginseng starch.
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문제 정의
본 연구에서는 유산균의 동결 건조 시 이미 알려진 동결 건조 보호제(skim milk)와 본 연구에서 사용하는 홍삼 전분 그리고 동결 건조 보호제와 홍삼 전분을 첨가하였을 때, 동결 건조 후 생균수의 변화에 미치는 영향을 관찰하였다. Table 5에서는 각각의 조건에서 유산균의 생존율을 시험한 결과, skim milk를 2%와 10%를 첨가하였을 때, L.
본 연구에서는 홍삼 농축액 제조 과정에서 나온 부산물인 홍삼 전분을 활용하여 기존 배지와 차별화된 경제적인 유산균 대량 생산 배지를 개발하고자 유산균을 배양하고 균체 생산을 위한 실험을 진행하였다.
본 연구에 사용된 홍삼 전분은 홍삼 농축액 제조 과정에서 발생되는 불용성 부산물로 현재까지는 폐기물로 인식되어 그 활용이 제한적이었다. 하지만 홍삼 유래의 안전한 물질로 홍삼의 유효 성분인 진세노사이드를 다량 함유하고 있을 뿐 아니라, 각종 유리당 등 탄수화물이 다량 포함되어 있는 저렴한 소재로 유산균 배양에 적합한 소재로의 가능성을 알아보았다. 기존에 인삼 또는 홍삼을 이용한 발효 연구는 미생물 발효를 통하여 인삼 또는 홍삼의 유효성분인 진세노사이드의 생물전환에 국한된 연구가 주를 이루고 있었다.
HPLC 분석은 μ-Bondapak C18(3.9 mm×150 mm, 5 μm) column을 사용하여 이동상의 유속과 컬럼 온도는 각각 0.6 mL/min, 43℃로 하고, UV 검출기의 검출 파장은 203 nm로 하여 분석하였다(Kim et al 2007, Park et al 2011).
1% N-1-naphthyl-ethylendiamine H2O:1% sulfanilamide/5% H3PO4= 1:1)을 동량 첨가하여 10분간 반응시킨 후, microplate reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Nitrite의 농도는 NaNO3를 이용하여 얻은 표준 곡선과 비교하여 계산하였다.
각각 제조된 배지로부터 유산균 균수의 측정은 채취된 시료를 멸균 생리식염수(0.9% NaCl)를 사용하여, 10진 희석법에 따라 희석한 후, BCP첨가 평판 측정용 한천 배지(peptone, yeast extract, dextrose, tween80, cysteine, bromocresol purple, agar)를 배지로 사용하여 30℃에서 배양한 후, 생성된 집락을 3회 반복하여 측정하였다.
회수된 균체는 동결 건조 보호제(skim milk), 홍삼 전분 그리고 skim milk, 홍삼 전분 혼합물을 첨가하여 균질화한 후 —40℃로 동결시킨 다음 동결 건조기(LP 50, Il Shin BioBase, Korea)에서 건조하였다. 건조된 균체는 분쇄하여 분말화시킨 다음 멸균 생리식염수에 단계 희석하여 BCP 배지에 도말한 후 30℃에서 72시간 배양한 다음, 생균수를 측정하여 동결 건조 후의 생존수를 측정하였다.
단핵 세포 세포주인 RAW 264.7 세포로부터 NO 생산의 지표로서 배양 상층액 내에 안정된 NO 산화물인 NO2-(nitrite)를 Griess 반응으로 측정하였다. EDTA(ethylenediamine tetra acetic acid)가 들어 있는 50 mM potassium phosphate buffer로 조직을 마쇄한 후에 4℃, 10,000×g에서 15분 동안 원심 분리하여 조직의 상층액을 준비하며, 각각의 상층액 100 μL를 96 well plate에 넣고, 여기에 Griess 시약(0.
유산균은 일반적으로 생육 중에 여러 가지 산을 생성시키므로 배양 중에 산 생성량 변화가 발생하며, 산 생성량 변화를 pH 변화로 조사하였다. 대조군은 MRS 배지로 배양하였고, 홍삼 전분 MMY 배지는 홍삼 전분 및 질소원의 농도별로 배양하면서 pH를 측정하였다.
동결 건조 보호제에 따른 유산균의 내산성을 시험하기 위해 인공 위액(Kobayashi et al 1974)의 방법에 따라 HCl을 사용하여 pH를 3.0으로 조정한 홍삼 전분 MMY 배지(pepsin 1.0% 첨가)에 30℃로 맞추어 30분 동안 방치한 후, 멸균 생리식염수에 단계 희석하여 BCP 배지에 도말한 후, 30℃에서 72시간 배양한 다음 생균수를 측정하여 동결 건조 후의 생존수를 측정하였다.
본 배양을 위한 홍삼 전분 MMY 배지의 조성은 MMY에 홍삼 전분이 2, 5, 10, 20%(w/v), 그리고 효모추출물은 2, 5, 10%(w/v)로 첨가하여 제조하였으며, 각각의 조건에서 유산균의 증식 상태를 관찰하였다. 본 배양은 working volume 300 mL의 홍삼 전분 배지에 종균 10%를 무균적으로 공급을 하고, 30℃, 120 rpm 조건으로 72시간동안 수행하면서 생균수를 측정하였다(Hwang et al 2008).
홍삼 전분 MMY 배지에서 전배양한 배지 10%을 본배양 배지에 접종하여 배양하였으며, 전배양은 진탕 배양기(Jssi-300CL, JSR, Korea)에서 30℃, 120 rpm 조건으로 24시간 동안 진탕 배양하였고, 본 배양을 위한 종균으로 사용하였다. 본 배양을 위한 홍삼 전분 MMY 배지의 조성은 MMY에 홍삼 전분이 2, 5, 10, 20%(w/v), 그리고 효모추출물은 2, 5, 10%(w/v)로 첨가하여 제조하였으며, 각각의 조건에서 유산균의 증식 상태를 관찰하였다. 본 배양은 working volume 300 mL의 홍삼 전분 배지에 종균 10%를 무균적으로 공급을 하고, 30℃, 120 rpm 조건으로 72시간동안 수행하면서 생균수를 측정하였다(Hwang et al 2008).
유산균은 일반적으로 생육 중에 여러 가지 산을 생성시키므로 배양 중에 산 생성량 변화가 발생하며, 산 생성량 변화를 pH 변화로 조사하였다. 대조군은 MRS 배지로 배양하였고, 홍삼 전분 MMY 배지는 홍삼 전분 및 질소원의 농도별로 배양하면서 pH를 측정하였다.
5%(w/v) 효모 추출물(yeast extract)을 포함하였을 때는 MMY로 표기하였다. 전배양을 위한 발효 배지는 MMY에 홍삼 전분이 10%(w/v)가 되도록 조정한 후 제조하였다.
기존에 인삼 또는 홍삼을 이용한 발효 연구는 미생물 발효를 통하여 인삼 또는 홍삼의 유효성분인 진세노사이드의 생물전환에 국한된 연구가 주를 이루고 있었다. 하지만 본 연구에서는 홍삼의 진세노사이드가 함유된 부산물인 홍삼 전분을 이용하여 유산균의 대량 배양에 대한 연구를 진행하였다. 그 결과, 홍삼 전분 배지에서 5.
홍삼 전분 10 g을 10 mL의 증류수에 현탁하고, 80℃의 water bath에 30분간 둔 후에 원심분리(12,000 rpm, 10 min, 4℃)를 하고, 상등액을 0.2 μm membrane filter로 여과하였으며, 여과액을 10배 희석한 후, carbohydrate cartridge column(waters, USA)을 사용하여 flow rate 0.5 mL/min 및 injection volume은 10 μL로 HPLC(LC-10A, Shimadzu, Japan)로 분석하였다.
홍삼 전분 MMY 배지를 사용하여 유산균을 배양한 후, 원심 분리(Supra-25K, Hanil, Korea)를 10분간하여 균체를 회수하였다. 회수된 균체는 동결 건조 보호제(skim milk), 홍삼 전분 그리고 skim milk, 홍삼 전분 혼합물을 첨가하여 균질화한 후 —40℃로 동결시킨 다음 동결 건조기(LP 50, Il Shin BioBase, Korea)에서 건조하였다.
홍삼 전분의 유리당은 유산균의 생장에 필요한 탄소원으로 사용될 수 있으며, Table 3, 4 의 결과와 같이 대조군(1.0×107 CFU/mL)과 비교하여 균체 생산량(1.9×109∼1.4×1010 CFU/mL)을 증가시켰다.
회수된 균체는 동결 건조 보호제(skim milk), 홍삼 전분 그리고 skim milk, 홍삼 전분 혼합물을 첨가하여 균질화한 후 —40℃로 동결시킨 다음 동결 건조기(LP 50, Il Shin BioBase, Korea)에서 건조하였다.
대상 데이터
균주 Lactobacillus plantarum 15357, Leuconostoc mesenteroides sub sp.는 농진청 농업유전자원센터로부터 분양받아 사용하였다. 홍삼 전분은 충남 소재 (주)성신비에스티의 100% 홍삼에서 분리된 홍삼 전분을 연구용으로 기탁 받아서 사용하였으며, 유산균 배양에 필요한 일반 배지는 MRS broth(Difco, USA)를 이용하였고, 홍삼 전분 배지는 미네랄과 효모 추출물을 혼합하여 사용하였다.
실험에 사용한 홍삼 전분은 홍삼 농축액 제조 과정에서 발생하는 홍삼 추출액에서 가라앉은 불용성 성분을 수거하여 원심분리 후, 페이스트 상태로 제조되며, 제조 후 —20℃에서 냉동 보관하면서 실험에 이용하였다.
홍삼 전분 MMY 배지에서 전배양한 배지 10%을 본배양 배지에 접종하여 배양하였으며, 전배양은 진탕 배양기(Jssi-300CL, JSR, Korea)에서 30℃, 120 rpm 조건으로 24시간 동안 진탕 배양하였고, 본 배양을 위한 종균으로 사용하였다. 본 배양을 위한 홍삼 전분 MMY 배지의 조성은 MMY에 홍삼 전분이 2, 5, 10, 20%(w/v), 그리고 효모추출물은 2, 5, 10%(w/v)로 첨가하여 제조하였으며, 각각의 조건에서 유산균의 증식 상태를 관찰하였다.
는 농진청 농업유전자원센터로부터 분양받아 사용하였다. 홍삼 전분은 충남 소재 (주)성신비에스티의 100% 홍삼에서 분리된 홍삼 전분을 연구용으로 기탁 받아서 사용하였으며, 유산균 배양에 필요한 일반 배지는 MRS broth(Difco, USA)를 이용하였고, 홍삼 전분 배지는 미네랄과 효모 추출물을 혼합하여 사용하였다.
홍삼 전분은 홍삼 농축액 제조 과정에서 부산물로 홍삼 추출액 중 침강되는 불용성 성분을 수거하여 원심분리 후 만들어 실험에 사용하였다. 홍삼 전분은 불용성 성분으로 아직까지는 그 이용 가치 또는 활용 방법에 대한 연구가 거의 이루어지지 않았다.
데이터처리
본 실험에서 얻어진 통계 분석 결과는 SPSS(Statistical Package for Social Science)를 이용해서 통계 분석하였다. 실험군당 평균±표준 오차로 표시하였고, 그룹 간 평균차에 대한 통계적 유의성을 검정하기 위해 일원 배치 분산 분석(one-way analysis of variance)을 실시한 후 p<0.
실험군당 평균±표준 오차로 표시하였고, 그룹 간 평균차에 대한 통계적 유의성을 검정하기 위해 일원 배치 분산 분석(one-way analysis of variance)을 실시한 후 p<0.05 수준에서 Tukey's test를 이용한 사후 검정(Post-Hoc test)을 실시하였다.
성능/효과
HPLC system를 이용하여 진세노사이드 함량을 측정한 결과, Table 1과 같이 홍삼에서 발견되는 Rg3와 compound-K를 0.52 mg/g과 0.1 mg/g을 포함하고 있는 전형적인 홍삼의 특징을 가지고 있었으며, 다양한 진세노사이드를 포함하고 있어(Fig. 1) 홍삼의 기능을 이용할 수 있는 기능성 배지로 사용될 수 있을 것으로 확인되었다. 율피, 소청룡탕 등 한약재의 유산균 발효를 통한 효능 연구에 따르면 유산균에 의해 발효된 한약재의 경우 항산화 활성, 항염증 활성이 더 높은 것으로 알려져 있다(Choi et al 2013, Kang & Kim 2011, Han & Lee 2011).
1×109 CFU/mL로 측정되었다. SM 2%와 RGS 10%를 혼합한 보호제의 유산균이 다른 조건보다는 인공 위액에서의 생존 효과가 높게 측정되었다. 유산균 제품은 위산에서 견딜 수 있는 제형의 안정성이 중요한 요소로 작용 하는데(Ozlem et al 2011), 본 결과에 따르면 홍삼 전분은 이러한 조건을 충족시킬 수 있는 보호제로 유산균 제품의 다양화를 위해 사용가능한 새로운 소재라 할 수 있겠다.
그 결과(Fig. 2), 샘플 농도가 증가할수록 NO 생성량이 유의적으로 증가하는 것으로 확인되었으며, 농축물의 농도 50∼400 ug/mL에서 5.63∼16.14 uM까지 증가하였다.
그 결과, 홍삼 전분 배지에서 5.3×1010 CFU/mL의 유산균을 생산하였다.
0 ×109 CFU/mL의 생존 효과를 보였다. 그러므로 홍삼 전분은 유산균 배양 배지로써도 적합하고, 동결 건조 시 cell의 피해를 최소화시키며, 강산의 조건에서도 균의 피해를 최소화하는 것으로 관찰되었다. 본 연구 결과는 홍삼 농축액 제조 과정에서 발생되는 불용성 부산물인 홍삼 전분을 활용하여 유산균의 산업적 생산에 유용하게 사용할 수 있는 기초 결과를 제공하여 향후 유산균 기능성 제품 개발에 활용할 수 있을 것으로 사료된다.
또한 홍삼 전분의 함유량이 증가할수록 미생물의 총 균수는 증가하였으며, pH도 감소하였다. 따라서 홍삼 전분에 포함되어 있는 유리당 성분들이 유산균 성장에 영향을 미친 것으로 확인되었다.
따라서 홍삼 전분의 효과와 기존 보호제와의 효과를 이용하면 100∼1,000배 정도 향상 효과가 증가되었음을 확인하였다.
또한 유산균은 1차적으로 분말화하는 동결 건조 공정에서 cell의 피해를 감소시켜 줘야 하는데, 홍삼 전분과 기존의 동결 건조 보호제를 동시 처리한 실험에서 대조군과 유사한 총 균수를 유지하였으며, 강산의 위액인 pH 3.0에서 홍삼 전분과 skim milk 군에서 1.0 ×109 CFU/mL의 생존 효과를 보였다.
이것은 MM 배지에 포함되어 있는 미네랄 성분에 의하여 산도가 변하지 않았으며, 유리당 같은 성장에 필요한 영양분 부족으로 성장에는 한계가 있는 것으로 확인되었다. 또한 홍삼 전분의 함유량이 증가할수록 미생물의 총 균수는 증가하였으며, pH도 감소하였다. 따라서 홍삼 전분에 포함되어 있는 유리당 성분들이 유산균 성장에 영향을 미친 것으로 확인되었다.
3×1010 CFU/mL의 유산균을 생산하였다. 이러한 총 균수는 기존 유산균 배지(MRS)와 비교해도 손색일 없을 정도의 뛰어난 균체 생장을 보여 주는 결과를 얻을 수 있었다. 또한 유산균은 1차적으로 분말화하는 동결 건조 공정에서 cell의 피해를 감소시켜 줘야 하는데, 홍삼 전분과 기존의 동결 건조 보호제를 동시 처리한 실험에서 대조군과 유사한 총 균수를 유지하였으며, 강산의 위액인 pH 3.
홍삼 전분 농도 0∼2%에서는 총 균수는 L. plantarum 15357는 2.0×107∼4.6×108 CFU/mL 그리고 L. mesenteroides sub sp은 1.0×107∼3.6×109 CFU/mL로 측정되었으며, 홍삼 전분의 농도가 증가할수록 총 균수는 증가하였다.
홍삼 전분에 Skim milk를 혼합하여 동결 건조 보호 효과를 측정하였을 때, Skim milk 및 홍삼 전분 단독으로 처리한 효과보다는 생존균수가 높게 측정되었다. 홍삼 전분 단독 투여 시 농도가 증가할수록 보호 효과는 10배 정도가 증가하였으나, 기존 보호제인 skim milk와 비교하였을 때는 그 효과가 100배 정도 낮게 측정되었다. 따라서 홍삼 전분의 효과와 기존 보호제와의 효과를 이용하면 100∼1,000배 정도 향상 효과가 증가되었음을 확인하였다.
3×109 CFU/mL로 측정되었다. 홍삼 전분에 Skim milk를 혼합하여 동결 건조 보호 효과를 측정하였을 때, Skim milk 및 홍삼 전분 단독으로 처리한 효과보다는 생존균수가 높게 측정되었다. 홍삼 전분 단독 투여 시 농도가 증가할수록 보호 효과는 10배 정도가 증가하였으나, 기존 보호제인 skim milk와 비교하였을 때는 그 효과가 100배 정도 낮게 측정되었다.
홍삼 전분이 포함하고 있는 유리당 및 성분들과 기존 보호제의 단백성분들과의 상승 보호 효과에 의해서 단독 처리군보다는 생존 총 균수가 100∼1,000배 정도 높은 결과를 보여 유산균 생균제 제형 제작에 저렴한 보호제로 사용 가능할 것이다.
후속연구
그러므로 홍삼 전분은 유산균 배양 배지로써도 적합하고, 동결 건조 시 cell의 피해를 최소화시키며, 강산의 조건에서도 균의 피해를 최소화하는 것으로 관찰되었다. 본 연구 결과는 홍삼 농축액 제조 과정에서 발생되는 불용성 부산물인 홍삼 전분을 활용하여 유산균의 산업적 생산에 유용하게 사용할 수 있는 기초 결과를 제공하여 향후 유산균 기능성 제품 개발에 활용할 수 있을 것으로 사료된다.
본 연구에 사용된 홍삼 전분은 홍삼 농축액 제조 과정에서 발생되는 불용성 부산물로 현재까지는 폐기물로 인식되어 그 활용이 제한적이었다. 하지만 홍삼 유래의 안전한 물질로 홍삼의 유효 성분인 진세노사이드를 다량 함유하고 있을 뿐 아니라, 각종 유리당 등 탄수화물이 다량 포함되어 있는 저렴한 소재로 유산균 배양에 적합한 소재로의 가능성을 알아보았다.
율피, 소청룡탕 등 한약재의 유산균 발효를 통한 효능 연구에 따르면 유산균에 의해 발효된 한약재의 경우 항산화 활성, 항염증 활성이 더 높은 것으로 알려져 있다(Choi et al 2013, Kang & Kim 2011, Han & Lee 2011). 홍삼의 특징을 유지하고 있는 홍삼 전분은 유산균 배양 배지로의 역할뿐 아니라, 효능 면에서도 우수한 소재로 활용 가능할 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
프로바이오틱스란?
프로바이오틱스(Probiotics)는 “사람이나 동물에게 건조세포나 발효산물의 형태로 투여하여 숙주의 장내 균총을 개선하여 좋은 영향을 주는, 단일 혹은 복합 형태의 생균제”를 의미하는 것으로 주로 유산균을 이용한 제품 또는 유산균 자체를 의미한다. 유산균(Lactic acid bacteria, LAB)은 각종 발효식품의 제조에 전 세계적으로 응용되는 산업적으로 중요한 미생물이며, 장내 부패 억제, 장의 운동을 촉진하여 변비 방지, 면역력 증가, 발암 억제, 비타민 B군의 생산 등 여러 가지 생리적 기능을 가지는 것으로 밝혀지고 있다(Ji GE 1994, Doron et al 2005, Muller et al 2009).
식물성 재료에서 분리한 유산균의 특징은?
최근에는 식물성 재료에서 분리한 유산균의 장점이 부각되고 있으며, 식물성 유산균은 식물 원료의 발효 식품에서 분리된 유산균을 지칭한다(Kumagai T 2009). 식물성 유산균은 일반 유산균보다 적은 영양소와 천연 항균 물질이 포함되어 있는 상황에서 생육하기 때문에 영양소를 분해, 섭취하는 능력이 뛰어나며, 각종 생리활성 물질의 생산력도 뛰어난 것으로 알려져 있다(Igarashi T 2007, Huang et al 2008).
유산균의 생리적 기능은?
프로바이오틱스(Probiotics)는 “사람이나 동물에게 건조세포나 발효산물의 형태로 투여하여 숙주의 장내 균총을 개선하여 좋은 영향을 주는, 단일 혹은 복합 형태의 생균제”를 의미하는 것으로 주로 유산균을 이용한 제품 또는 유산균 자체를 의미한다. 유산균(Lactic acid bacteria, LAB)은 각종 발효식품의 제조에 전 세계적으로 응용되는 산업적으로 중요한 미생물이며, 장내 부패 억제, 장의 운동을 촉진하여 변비 방지, 면역력 증가, 발암 억제, 비타민 B군의 생산 등 여러 가지 생리적 기능을 가지는 것으로 밝혀지고 있다(Ji GE 1994, Doron et al 2005, Muller et al 2009). 또한 아세트산 및 젖산과 같은 유기산 그리고 박테리오신 같은 항균 물질 등 다양한 대사산물을 생산하여 장내 부패균 및 유해한 병원성 세균의 생육을 저해하고 있는 것으로 알려져 있어, 다양한 방면에서 연구가 진행 중이다(Chae et al 2010, Diep et al 2006, Mathara et al 2008, Park et al 2013).
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