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문제 정의
- 그러나 대부분의 연구 결과가 배추김치를 위주로 유산균의 분포도 및 기능성에 대해 확인하였으므로 김치의 종류에 따른 유산균의 생리적 활성에 대한 연구보고가 없다. 그러므로 본 연구에서는 한국에서 가장 많이 소비되고 장시간 숙성시켜도 맛을 유지하는 배추를 주재료로 하는 배추김치, 무를 주재료로 하는 깍두기와 열무김치, 기타 채소 중 갓김치로부터 유산균을 분리하여 각 김치 종류에 따른 유산균의 생물학적 및 기능적 특성을 확인하였다.
제안 방법
- Kimoto 등(14)과 Bogovič 등(15)의 방법을 변형시켜 Caco-2 세포주에 대한 부착능을 측정하였다. 유산균을 30℃에서 24시간 동안 배양한 뒤, 균체를 회수하여 phosphate buffered saline(PBS, pH 7.
- 5 mL, agar 15 g/L)에 도말한 후, 20℃에서 3～5일간 배양하고 균주의 성장 유무 및 점질물 형성을 관찰하여 Leuconostoc 속을 선별하였다(9). Lactobacillus 속의 유산균을 선별하기 위해 LBS배지(Rogosa SL agar 74.5 g, sodium acetate 30 g/L, pH 5.5)에 도말하여 30℃에서 3일 동안 배양한 후, 균주의 생육을 확인하였다(10).
- 각 well에 메탄올 1 mL씩 넣고 5분 동안 세포가 cover slip에 고정되도록 하고 Gram 염색 후 광학 현미경으로 관찰하였다(×4,000).
- 각 유산균의 plasmid는 mini-prep kit(Qiagen, Düsseldorf, Germany)을 사용하여 분리하였고 1.0% agarose gel에 전기 영동 하였다.
- 0) 배지를 넣어 현탁시켜 30℃에서 24시간 동안 배양하여 생균수를 측정하였다. 내담즙성은 내산성과 동일한 방법으로 수행하되, 0.5% oxgall이 들어 있는 MRS 액체배지에 24시간 동안 배양한 후 생존균수를 측정하였다.
- 유산균이 probiotics가 되기 위한 필수조건으로 위장관 상부의 산성 조건 및 소화효소가 많은 담즙이 존재하는 환경에서의 생존이 요구되며, 또한 장내에 부착하여 군락을 형성해 생존하여야 비생존 유산균에 비하여 면역활성 증진 및 항암 효과가 크다고 보고되고 있다(37). 따라서 김치 유산균의 내 산성, 내담즙성 및 장내부착능을 확인하였다. 대조구인 Lactobacillus rhamnosus GG(LGG)의 내산성 및 내담즙성은 초기 균수에 대하여 각각 0.
- 본배양된 유산균 5 mL를 1,100×g에서 10분 동안 원심분리 하여 균체를 회수하였다.
-
유산균의 생물학적 분석
분리된 유산균은 catalase 시험, Gram 염색 및 광학현미경(Olympus, Tokyo, Japan)을 통한 형태학적 관찰을 하였다. 이들 중 Leuconostoc 속과 Lactobacillus 속을 1차 선별하기 위해 각각 PES(phenyl ethyl alcohol-sucrose agar)배지와 LBS(Lactobacillus selection)배지를 사용하였다.
- 본배양된 유산균 5 mL를 1,100×g에서 10분 동안 원심분리 하여 균체를 회수하였다. 여기에 동일한 부피의 0.1 N HCl로 조정된 MRS(pH 2.0) 배지를 넣어 현탁시켜 30℃에서 24시간 동안 배양하여 생균수를 측정하였다. 내담즙성은 내산성과 동일한 방법으로 수행하되, 0.
- 이들 중 Leuconostoc 속과 Lactobacillus 속을 1차 선별하기 위해 각각 PES(phenyl ethyl alcohol-sucrose agar)배지와 LBS(Lactobacillus selection)배지를 사용하였다. 유산균을 MRS배지에 0.1% 접종하여 30℃에서 24시간 배양한 다음, PES 고체배지(peptone 5.7 g, yeast extract 0.5 g, sucrose 20 g, ammonium sulfate 2 g, dipotassium phosphate 1 g, magnesium sulfate 0.244 g, phenylethyl alcohol 1.5 mL, agar 15 g/L)에 도말한 후, 20℃에서 3～5일간 배양하고 균주의 성장 유무 및 점질물 형성을 관찰하여 Leuconostoc 속을 선별하였다(9). Lactobacillus 속의 유산균을 선별하기 위해 LBS배지(Rogosa SL agar 74.
- 특히 김치는 발효 시작 단계에서는 원료나 제조과정 중 유입된 Aeromonas 속, Erwinia 속, Bacillus 속 등이 검출되지만, 발효 중반 이후부터 유산균 이외의 균주들이 나타나지 않는다(5). 이는 김치의 낮은 산도뿐만 아니라 유산균이 생산하는 다양한 항균물질에 기인한 것이므로 김치 종류에 따라 항균력을 지닌 유산균의 분포를 확인하였다. 전체 김치 유산균 중 모든 감수성 균주에 대하여 3 mm 이하를 보인 균주는 갓김치에서 47.
- 분리된 유산균은 catalase 시험, Gram 염색 및 광학현미경(Olympus, Tokyo, Japan)을 통한 형태학적 관찰을 하였다. 이들 중 Leuconostoc 속과 Lactobacillus 속을 1차 선별하기 위해 각각 PES(phenyl ethyl alcohol-sucrose agar)배지와 LBS(Lactobacillus selection)배지를 사용하였다. 유산균을 MRS배지에 0.
- 이를 1,100×g에서 5분 동안 원심분리 하여 침전물을 회수하고 60℃에서 12시간 동안 건조시킨 다음, 이의 건조중량(w/v)을 측정하였다(11)
대상 데이터
- Caco-2 세포주는 ATCC(ATCC HTB37, American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)로부터 분양받았다. Caco-2는 DMEM-high glucose(suppled with 10% fetal bovine serum, 1% non-essential amino acid, 1% streptomycin/penicillin(10,000 IU/mL), 10 mM HEPES, 1 mM sodium pyruvate, 1 mM L-glutamine, Hyclone, Logan, UT, USA) 배지를 사용하고 이틀에 한 번씩 배지를 바꿔주었으며 15일 동안 배양하여 분화시켰다(13).
- Size marker로는 λ DNA(HindⅢ cut)(Koschem, Seongnam, Korea)와 1 kb DNA ladder(Takara, Otsu, Japan)를 사용하였다.
- 이를 희석하여 MRS배지에 도말하고 30℃에서 1～2일 동안 배양하였다. 양성 대조구로 Lactobacillus rhamnosus GG(ATCC 53103)를 사용하고 음성 대조구로는 Lactobacillus acidophilus ATCC4356을 사용하였다(16). 부착율(%)은 Caco-2세포에 넣은 초기균수에 대한 부착균수의 비율로 하였다.
- 유산균의 항균활성은 spot on lawn assay 방법으로 측정 하였다(12). 이에 감수성 균주는 Bacillus cereus ATCC27348(LB, Luria-bertani, Difco, Lawrence, KS, USA), Bacillus subtilis ATCC6633(BHI, brain heart infusion, Difco), Salmonella Typhimurium KCTC2515(LB), Micrococcus luteus ATCC13513(LB), Lactobacillus plantarum ATCC8014(MRS), Listeria monocytogenes ATCC19113(BHI), Vibrio parahaemoliticus ATCC27969(TSA, tryptic soy agar＋2.5% NaCl, Difco), Escherichia coli ATCC25922(LB)로 총 8종을 사용하였고 L. plantarum ATCC 8014만 30℃에서 24시간 배양하고 나머지는 모두 37℃에서 16～18시간 동안 배양하였다. 30℃에서 24시간 동안 배양된 유산균 배양액을 11,600×g에서 5분 동안 원심분리 하여 상징액과 균체를 분리하였다.
- 전남, 경기․서울 지방, 제주, 경상도의 갓김치(이하 MK로 명명) 124종, 배추김치(이하 CK) 99종, 열무김치(이하 YRK) 62종, 깍두기(이하 CRK) 33종의 김치를 수집하였다. 완숙기에 접어든 먹기 좋은 상태의 김치 10 g을 90 mL 멸균수와 함께 혼합, 마쇄하였다.
이론/모형
- 유산균의 항균활성은 spot on lawn assay 방법으로 측정 하였다(12). 이에 감수성 균주는 Bacillus cereus ATCC27348(LB, Luria-bertani, Difco, Lawrence, KS, USA), Bacillus subtilis ATCC6633(BHI, brain heart infusion, Difco), Salmonella Typhimurium KCTC2515(LB), Micrococcus luteus ATCC13513(LB), Lactobacillus plantarum ATCC8014(MRS), Listeria monocytogenes ATCC19113(BHI), Vibrio parahaemoliticus ATCC27969(TSA, tryptic soy agar＋2.
성능/효과
- 그러나 Bacillus sp., L. monocytogenes, S. Typhimurium에 대해 항균력을 지닌 유산균은 갓김치보다 열무김치, 배추김치, 깍두기에 2배 이상 존재하였다. 특히 김치 유산균의 항균력은 동일 Bacillus 속 중에서 B.
- 1)MK was mustard stem/leaf kimchi, YRK was young radish kimchi, CK was cabbage kimchi, and CRK was cubed radish kimchi.
- 1종 이상의 감수성 균주에 항균활성을 보인 유산균 중 갓김치는 Vibrio parahaemolyticus에 대한 항균 활성을 지닌 유산균이 다른 김치에 비해 많았다(Fig. 1). 그러나 Bacillus sp.
- LBS 및 PES 배지에서의 생육으로 선별된 Lactobacillus 속 및 Leuconostoc 속은 4종의 김치에서 각각 39.1±15.4%와 70.8±8.7%로 나타났다(Table 1).
- 7%로 나타났다(Table 1). Leuconostoc 속으로 추정되는 구균은 4종의 김치에서 비슷하게 존재했지만 Lactobacillus 속으로 추정되는 균은 깍두기에서 60.7%가 선별되어 다른 김치 종류 유래의 유산균들에 비해 선별율이 높았다. 그러나 각 배지에 대해 비선별적 생육을 한 유산균이 종이나 존재하였고 그 중에서도 LBS배지에서 성장하고 동시에 PES배지에서 점질물을 형성한 유산균이 총 8종이 나타났다(data not shown).
- Plas- mid를 지닌 유산균은 평균 3.5±0.5의 plasmid band를 지니고 있었으며 이 중 plasmid band를 1개만 갖는 균주는 14.5%였으며 많게는 8～10개의 plasmid band를 지니는 유산균도 있었다(data not shown).
- 에 대하여 투명환을 형성, Gram 양성, catalase 음성 결과를 보인 균주로 선별하였고 그 결과 갓김치 129종, 열무김치 53종, 배추김치 122종, 깍두기 44종으로 총 348종을 분리하였다(Table 1). 간균과 단간균 : 구균의 비가 배추김치 2.6:1, 열무김치 5.6:1, 깍두기 1.8:1, 갓김치 2.2:1을 나타내 전반적으로 구균이 적었고, 이러한 현상은 특히 열무김치에서 두드러졌다. 그러나 모든 김치 시료에서 구균이 적은 것은 Leuconostoc 속이 주를 이루는 구균이 낮은 pH에서 자라지 못하며 수집된 김치가 모두 발효 중간 단계에 해당하는 시기의 것이었기 때문으로 고찰된다(17)
- 7%가 선별되어 다른 김치 종류 유래의 유산균들에 비해 선별율이 높았다. 그러나 각 배지에 대해 비선별적 생육을 한 유산균이 종이나 존재하였고 그 중에서도 LBS배지에서 성장하고 동시에 PES배지에서 점질물을 형성한 유산균이 총 8종이 나타났다(data not shown). 이들은 모두 2개의 단세포가 쌍으로 형성된 형태였다.
- 김치로부터 유산균은 CaCO3에 대하여 투명환을 형성, Gram 양성, catalase 음성 결과를 보인 균주로 선별하였고 그 결과 갓김치 129종, 열무김치 53종, 배추김치 122종, 깍두기 44종으로 총 348종을 분리하였다(Table 1). 간균과 단간균 : 구균의 비가 배추김치 2.
- 따라서 김치 유산균의 내 산성, 내담즙성 및 장내부착능을 확인하였다. 대조구인 Lactobacillus rhamnosus GG(LGG)의 내산성 및 내담즙성은 초기 균수에 대하여 각각 0.001와 7.207%를 나타냈고 이보다 높은 저항력을 보인 김치 유산균은 각각 105종과 80종이었다(Table 4). 이 중 내산성과 내담즙성을 동시에 갖는 유산균은 51종에 해당되었다(data not shown).
- 0에서 4시간만에 50%의 유산균이 생존하지 못해 내담즙성이 높지만 내산성이 낮은 것으로 확인되었다(38). 또한 기존에 보고된 연구들보다 낮은 pH 2.0 조건에서 김치 유산균 중 30.2%나 생존함에 따라 김치에는 내산성이 높은 유산균이 많았지만 내담즙성을 지닌 유산균은 더 적은 것으로 나타났다(32,39-41). 하지만 김치 종류별로 봤을 때, 열무김치와 깍두기에서 분리한 유산균 중 내산성을 보인 균주가 43.
- 0 mg/mL를 보여 균주 당 생산되는 EPS 함량이 높았다. 또한 전체 EPS 생산균주 중 배추김치에서 분리한 3종을 제외하고 모두 구균이었다(data not shown).
- 무를 주재료로 한 깍두기에서 11.1%, 열무김치에서 10.9%의 비율로 EPS 생성 유산균이 많았지만 배추김치에서 분리한 유산균의 EPS 생성량이 8.4±2.0 mg/mL를 보여 균주 당 생산되는 EPS 함량이 높았다.
- rhamnosus GG와 비슷하거나 더 높은 부착율을 보인 유산균은 총 42종이 확인되었다(Table 4). 본 연구에서 분리한 유산균은 열무김치, 배추김치, 깍두기에서 각각 9.4%, 9.0%, 4.5%로 존재한 반면, 갓김치에서 18.6%의 장내부착능을 지닌 유산균이 확인되었다. 기존에 보고된 연구에 따르면, 발효유제품 종균인 Lactobacillus sp.
- 열무김치에서 분리한 유산균의 plasmid band가 평균 4.1±0.5개로 다른 김치류의 유산균에 비해 많았다.
- 유산균의 plasmid는 유당 발효, anti-phage activity, EPS, 향미, 박테리오신, 구연산 생산 및 항생제 내성 등 산업적으로 유효한 기능성 물질의 생산에 이용되며, 다양한 plasmid pattern을 지니고 있어 향후 김치 유산균의 분류 및 유용 유전자 전달 vector로의 활용 등 다양한 응용 분야에 적용될 수 있다(19). 이런 의미에서 김치 유산균의 plasmid를 분리하여 확인한 결과, 전체 유산균 중 plasmid를 지닌 유산균은 89.8%로 약 10% 정도의 유산균은 plasmid가 없었다(Table 2). 그러나 배추김치 유래 유산균은 81.
- 전체 348종의 김치 유산균 중 Caco-2 세포에 부착된 균수가 초기 균수에 대해 1.44±0.73%의 부착율을 보인 L. rhamnosus GG와 비슷하거나 더 높은 부착율을 보인 유산균은 총 42종이 확인되었다(Table 4).
- 전체 357종의 유산균 중 9.5%의 유산균이 건물중량으로 5 mg/mL 이상의 EPS 생성능을 보였다(Table 3). 무를 주재료로 한 깍두기에서 11.
- 이는 김치의 낮은 산도뿐만 아니라 유산균이 생산하는 다양한 항균물질에 기인한 것이므로 김치 종류에 따라 항균력을 지닌 유산균의 분포를 확인하였다. 전체 김치 유산균 중 모든 감수성 균주에 대하여 3 mm 이하를 보인 균주는 갓김치에서 47.3%, 열무김치에서 22.6%, 배추김치에서 23.0%, 깍두기에서 11.4%로 총 30.5% 비율로 존재하였다(data not shown). 유제품 및 장관에서 분리된 경우 Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Salmonella Typhimurium에 대한 항균활성을 지닌 유산균이 많은 반면(31,32), Jacobsen 등(33)의 발효옥수수나 Ahn 등(34)의 김치 유산균, 본 연구에서 분리한 김치 유산균은 이들 세 감수성 균주에 대한 항균력을 보인 균주가 35～50% 밖에 되지 않았고, 특히 발효옥수수에서 분리된 Lactobacillus 속의 절반 이상이 3 mm 이하의 지름을 지닌 저해환을 나타내 본 실험의 김치와 유사한 결과를 나타냈다(33,34).
후속연구
- 와 Leuconostoc sp.가 대부분으로 유산균 종이 한정적으로 함유되어 있음에도 불구하고(5) 본 연구의 결과에서 볼 때, 김치 종류에 따라 내산성 및 내담즙성, 장내부착능을 지닌 유산균 함량에 차이가 있었으며 이는 김치에 존재하는 프로바이오틱 기능성을 지닌 유산균을 선별해내는데 유용할 것이다.
- 유산균의 plasmid는 유당 발효, anti-phage activity, EPS, 향미, 박테리오신, 구연산 생산 및 항생제 내성 등 산업적으로 유효한 기능성 물질의 생산에 이용되며, 다양한 plasmid pattern을 지니고 있어 향후 김치 유산균의 분류 및 유용 유전자 전달 vector로의 활용 등 다양한 응용 분야에 적용될 수 있다(19). 이런 의미에서 김치 유산균의 plasmid를 분리하여 확인한 결과, 전체 유산균 중 plasmid를 지닌 유산균은 89.
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