꽃송이버섯 추출물은 염증반응 시 유도되는 NO 생성을 저해하는 활성이 있는 것으로 나타났으며, 200 ${\mu}g/ml$의 꽃송이버섯 추출물을 처리하였을 때 NO 저해능이 최대 효과를 보였고 RAW264.7 cell에서는 대조군과 유사한 수준으로 NO 생성을 억제하였다. 이러한 NO 생성의 저해는 iNOS의 발현이 감소한 것에 의한 결과임을 단백질과 mRNA의 발현량 변화를 통하여 확인하였으며, mRNA 발현 변화는 iNOS 유전자의 전사를 담당하는 전사인자인 $NF-{\kappa}B$와 STAT-1의 활성감소에 의한 결과임을 western blot을 통하여 확인하였다. 특히, $NF-{\kappa}B$의 활성감소는 $I{\kappa}B{\alpha}$의 활성증가에 의한 $NF-{\kappa}B$의 억제능 향상에 의한 것임을 확인하였고, 활성억제된 $NF-{\kappa}B$가 핵 내부로의 이동이 저해되면서 iNOS 유전자 발현에 영향을 미친 것임을 확인하였다. 그러므로, 꽃송이버섯 추출물은 NO 저해능을 이용한 항염증소재로서 염증성질환의 완하에 도움이 될 것으로 사료된다.
꽃송이버섯 추출물은 염증반응 시 유도되는 NO 생성을 저해하는 활성이 있는 것으로 나타났으며, 200 ${\mu}g/ml$의 꽃송이버섯 추출물을 처리하였을 때 NO 저해능이 최대 효과를 보였고 RAW264.7 cell에서는 대조군과 유사한 수준으로 NO 생성을 억제하였다. 이러한 NO 생성의 저해는 iNOS의 발현이 감소한 것에 의한 결과임을 단백질과 mRNA의 발현량 변화를 통하여 확인하였으며, mRNA 발현 변화는 iNOS 유전자의 전사를 담당하는 전사인자인 $NF-{\kappa}B$와 STAT-1의 활성감소에 의한 결과임을 western blot을 통하여 확인하였다. 특히, $NF-{\kappa}B$의 활성감소는 $I{\kappa}B{\alpha}$의 활성증가에 의한 $NF-{\kappa}B$의 억제능 향상에 의한 것임을 확인하였고, 활성억제된 $NF-{\kappa}B$가 핵 내부로의 이동이 저해되면서 iNOS 유전자 발현에 영향을 미친 것임을 확인하였다. 그러므로, 꽃송이버섯 추출물은 NO 저해능을 이용한 항염증소재로서 염증성질환의 완하에 도움이 될 것으로 사료된다.
Sparassis crispa is a medicinal mushroom, which has been reported to have anti-cancer effect. In this study, we designed to investigate the effects of Sparassis crispa extracts on the production of nitric oxide (NO) in LPS-stimulated RAW264.7 cells. The pre-treatment of the extracts prior to add LPS...
Sparassis crispa is a medicinal mushroom, which has been reported to have anti-cancer effect. In this study, we designed to investigate the effects of Sparassis crispa extracts on the production of nitric oxide (NO) in LPS-stimulated RAW264.7 cells. The pre-treatment of the extracts prior to add LPS in RAW264.7 cells suppressed NO production and iNOS expression at protein and mRNA levels. The phosphorylation of $I{\kappa}B{\alpha}$ was inhibited by the extracts, which was induced through suppressing the activation of $NF-{\kappa}B$. Sparassis crispa extracts showed the effect on the down-regulation of STAT-1 activation in a dose-dependent manner. In LPS-stimulated RAW264.7 cells, $NF-{\kappa}B$ was translocated into the nucleus, while the treatment of Sparassis crispa extracts induced to sequestered $NF-{\kappa}B$ in the cytosol. These experimental results determined that Sparassis crispa extracts play a inhibitory role in inflammatory reactions via regulating NO production, which suggests potential as a component of inflammatory drugs.
Sparassis crispa is a medicinal mushroom, which has been reported to have anti-cancer effect. In this study, we designed to investigate the effects of Sparassis crispa extracts on the production of nitric oxide (NO) in LPS-stimulated RAW264.7 cells. The pre-treatment of the extracts prior to add LPS in RAW264.7 cells suppressed NO production and iNOS expression at protein and mRNA levels. The phosphorylation of $I{\kappa}B{\alpha}$ was inhibited by the extracts, which was induced through suppressing the activation of $NF-{\kappa}B$. Sparassis crispa extracts showed the effect on the down-regulation of STAT-1 activation in a dose-dependent manner. In LPS-stimulated RAW264.7 cells, $NF-{\kappa}B$ was translocated into the nucleus, while the treatment of Sparassis crispa extracts induced to sequestered $NF-{\kappa}B$ in the cytosol. These experimental results determined that Sparassis crispa extracts play a inhibitory role in inflammatory reactions via regulating NO production, which suggests potential as a component of inflammatory drugs.
LPS 단일처리 군과 LPS와 꽃송이버섯 추출물 복합처리군으로 배양한 RAW264.7세포에서 발현된 iNOS의 mRNA를 측정하기 위해 RT-PCR을 수행하였다. Total RNA는 2-mercaptoethanol (Sigma, St.
iNOS 유전자의 promoter에는 전사인자인 NF-ĸB와 STAT-1이 결합할 수 있으며, mRNA의 발현 감소는 전사인자 억제에 의한 결과로 나타날 수 있다 (De Stefano 등, 2006, Xie 등, 1994). iNOS 의 전사인자인 NF-ĸB와 STAT-1의 인산화를 확인하여 활성 정도를 측정하였다. 그림 4에서 인산화된 NF-ĸB와 STAT-1는 LPS 처리에 의해서 증가하였지만, 꽃송이버섯 추출물의 처리에 의해 감소하였고, 농도 의존적인 감소를 보였다.
iNOS의 primer는 forward 5′-ATG-TCCGAAGCA-AAC-ATC-AC-3′ 과 reverse 5′-TAA-TGT-CCAGGA-AGT- AGG-TG-3′, GAPDH의 primer는 forward 5′ -AGG-CCG-GTG-CTG-AGTATG-TC-3′ 와 reverse 5′-TGCCTG-CTT-CAC- CAC-CTT-CT-3′를 이용하였다.
상황버섯의 추출물 또한 iNOS을 단백질 수준에서 조절하여 NO 생성을 조절하는 것으로 나타났다 (Kim등, 2007). 꽃송이버섯 추출물에 의해 NO의 생성이 억제되는 결과를 바탕으로 NO를 생성하는 단백질인 iNOS의 발현이 조절되는지 단백질과 mRNA 수준에서 확인하였다. 그림3에서 확인할 수 있듯이 LPS 1 μg/ml을 처리한 RAW264.
꽃송이버섯의 추출물인 항암효과에 대해서는 많은 연구가 이루어졌으나, 항염증반응의 유도 및 세부적인 효과에 대해서는 보고되지 않았다. 따라서, 꽃송이버섯 추출물의 항염증반응을 확인하고자, 마우스 대식세포인 RAW264.7 cell에 LPS를 처리하여 꽃송이버섯 추출물의 NO 생성에 관련되어 있는 iNOS 및 전사인자들의 발현 조절을 확인하였다.
모든 세포는 10% FBS, 1% penicillin (100 U/ml)/streptomycin (100 μg/ml)을 첨가한 DMEM (Cellgro Mediatech, Manassas, VA, USA) 배지를 이용하여 37℃에서 5% CO2와 95% air가 함유된 습한 대기 조건에서 배양하였다.
배양된 세포는 lysis buffer (50 mM Tris-Cl [pH7.5], 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.5% NP-40, 1% Triton X-100, 1% deoxycholate, 0.1% SDS and a cocktail of proteinase inhibitors [1 mM PMSF, 1 mM EDTA, 1 μM aprotinin, 1 μM leupeptin, and 1 μM pepstatin A(Intron Biotechnology, Gyeonggi, Korea)])를 이용하여 단백질을 추출하였다.
Louis, MO, USA)를 이용하여 분리하였다. 분리된 Total RNA의 reverse transcription을 위하여 MlMLV reverse transcriptase를 이용하여 cDNA를 합성하였고, 합성된 cDNA를 이용하여 iNOS와 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)를 해당 primer를 사용하여 PCR기법으로 증폭시켰다. iNOS의 primer는 forward 5′-ATG-TCCGAAGCA-AAC-ATC-AC-3′ 과 reverse 5′-TAA-TGT-CCAGGA-AGT- AGG-TG-3′, GAPDH의 primer는 forward 5′ -AGG-CCG-GTG-CTG-AGTATG-TC-3′ 와 reverse 5′-TGCCTG-CTT-CAC- CAC-CTT-CT-3′를 이용하였다.
고정 과정이 완료된 세포는 NF-ĸB에 대한 primary antibody를 처리하고 4℃에서 24시간동안 반응시키고, Alexa Fluor 488이 부착된 anti-rabbit IgG를 1시간동안 처리하였다. 세포는 Prolong Antifade Reagent (Invitrogen, Eugene, OR, USA)를 처리한 후 Nikon ECLIPS 50i 현미경을 이용하여 관찰하였다. 푸른색과 초록색의 형광이미지를 합치기 위해 High-Content Analysis Software (Cambridge Healthtech Institute, Needham, MA, USA)를 이용하였다.
세포를 12시간 배양한 후, 꽃송이버섯 추출물의 최종농도 50 및 100, 150, 200 μg/ml이 되도록 처리하여 24시간 동안 배양하였다.
iNOS의 primer는 forward 5′-ATG-TCCGAAGCA-AAC-ATC-AC-3′ 과 reverse 5′-TAA-TGT-CCAGGA-AGT- AGG-TG-3′, GAPDH의 primer는 forward 5′ -AGG-CCG-GTG-CTG-AGTATG-TC-3′ 와 reverse 5′-TGCCTG-CTT-CAC- CAC-CTT-CT-3′를 이용하였다. 증폭된 PCR 생성물은 agarose gel에 electrophoresis를 이용하여 확인하였다.
대상 데이터
BV-2 microglia는 동의대학교 면역제어공학 실험실로부터 분양받아 이용하였다. 모든 세포는 10% FBS, 1% penicillin (100 U/ml)/streptomycin (100 μg/ml)을 첨가한 DMEM (Cellgro Mediatech, Manassas, VA, USA) 배지를 이용하여 37℃에서 5% CO2와 95% air가 함유된 습한 대기 조건에서 배양하였다.
꽃송이버섯(Sparassis crispa)을 80% 메탄올로 24시간 추출후 상등액을 여과지로 걸러 감압농축 후 농도별로 희석하여 사용하였다.
마우스 대식세포 RAW264.7, human embryonic kidney (HEK) 293, human keratinocyte (HaCaT) 세포는 American Tissue Culture Collection에서 분양받은 세포주를 사용하였다.
0을 이용하였으며 Control 군과 LPS가 처리된 group은 t-test를 이용하여 분석하였고, LPS 단일처리 군 및 추출물과 LPS 복합처리 군은 ANOVA post hoc test와 Dunnett’s multiple comparison test를 이용하여 분석하였다. 모든 실험은 각 실험군 당 3개의 샘플을 적용하였고, 총 3회에 걸쳐 분석되었다.
Anti-rabbit IgG와 반응한 단백질들은 enhanced chemiluminescent (ECL) detection solution (Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용하여 확인하였다. 분석에 이용된 primary antibody는 모두 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)에서 구입하였다.
데이터처리
통계처리는 Graphpad prism 5.0을 이용하였으며 Control 군과 LPS가 처리된 group은 t-test를 이용하여 분석하였고, LPS 단일처리 군 및 추출물과 LPS 복합처리 군은 ANOVA post hoc test와 Dunnett’s multiple comparison test를 이용하여 분석하였다.
이론/모형
꽃송이버섯 추출물의 세포독성 측정은 WST-1 (Daeil Lab Service, Seoul, Korea)을 이용한 세포 증식 측정법은 사용하였고, 각각의 세포들은 1×105 cells/well로 96-well plate에 분주하 였다.
세포는 Prolong Antifade Reagent (Invitrogen, Eugene, OR, USA)를 처리한 후 Nikon ECLIPS 50i 현미경을 이용하여 관찰하였다. 푸른색과 초록색의 형광이미지를 합치기 위해 High-Content Analysis Software (Cambridge Healthtech Institute, Needham, MA, USA)를 이용하였다.
성능/효과
꽃송이버섯 추출물은 염증반응 시 유도되는 NO 생성을 저해하는 활성이 있는 것으로 나타났으며, 200 μg/ml의 꽃송이버섯 추출물을 처리하였을 때 NO 저해능이 최대 효과를 보였고 RAW264.7 cell에서는 대조군과 유사한 수준으로 NO 생성을 억제하였다.
7 cell에 처리하였을 때, NO 생성이 감소되었다 (Kim 등, 2007). 꽃송이버섯 추출물의 NO 저해능을 측정한 결과 그림 2와 같이 LPS를 처리한 RAW264.7, BV-2세포는 NO의 생성이 대조군보다 증가하였으나, 꽃송이버섯 추출물의 처리 농도가 높아질수록 NO의 생성량도 줄어드는 것을 확인 할 수 있다.
꽃송이버섯 추출물의 세포독성을 RAW264.7 및 BV-2, HEK293, HaCaT 세포에서 확인한 결과, 그림 1과 같이 모든 처리군에서 특징적인 세포 생존율 변화는 관찰되지 않았다.
꽃송이버섯 추출물이 처리된 세포의 iNOS의 mRNA 발현량은 LPS에 처리되었을 때보다 감소하였음을 확인하였다. iNOS 유전자의 promoter에는 전사인자인 NF-ĸB와 STAT-1이 결합할 수 있으며, mRNA의 발현 감소는 전사인자 억제에 의한 결과로 나타날 수 있다 (De Stefano 등, 2006, Xie 등, 1994).
따라서 꽃송이버섯 추출물은 iNOS의 전사인자인 NF-ĸB와 STAT-1의 활성화 감소와 IĸBα의 NF-ĸB 억제능 향상을 통하여 iNOS 유전자의 전사과정을 저해하는 것으로 나타났다.
NF-ĸB가 활성화되면 세포질에서 핵 내부로 이동하여 iNOS 유전자의 promoter에 결합하게 된다 (Liang 등, 1999). 따라서, NF-ĸB가 핵 내부로의 이동성이 저해된다면 iNOS 유전자의 발현 또한 감소하는 결과가 나타난다. 그림5의 결과를 보면 LPS만 처리한 RAW264.
iNOS의 발현은 단백질에서 뿐 만 아니라 mRNA 수준에서도 조절됨을 확인할 수 있다. 따라서, Schmidt 등과 Lee 등의 RAW264.7과 BV-2에서의 iNOS 조절은 NO 생성을 조절한다는 결과와 일치하며, 꽃송이버섯 추출물의 농도에 따라 iNOS의 발현이 단백질과 mRNA 수준에서 조절됨을 확인할 수 있다.
7 세포에서는 NF-ĸB는 세포질에만 위치하며, 푸른색으로 염색된 핵의 형태도 확연히 구분된다. 따라서, 꽃송이버섯 추출물은 NF-ĸB의 핵 내부로의 이동을 억제하였으며, 이로 인해 iNOS 유전자 발현이 저해되었음을 확인할 수 있다. 상황버섯의 추출물을 LPS에 의해 자극된 RAW264.
특히, NF-ĸB의 활성 감소는 IĸBα의 활성증가에 의한 NF-ĸB의 억제능 향상에 의한 것임을 확인하였고, 활성억제된 NF-ĸB가 핵 내부로의 이동이 저해되면서 iNOS 유전자 발현에 영향을 미친 것임을 확인하였다.
후속연구
특히, NF-ĸB의 활성 감소는 IĸBα의 활성증가에 의한 NF-ĸB의 억제능 향상에 의한 것임을 확인하였고, 활성억제된 NF-ĸB가 핵 내부로의 이동이 저해되면서 iNOS 유전자 발현에 영향을 미친 것임을 확인하였다. 그러므로, 꽃송이버섯 추출물은 NO 저해능을 이용한 항염증소재로서 염증성질환의 완하에 도움이 될 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
꽃송이버섯에 함유된 β-1,3-Dglucan의 생리학적 효능은?
특히 최근 연구에 버섯추출물은 phenolic acid계열의 성분들을 함유하여 항산화 (Guillamon 등, 2010), 항암 (Moradali 등, 2007), 항균 (Barros, 2007), 항염증 (Andrej 등, 2011)에 효과적인 것으로 나타났다. 다양한 식용 또는 약용버섯들 중, 특히 꽃송이버섯 (Sparassis crispa)은 β-1,3-Dglucan을 함유하고 있으며, 이로 인해 항암활성을 촉진시키는 것으로 보고되었으고, 신생혈관 생성억제와 전이를 억제하여 암세포의 미세환경 조성을 저해하는 것으로 밝혀졌다(Kim 등, 2010, Yamamoto 등, 2009). β-1,3-D-glucan은 면역세포 중 하나인 수지상세포의 분화를 촉진하여 면역반응 및 항암활성을 유도한다 (Kim 등, 2010).
꽃송이버섯에 함유된 phenolic compound 중 다른 약용 버섯에 비해 많이 함유된 성분은?
꽃송이버섯은 또한 진성 당뇨병에서 나타나는 상처회복 능력이 저해되는 현상을 회복하는데 도움을 주는 것으로 보고되었다 (Kwon 등, 2009). 꽃송이버섯에는 β -1,3-D-glucan과 더불어 다양한 phenolic compound가 많이 함유되어 있는데, 그중 veratric acid 등의 benzoic acid 계열의 성분이 다른 약용 버섯에 비해 많이 함유된 것으로 보고되었다 (Kim 등, 2008). Benzoic acid 계열 중 하나인 veratric acid는 항산화 기작과 더불어, 인위적으로 고혈압이 유도된 마우스에게 veratric acid를 경구투여 하였을 때, nitric oxide (NO)의 농도는 증가시키고, 산화 스트레스를 감소시켜 혈압을 조절하는 것으로 나타났다 (Raja 등, 2011).
꽃송이버섯 추출물이 염증반응 시 유도되는 NO 생성을 저해하는 활성이 있는 것을 확인한 과정은?
7 cell에서는 대조군과 유사한 수준으로 NO 생성을 억제하였다. 이러한 NO 생성의 저해는 iNOS의 발현이 감소한 것에 의한 결과임을 단백질과 mRNA의 발현량 변화를 통하여 확인하였으며, mRNA 발현 변화는 iNOS 유전자의 전사를 담당하는 전사인자인 NF-ĸB와 STAT-1의 활성감소에 의한 결과임을 western blot을 통하여 확인하였다. 특히, NF-ĸB의 활성 감소는 IĸBα의 활성증가에 의한 NF-ĸB의 억제능 향상에 의한 것임을 확인하였고, 활성억제된 NF-ĸB가 핵 내부로의 이동이 저해되면서 iNOS 유전자 발현에 영향을 미친 것임을 확인하였다.
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