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문제 정의
- 따라서 육상과 환경적인 차이를 보이는 특이한 생태 및 생리학적 조건에서 적응하는 해양미생물의 탐색 및 유용자원에 대한 연구를 실시하였다. 본 연구에 사용된 미생물은 부산 앞바다의 해수에서 분리되었다.
- 분리된 균주의 성장과 protease 생산을 촉진하는 질소원을 선정하기 위하여 다양한 유기/무기 질소원을 대상으로 조사하였다. Ammonium chloride, ammonium sulfate, casamino acid, gelatin, malt extract, peptone, skim milk, soytone, soybean meal, tryptone, yeast extract를 LB broth에 각각 1% (w/v) 씩 첨가하고 30℃에서 48 시간 동안 배양하여 균주의 성장과 protease 생산에 미치는 효과를 조사하였다[19].
제안 방법
- 16S rDNA 분석을 위해 universal forward primer bact_F (5’ AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3’)와 universal reverse primer bact_R (5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)를 사용하여 PCR 하였다.
- 효소활성을 나타내는10 kDa이하의 단백질 fraction을 차가운 acetone으로 40% (v/v)로 포화시켜 -20℃에 4시간 동안 보관한 뒤, 10,000 rpm에서 20 분간 원심분리하여 침전물을 얻었다. 40% (v/v) 포화상등에 acetone을 추가적으로 넣어 60, 80% (v/v)로 포화시켜 같은 방법으로 침전물을 얻었다. 각각의 침전물을 50 mM Tris-HCl (pH 9.
- Casein, gelatin, bovine serum albumin (BSA)를 이용하여 protease가 선택적으로 분해하는 기질을 조사하였다. 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 9)에 6% (w/v)의 기질을 첨가하여 37℃에 1시간 동안 반응시킨 후, TCA로 반응을 정지시켜 protease 조사하였다.
- 분리된 균주의 성장과 protease 생산을 촉진하는 질소원을 선정하기 위하여 다양한 유기/무기 질소원을 대상으로 조사하였다. Ammonium chloride, ammonium sulfate, casamino acid, gelatin, malt extract, peptone, skim milk, soytone, soybean meal, tryptone, yeast extract를 LB broth에 각각 1% (w/v) 씩 첨가하고 30℃에서 48 시간 동안 배양하여 균주의 성장과 protease 생산에 미치는 효과를 조사하였다[19].
- Casein, gelatin, bovine serum albumin (BSA)를 이용하여 protease가 선택적으로 분해하는 기질을 조사하였다. 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 9)에 6% (w/v)의 기질을 첨가하여 37℃에 1시간 동안 반응시킨 후, TCA로 반응을 정지시켜 protease 조사하였다.
- 으로서 최종 농도가 1, 5, 10 mM이 되도록 첨가하여 protease 활성을 조사하였다[5]. Chemical reagent는 ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA),dithiothreitol (DTT), phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)를 위의 조건과 같이 처리하여 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 9.0)에서 1시간 동안 37℃에서 반응시켜 protease 활성을 조사하였다[4]. 계면활성제에 따른 효소반응의 저해를 확인하기 위해 SDS를 사용하여 1, 2, 4, 5, 6% (w/v) SDS로 처리하고, 위의 조건과 같이 30분간 실온에서 반응하고, 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 9.
- Metal ion과 chemical reagent가 protease의 활성에 미치는 영향을 확인하기 위해, 각각을 1, 5, 10 mM의 농도로 첨가하여 효소의 활성을 측정하였다. Metal ion은 농도가 높아질수록 효소활성을 저해하였으며, 특히 10 mM의 Zn2+, Cu2+와 Fe2+이온에서 강한 저해작용을 보여 잔여활성이 각각 43.
- 또한 NaCl 농도에 대한 영향을 확인하기 위해 protease 생산 배지에 1, 3, 7% (w/v)의 NaCl을 첨가하고 균주 1% (v/v)를 접종하여 30℃에서 48 시간까지 배양하면서 12 시간 간격으로 시료를 얻었다. OD 600 nm에서의 흡광도를 측정하여 균주의 성장을 조사하였으며 protease 활성 측정을 통해 효소의 생산을 조사하였다.
- Micorococcus sp. PS-1는 해수에서 분리하였기 때문에 NaCl의 균주 성장과 protease효소 생산 영향을 먼저 조사하였다. NaCl이 성장에 미치는 영향은 12 시간까지는 NaCl의 첨가유무에 상관없이 비슷한 균주의 성장을 보였고, 1 M의 NaCl 첨가 시 가장 높은 균주의 성장을 보였다(Fig.
- 따라서 분리균주 Micrococcus sp. PS-1은 LB배지에 2% (w/v) skim milk와 1% (w/v) NaCl을 첨가하고 pH 7의 조건에서 균주의 성장이나 protease의 생산이 가장 높은 것으로 나타나 이후의 실험에서는 이를 protease를 생산하기 위한 최적배지로 사용하였다.
- Protease 활성은 Kunitz의 casein hydrolysis 법을 변형하여 측정하였다[14]. 기질용액은 6% (w/v) Hammersten casein을 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 9.
- 으로 희석하고 고체배지에 도말하여 균주를 분리하였다. Protease를 생산하는 균주를 분리하기 위한 배지로는 LB 고체배지를 기본으로 하여 0.5% (w/v) skim milk를 첨가하여 사용하였다. 균주의 동정을 위해 그람 염색법으로 형태적 특성을 확인하였다[25].
- 0)에서 1 시간 동안 반응시켜 효소활성을 비교하였다. Protease의 pH 안정성을 확인하기 위해, 각 완충액에 조효소액을 30 분 동안 실온에서 반응 시키고, 이후 pH 9.0로 적정하여 37℃에서 1 시간 동안 추가로 반응한 후, 잔존 효소활성을 측정하였다. 온도에 대한 효소의 안정성을 조사하기 위하여 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 9.
- Protease의 pH와 온도에 대한 안정성을 확인하기 위해 다양한 온도와 pH 조건에서 30 분간 반응한 후, 최적 반응조건인 pH 9.0와 37℃에서 1 시간 동안 추가로 반응시켜 잔존활성을 확인하였다. 그 결과, pH 9.
- Protease의 최적 pH를 조사하기 위해 50 mM sodium acetate (pH 3.0~6.0), 50 mM sodium phosphate (pH 6.0~8.0), 50 mM Tris-HCl (pH 8.0~9.0), 50 mM Glycine NaOH (pH 9.0~12.0) 완충액을 사용하여 37℃에서 1 시간 동안 반응한 후, 효소활성을 측정하였다. 최적 온도를 측정하기 위하여 25, 30, 37, 45, 50, 60, 70℃의 반응온도에서 조효소액을 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 9.
- Protease의 최적 pH를 확인하기 위하여 4가지 완충액(pH 3.0~6.0: 50 mM sodium acetate, pH 6.0~8.0: 50 mM sodium phosphate, pH 8.0~9.0: 50 mM Tris-HCl, pH 9.0~14.0: 50 mM glycine NaOH)을 사용하여 37℃에서 효소활성을 측정하였다. 그 결과, 최적 효소활성은 pH 9.
- Protease의 최적 기질을 확인하기 위하여 6% (w/v) BSA, casein, gelatin을 이용하여 분해능을 조사하였다. 각각의 기질을 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 9.
- 55 M Na2CO3와 20 μl의 1 N Folin-Ciocalteu reagent를 가하여 37℃에서 30 분 동안 반응하였다. VERSAmax microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, California, USA)를 이용하여 OD 660 nm에서 반응액의 흡광도를 측정하였다. 1 unit의 효소 활성도는 위의 조건에서 1 분 동안 1 uM tyrosine 에 해당하는 아미노산을 생성하는 효소의 양으로 하였다.
- 5% (v/v) Triton X-100으로 30 분간 washing하였다. Washing 된 gel은 MS gel 에 overlay하여 20 V에서 25 분간 transfer하고, 37℃에서 예열된 zymogram reaction buffer (30 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 0.02% (w/v) sodium azide, pH 9.0) 에 30분간 반응 시킨 후, Coomassie brilliant blue로 염색하고, destaining solution (40% (v/v) methanol, 10% (v/v) acetic acid, 50% (v/v) D.W)로 탈색하여 단백질 분해활성을 나타내는 clear band를 확인하였다.
- 0로 적정하였다. 각각의 배지에 분리 균주를 1% (v/v) 씩 접종하여 30℃에서 48 시간 동안 배양하고 12 시간 간격으로 시료를 얻어 균주의 성장과 protease 생산을 조사하였다[1].
- 각각의 침전물을 50 mM Tris-HCl (pH 9.0) 완충액에 녹여 protease 활성 분획을 조사하고, 각 시료를 MWCO가 15 kDa인Spectra/por ® Dialysis tube (Spectrum Laboratories, Inc., Chisholm, Minnesota, USA)에 채워 밀봉한 후, 4℃에서 50 mM Tris-HCl (pH 9.0) 완충액으로 dialysis시켜 정제하였다[2, 21].
- 0)에서 1시간 동안 37℃에서 반응시켜 protease 활성을 조사하였다[4]. 계면활성제에 따른 효소반응의 저해를 확인하기 위해 SDS를 사용하여 1, 2, 4, 5, 6% (w/v) SDS로 처리하고, 위의 조건과 같이 30분간 실온에서 반응하고, 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 9.0)에서 1시간 동안 37℃에서 추가로 반응하여 protease 활성을 조사하였다[13].
- 최적 배양시간을 확인하기 위해 protease 생산배지에 균주 1% (v/v)를 접종하여 30℃ shaking incubator에서 배양하면서 12 시간에서 72 시간까지 12 시간 간격으로 시료를 얻었다. 또한 NaCl 농도에 대한 영향을 확인하기 위해 protease 생산 배지에 1, 3, 7% (w/v)의 NaCl을 첨가하고 균주 1% (v/v)를 접종하여 30℃에서 48 시간까지 배양하면서 12 시간 간격으로 시료를 얻었다. OD 600 nm에서의 흡광도를 측정하여 균주의 성장을 조사하였으며 protease 활성 측정을 통해 효소의 생산을 조사하였다.
- 미생물의 배양학적 특성을 조사하기 위해 LB를 기본으로 한 배지에 여러 질소원을 첨가하여 미생물의 성장과 효소생산을 조사하였다. 또한 protease의 효소학적 특성을 조사하기 위해 온도, pH 그리고 여러 이온들을 첨가하여 효소의 최적 조건과 효소활성의 연관관계를 조사하였다.
- 로 동정되어, PS-1으로 명명하였다. 미생물의 배양학적 특성을 조사하기 위해 LB를 기본으로 한 배지에 여러 질소원을 첨가하여 미생물의 성장과 효소생산을 조사하였다. 또한 protease의 효소학적 특성을 조사하기 위해 온도, pH 그리고 여러 이온들을 첨가하여 효소의 최적 조건과 효소활성의 연관관계를 조사하였다.
- 배양상등액을 molecular weight cut-off (MWCO)가 300 kDa, 50 kDa, 10 kDa의 membrane을 사용하여 ultrafiltration (UF, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)으로 분획하였다[16, 24]. 효소활성을 나타내는10 kDa이하의 단백질 fraction을 차가운 acetone으로 40% (v/v)로 포화시켜 -20℃에 4시간 동안 보관한 뒤, 10,000 rpm에서 20 분간 원심분리하여 침전물을 얻었다.
- 부분 정제된 효소용액을 2-mercaptoethanol 이 제외된 5X zymography sample buffer (60 mM Tris-HCl, 25% (v/v) glycerol, 2% (w/v) SDS, 0.1% (w/v) bromophenol blue, pH 6.8)에 섞어 12% (w/v) polyacrylamide gel에 loading 하여 80 V로 전기영동 하고, Coomassie brilliant blue로 염색하여 단백질 band들을 확인하였다. Zymography는 mixed substrate (MS) gel을 만들어 TRANS-BLOT 법으로 측정하였다[5,7].
- 분리된 균주의 초기 pH에 따른 배양 특성과 효소생산을 조사하기 위해, 2% (w/v) skim milk가 포함된 LB broth를 5 N HCl과 5 N NaOH를 사용하여 초기 pH를 4.0~11.0로 적정하였다. 각각의 배지에 분리 균주를 1% (v/v) 씩 접종하여 30℃에서 48 시간 동안 배양하고 12 시간 간격으로 시료를 얻어 균주의 성장과 protease 생산을 조사하였다[1].
- 사용된 metal ion은 Ca2+, Cu2+, Fe2+, K2+, Mg2+, Zn2+으로서 최종 농도가 1, 5, 10 mM이 되도록 첨가하여 protease 활성을 조사하였다[5]. Chemical reagent는 ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA),dithiothreitol (DTT), phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)를 위의 조건과 같이 처리하여 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 9.
- 여과와 침전을 통해 불순물을 제거한 해수를 멸균 증류수로 10 배씩 희석하여 0.5% (w/v) skim milk가 함유된 LB agar plate에서 3일간 배양한 후, 형성되는 미생물의 집락을 관찰하였다. 다양한 종류의 세균과 곰팡이들이 관찰되었으며, 이 중 skim milk에 대해 가장 강한 분해활성을 나타내는 균주를 분리하였다.
- 증폭된 PCR 산물은 GeneAll PCR SV (Seoul, Korea)를 이용하여 정제하여 코스모진텍(Seoul, Korea)에 염기서열 분석을 의뢰하였다. 염기서열간의 유사도를 확인하기 위하여 The National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 제공하는 Advanced Blast Search 프로그램을 통하여 GenBank에 보고된 유사 균주의 염기서열과 비교하여 계통분류학적 유연관계를 분석하였다.
- 0로 적정하여 37℃에서 1 시간 동안 추가로 반응한 후, 잔존 효소활성을 측정하였다. 온도에 대한 효소의 안정성을 조사하기 위하여 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 9.0)에 조효소액을 섞고 각 온도에서 30분 동안 반응시킨 후, 최적 온도인 37℃에서 1 시간 동안 추가로 반응하며 잔존 효소활성을 측정하였다.
- 16S rDNA 분석을 위해 universal forward primer bact_F (5’ AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3’)와 universal reverse primer bact_R (5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)를 사용하여 PCR 하였다. 증폭된 PCR 산물은 GeneAll PCR SV (Seoul, Korea)를 이용하여 정제하여 코스모진텍(Seoul, Korea)에 염기서열 분석을 의뢰하였다. 염기서열간의 유사도를 확인하기 위하여 The National Center for Biotechnology Information (NCBI, 최적 배양시간을 확인하기 위해 protease 생산배지에 균주 1% (v/v)를 접종하여 30℃ shaking incubator에서 배양하면서 12 시간에서 72 시간까지 12 시간 간격으로 시료를 얻었다. 또한 NaCl 농도에 대한 영향을 확인하기 위해 protease 생산 배지에 1, 3, 7% (w/v)의 NaCl을 첨가하고 균주 1% (v/v)를 접종하여 30℃에서 48 시간까지 배양하면서 12 시간 간격으로 시료를 얻었다.
- 0) 완충액을 사용하여 37℃에서 1 시간 동안 반응한 후, 효소활성을 측정하였다. 최적 온도를 측정하기 위하여 25, 30, 37, 45, 50, 60, 70℃의 반응온도에서 조효소액을 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 9.0)에서 1 시간 동안 반응시켜 효소활성을 비교하였다. Protease의 pH 안정성을 확인하기 위해, 각 완충액에 조효소액을 30 분 동안 실온에서 반응 시키고, 이후 pH 9.
- 7B). 한편 효소의 최적온도를 측정하기 위하여 proetase를 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 9.0)에서 25, 30, 37, 45, 50, 60, 70℃의 온도에서 반응시켜 효소활성을 조사하였다. 효소의 최적 반응온도는 37℃로 나타났으며 반응온도가 높아질수록 효소활성이 급격히 감소하며 50℃에서는 최적온도의 52% 수준의 효소활성을 나타냈으며, 60℃부터는 활성이 거의 관찰되지 않았다(Fig.
대상 데이터
- Protease 활성은 Kunitz의 casein hydrolysis 법을 변형하여 측정하였다[14]. 기질용액은 6% (w/v) Hammersten casein을 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 9.0)에 녹여 기질로 사용하였다. 조효소액은 2% (w/v) skim milk와 1% (w/v) NaCl이 포함된 LB broth에서 48 시간 동안 배양한 뒤, 13,000 rpm으로 5 분간 원심분리하여 얻었다.
- 효소의 활성측정에 사용된 시약은 Hammarsten casein (USB, Cleveland, Ohio, USA), trichloroacetic acid (Sigma), Folin-Ciocalteu reagent (Sigma), sodium carbonate (Samchun) 등을 사용하였다. 단백질의 침전에는 HPLC급 acetone (SK chemical, Ulsan, Korea)을 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 기본 배지는 LB (Difco, Franklin Lakes, New Jersey, USA)이었고, ammonium chloride (Samchun, Pyeongtaek, Korea), ammonium sulfate (Katayama Chemical, Osaka, Japan), casamino acid, peptone, skim milk, soytone, tryptone, yeast extract (Difco), gelatin (Sigma, St. Louis, Missouri, USA), malt extract (Oxoid, Madrid, Spain), soybean meal (Busan, Korea)과 같은 질소원과 NaCl(Samchun)를 첨가하여 사용하였다. 효소의 활성측정에 사용된 시약은 Hammarsten casein (USB, Cleveland, Ohio, USA), trichloroacetic acid (Sigma), Folin-Ciocalteu reagent (Sigma), sodium carbonate (Samchun) 등을 사용하였다.
- 따라서 육상과 환경적인 차이를 보이는 특이한 생태 및 생리학적 조건에서 적응하는 해양미생물의 탐색 및 유용자원에 대한 연구를 실시하였다. 본 연구에 사용된 미생물은 부산 앞바다의 해수에서 분리되었다. 16S rDNA sequencing 방법을 통해 Micrococcus sp.
- 본 연구에 사용된 해수는 부산 해수욕장 일대에서 얻어 이를 멸균된 증류수로 10-5으로 희석하고 고체배지에 도말하여 균주를 분리하였다. Protease를 생산하는 균주를 분리하기 위한 배지로는 LB 고체배지를 기본으로 하여 0.
- Louis, Missouri, USA), malt extract (Oxoid, Madrid, Spain), soybean meal (Busan, Korea)과 같은 질소원과 NaCl(Samchun)를 첨가하여 사용하였다. 효소의 활성측정에 사용된 시약은 Hammarsten casein (USB, Cleveland, Ohio, USA), trichloroacetic acid (Sigma), Folin-Ciocalteu reagent (Sigma), sodium carbonate (Samchun) 등을 사용하였다. 단백질의 침전에는 HPLC급 acetone (SK chemical, Ulsan, Korea)을 사용하였다.
이론/모형
- 8)에 섞어 12% (w/v) polyacrylamide gel에 loading 하여 80 V로 전기영동 하고, Coomassie brilliant blue로 염색하여 단백질 band들을 확인하였다. Zymography는 mixed substrate (MS) gel을 만들어 TRANS-BLOT 법으로 측정하였다[5,7]. Gel에 포함된 SDS는 효소반응을 저해할 수 있기 때문에, 이를 제거하기 위해 3차 증류수로 10 분 간격으로 3번 washing 하고, 2.
- 5% (w/v) skim milk를 첨가하여 사용하였다. 균주의 동정을 위해 그람 염색법으로 형태적 특성을 확인하였다[25]. 16S rDNA 분석을 위해 universal forward primer bact_F (5’ AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3’)와 universal reverse primer bact_R (5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)를 사용하여 PCR 하였다.
- 1 unit의 효소 활성도는 위의 조건에서 1 분 동안 1 uM tyrosine 에 해당하는 아미노산을 생성하는 효소의 양으로 하였다. 단백질의 농도는 Bradford의 방법으로 측정하였다.
성능/효과
- PS-1을 1% (v/v) 접종하여 48시간 동안 배양하여 조효소액 얻고, 이를 ultrafiltration한 결과, 10 kDa 이하의 분획에서 protease 활성을 나타냈다. 10 kDa이하의 분획을 대상으로 acetone을 사용하여 40~60% (v/v)까지 포화시켜 침전한 결과, total protein은 85.9 mg으로 줄었고, specific activity는 3604.14 unit/mg으로 나타났다. 이후 dialysis tube (MWCO 15 kDa)를 이용하여 acetone 침전물을 dialysis한 결과, total protein양은 28.
- 43배로 증가하였다(Table 2). 12% (w/v) native polyacrylamide gel에 부분 정제된 효소액을 5X zymography sample buffer에 섞어 loading하여 전기영동한 후 TRANS-BLOT 법을 사용하여 zymography한 결과, 35.0 kDa과 37.5 kDa 크기의 band에서 clear zone이 관찰되었으나(Fig. 5), 효소액과 buffer를 100℃에서 10분간 끓인 후, 12% (w/v) denature gel로 전기영동했을 때 protease 활성은 소실되었다(data not shown). 이는 2-mercaptoethanol이 protease의 disulfide bond를 분해하여 효소가 불활성화되어 효소활성이 사라진 것으로 추측된다.
- EDTA와 PMSF의 경우, 1 mM부터 활성이 강하게 저해되었고 EGTA와 DTT에서는 1 mM에서 각각 76.5%와 93.6%의 잔존활성이 유지되었으나 5 mM부터 효소활성이 급격히 감소되었다(Fig. 8B). Serine protease inhibitor로 알려져 있는 PMSF와 metal ion의 chelating agent로 알려진 EDTA와 EGTA에서의 강한 저해작용을 통해, Micrococcus sp.
- Metal ion과 chemical reagent가 protease의 활성에 미치는 영향을 확인하기 위해, 각각을 1, 5, 10 mM의 농도로 첨가하여 효소의 활성을 측정하였다. Metal ion은 농도가 높아질수록 효소활성을 저해하였으며, 특히 10 mM의 Zn2+, Cu2+와 Fe2+이온에서 강한 저해작용을 보여 잔여활성이 각각 43.5%, 25.6%와 30.2%로 나타났으나, 1, 5 mM의 Zn2+, Cu2+에서는 영향이 없었다. 또한 Mg2+과 Ca2+ 이온에서는 10 mM의 농도에서도 잔여활성이 80% 이상까지 유지되어 다른 metal ion보다 효소활성에 영향이 있는 것으로 관찰되었다(Fig.
- 2A). NaCl 첨가에 따른 효소 생산은 성장의 결과와 유사하게 1 M NaCl에서 가장 많은 효소를 생산하였고 3과 7 M NaCl의 첨가 시 효소의 생산이 저해되는 것을 확인하였다(Fig. 2B). 따라서 protease생산 균주인 Micrococcus sp.
- PS-1는 해수에서 분리하였기 때문에 NaCl의 균주 성장과 protease효소 생산 영향을 먼저 조사하였다. NaCl이 성장에 미치는 영향은 12 시간까지는 NaCl의 첨가유무에 상관없이 비슷한 균주의 성장을 보였고, 1 M의 NaCl 첨가 시 가장 높은 균주의 성장을 보였다(Fig. 2A). NaCl 첨가에 따른 효소 생산은 성장의 결과와 유사하게 1 M NaCl에서 가장 많은 효소를 생산하였고 3과 7 M NaCl의 첨가 시 효소의 생산이 저해되는 것을 확인하였다(Fig.
- 따라서 skim milk의 주성분이 casein인 것을 고려할 때 Micrococcus sp. PS-1이 생산하는 protease 효소의 기질 특이성이 casein에서 가장 높은 것으로 사료되었다.
- 3%로 측정되어 Micrococcus sp. PS-1이 생산하는 protease는 SDS에서 비교적 안정함을 확인할 수 있었다(Fig. 8C).
- Protease의 최적 기질을 확인하기 위하여 6% (w/v) BSA, casein, gelatin을 이용하여 분해능을 조사하였다. 각각의 기질을 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 9.0)에 녹여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 효소 활성을 측정한 결과, 최적 기질은 casein으로서 gelatin의 2.5 배, BSA보다 128 배 더 강한 단백질 분해 활성이 확인되었다(Fig. 6). 이 결과는 앞서 확인되었던 배양배지의 질소원 특성 결과와 유사한 경향을 보였다.
- 0와 37℃에서 1 시간 동안 추가로 반응시켜 잔존활성을 확인하였다. 그 결과, pH 9.0~10.0 사이에서 효소활성이 매우 안정하였으나 pH 6.0과 12.0에서는 각각 상대 효소활성이 52%와 63%로 확인되어 분리된 균주의 protease는 알카리 조건의 pH에서 효소활성이 매우 안정하였다(Fig. 7B). 온도에 대한 안정성은 37℃ 이하의 온도에서는 큰 영향을 받지 않았지만 45℃에서는 잔존활성이 53.
- 0: 50 mM glycine NaOH)을 사용하여 37℃에서 효소활성을 측정하였다. 그 결과, 최적 효소활성은 pH 9.0 (50 mM Tris-HCl)에서 나타났고 pH 11.0까지도 효소활성이 안정되게 유지되었다. 또한 pH 12.
- 2%로 나타났으나, 1, 5 mM의 Zn2+, Cu2+에서는 영향이 없었다. 또한 Mg2+과 Ca2+ 이온에서는 10 mM의 농도에서도 잔여활성이 80% 이상까지 유지되어 다른 metal ion보다 효소활성에 영향이 있는 것으로 관찰되었다(Fig. 8A).
- 0까지도 효소활성이 안정되게 유지되었다. 또한 pH 12.0에서도 약 75% 정도의 효소활성이 유지되어 전형적인 alkaline protease의 특성을 보였다(Fig. 7B). 한편 효소의 최적온도를 측정하기 위하여 proetase를 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 9.
- 의 성장과 효소생산을 확인한 결과, gelatin과 skim milk를 첨가한 배지에서 protease 생산이 유도되는 것이 확인되었다(Table 1). 또한 효소 생산에 가장 적합한 배양시간을 확인한 결과, 배양 후 12시간까지는 효소의 생산이 없다가 18 시간 이후 급격히 증가하였으며, 효소의 최대 생산은 배양 후 72 시간까지 유지되었다(Fig. 3). 배양 중 배지의 색은 맑고 연한 노란색에서 점점 연한 분홍색으로 변하였고 특유의 냄새도 관찰되었다.
- 다양한 종류의 세균과 곰팡이들이 관찰되었으며, 이 중 skim milk에 대해 가장 강한 분해활성을 나타내는 균주를 분리하였다. 분리된 균주는 밝은 노란색이며, 표면이 매끈하고 볼록한 형태의 집락을 보였다. 정확한 균주의 동정을 위해 16S rDNA 염기서열(1.
- 효소 생산을 촉진하기 위해 LB broth에 2% (w/v) 유기/무기 질소원을 첨가하여 Micrococcus sp.의 성장과 효소생산을 확인한 결과, gelatin과 skim milk를 첨가한 배지에서 protease 생산이 유도되는 것이 확인되었다(Table 1). 또한 효소 생산에 가장 적합한 배양시간을 확인한 결과, 배양 후 12시간까지는 효소의 생산이 없다가 18 시간 이후 급격히 증가하였으며, 효소의 최대 생산은 배양 후 72 시간까지 유지되었다(Fig.
- 14 unit/mg으로 나타났다. 이후 dialysis tube (MWCO 15 kDa)를 이용하여 acetone 침전물을 dialysis한 결과, total protein양은 28.4 mg이었고 specific activity는 10620.29 unit/mg으로 높아졌다. 최종으로 부분 정제된 protease의 수율은 54.
- 해양미생물은 극한 환경에서 영양분을 흡수하기 위해 강력한 가수분해효소를 생산하며, 이 중 단백질 분해효소와 지질 분해효소를 대표적으로 꼽을 수 있다. 저온 환경에 적응하며 사는 해양미생물이 분비하는 효소는 저온과 높은 농도의 염에서도 뛰어난 활성을 나타내고, 유전자 재조합 및 단백질 공학 같은 새로운 생물공학기술을 적용하기가 비교적 용이한 것으로 알려졌다. 육상생물과 다른 특이한 대사 조직을 가지고 있기 때문에 육류 연화제와 와인, 치즈 같은 식품부터 세제, 화장품 및 동물사료에 이르기까지 유용한 친환경 산업자원으로서의 개발가능성이 보고되고 있으나 육상에서 분리된 균주에 비해 해양유래의 미생물에 대한 연구는 미비한 실정이다[8, 9, 12].
- 분리된 균주는 밝은 노란색이며, 표면이 매끈하고 볼록한 형태의 집락을 보였다. 정확한 균주의 동정을 위해 16S rDNA 염기서열(1.5 kb)을 분석하고 이를 NCBI의 BLAST database에 등록된 다른 균주들의 염기서열과 비교한 결과, Micrococcus luteus OS 139와 99%의 상동성을 보였다(Fig. 1.). 따라서 분리된 균주를 Micrococcus sp.
- 이 결과는 앞서 확인되었던 배양배지의 질소원 특성 결과와 유사한 경향을 보였다. 즉, LB broth에 첨가한 질소원 중 skim milk와 gelatin를 첨가한 배지에서 우수한 효소생산이 관찰되었으며, gelatin 보다 skim milk에서 효소생산이 1.5배 더 높은 것으로 확인되었다. 따라서 skim milk의 주성분이 casein인 것을 고려할 때 Micrococcus sp.
- 한편 초기 배양액의 pH에따른 효소의 생산은 배양액의 pH가 균주의 성장에 미치는 영향과 비슷한 경향을 보였다. 즉, pH 6.0에서 pH 9.0 사이에서 최대의 효소 활성을 보였으나 pH 4.0~5.0와 pH 10.0~11.0에서는 효소의 생산이 감소하였다(Fig. 4). Protease 생산균주인 Micrococcus sp.
- 초기 배양 pH에 따른 균주의 성장과 protease 생산을 알아보기 위해 배양액의 pH를 4.0~11.0까지 맞춘 후 12시간 간격으로 조사한 결과, 산성(pH 4.0~5.0)의 조건에서는 균주의 성장이 관찰되지 않았으나, 균주의 최대성장은 pH 7.0에서 나타났으며, pH 10.0 이상에서는 균주의 성장이 급격히 감소하였다(Fig. 4). 한편 초기 배양액의 pH에따른 효소의 생산은 배양액의 pH가 균주의 성장에 미치는 영향과 비슷한 경향을 보였다.
- 29 unit/mg으로 높아졌다. 최종으로 부분 정제된 protease의 수율은 54.25%이고, 정제도는 16.43배로 증가하였다(Table 2). 12% (w/v) native polyacrylamide gel에 부분 정제된 효소액을 5X zymography sample buffer에 섞어 loading하여 전기영동한 후 TRANS-BLOT 법을 사용하여 zymography한 결과, 35.
- 0)에서 25, 30, 37, 45, 50, 60, 70℃의 온도에서 반응시켜 효소활성을 조사하였다. 효소의 최적 반응온도는 37℃로 나타났으며 반응온도가 높아질수록 효소활성이 급격히 감소하며 50℃에서는 최적온도의 52% 수준의 효소활성을 나타냈으며, 60℃부터는 활성이 거의 관찰되지 않았다(Fig. 7A).
후속연구
- 따라서 Micrococcus PS-1이 생상하는 protease 의 분자량과 효소학적 특성을 정확하게 조사하기 위해서는 단백질의 정제연구가 추가적으로 수행되어야 할 것이다.
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