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문제 정의
- 본 연구에서는 명태 및 다시마 부산물의 효율적 이용에 관한 일련의 연구로 명태 두부 및 다시마 부산물 유래 고온가압 추출물에 상업적 효소를 적용시켜 수율과 건강 기능성 개선을 시도하였고, 아울러 이들 추출물의 식품학적 성분 특성에 대하여도 조사하였다.
- 상업적 효소(Neutrase, Alcalase, Flavourzyme 및 Protamex) 를 이용하여 고온가압 추출물(Noh, 2012)의 수율과 맛의 강도를 개선하고 생리활성을 부여할 목적으로 응용할 효소의 종류 및 처리 시간을 구명하고자 하였다.
제안 방법
- 조제한 시료를 spectrophotometer (UV-140-02, Shimadzu, Japan)로 흡광도 (517 nm)를 측정하였다. DPPH radical 소거 활성은 다음과 같이 백분율로 계산하였고, blank는 시료 대신 증류수를 사용하였다. 그리고, 시료의 DPPH radical 소거 활성을 비교하기 위한 대조구는 0.
- TCA soluble index는 총 질소 함량에 대한 10% TCA 가용성 질소 함량의 상대 비율 (%)로 하였다.
- 가수분해물의 수율은 추출을 위하여 사용한 원료 명태 두부와 다시마 부산물을 혼합한 혼합물의 단백질 함량에 대하여 가수분해물에 함유된 단백질 함량의 상대비율 (%)로 하였다.
- 고온 가압 추출물은 건조 명태 두부 중량에 대하여 18.18% (w/w)에 해당하는 다시마와 6.86배 (v/w)에 해당하는 가공용수를 가하고, 118℃로 조정된 autoclave (MAC-6100, Eyela, Japan)에서 5.48시간 동안 추출하여 제조하였으며, 이를 8,000 rpm에서 30분간 원심분리시켜 얻은 상층액을 추출액으로 하였다. 명태 두부 및 비정형 다시마 유래 가수분해물은 고온 가압 추출물을 마쇄한 다음 이의 단백질에 대하여 2% (w/w)에 해당하는 효소를 가하고, 일정시간(0, 0.
- 관능검사는 고온가압 추출액을 대조구로 하고, 이의 색, 맛 및 냄새를 기준점인 5점으로 한 다음, 가수분해물의 이들 항목이 이보다 우수한 경우 각각 6-9점으로 하고, 이보다 열악한 경우 4-1점으로 하는 9단계 평점법으로 상대평가하여 평균값으로 나타내었다.
- 48시간 동안 추출하여 제조하였으며, 이를 8,000 rpm에서 30분간 원심분리시켜 얻은 상층액을 추출액으로 하였다. 명태 두부 및 비정형 다시마 유래 가수분해물은 고온 가압 추출물을 마쇄한 다음 이의 단백질에 대하여 2% (w/w)에 해당하는 효소를 가하고, 일정시간(0, 0.5, 1, 2, 3, 4 및 6시간) 동안 효소의 최적 온도에서 반응시킨 다음, 이를 8,000 rpm에서 30분간 원심분리시켜 상층액에 해당하는 것으로 하였다. 이때, 추출물 (pH 6.
- 색조는 가수분해물을 직시색차계(ZE 2000, Nippon Denshoku Industries Co., Japan)의 부속 용기인 원통형 용기에 담아 Hunter L 및 b값을 각각 측정하였다. 이 때 직시색차계의 표준백판은 L값이 94.
- 유리아미노산은 전처리한 시료의 일정량을 아미노산 자동분석기(Pharmacia Biotech Biochrom 30, England)에 주입하여 분석하고, 정량하였다.
- 유리아미노산의 분석 시료는 고온가압 추출물에 20% TCA를 동량 가하여 원심분리(1,000 g, 20 min)한 다음 상층액을 정용하고, 이의 80 mL를 분액깔때기에 취하여 동량의 ether를 사용하여 TCA 제거 공정을 4회 반복한 다음 이를 농축 및 0.20 M lithium citrate buffer (pH 2.2)로 정용(25 mL) 하여 제조하였다.
- 이어서 반응용액 20 μL를 Zorbax 300SB C8 column (Hewlett Packard Co., 4.6×150 mm)을 장착한 역상 HPLC (LC-10Avp, Shimadzu Co., Japan)에 주입하여 분석하였다.
- DPPH radical 소거 활성은 Blois (1958)의 방법을 일부 변형하여 실시하였다. 즉, test tube에 ethanol을 용매로 하는 0.2 mM 1,1-diphenyl-2-picryl hydeazyl (DPPH) (Sigma-Aldrich INC, MO, USA)용액 0.9 mL를 가하고, 여기에 0.1 mL의 시료용액을 혼합한 후, 상온에서 30분간 방치하여 DPPH 분석을 위한 시료를 조제하였다. 조제한 시료를 spectrophotometer (UV-140-02, Shimadzu, Japan)로 흡광도 (517 nm)를 측정하였다.
- 총 아미노산의 분석을 위한 시료는 일정량의 추출물(약 2mL)에 12 N HCl을 2 mL 가하고, 밀봉, heating block (HF21, Yamato, Japan)에서 가수분해(110℃, 24시간), glass filter로 여과 및 감압건조하여 감압건조물을 얻었으며, 이 감압건조물을 sodium citrate buffer (pH 2.2)로 정용하여 제조하였다. 총아미노산의 분석은 전처리한 각 시료의 일정량을 아미노산 자동분석기(Pharmacia Bioteck Biochrom 30, England)에 주입하여 실시하였으며, 이를 토대로 동정 및 정량하였다.
- 2)로 정용하여 제조하였다. 총아미노산의 분석은 전처리한 각 시료의 일정량을 아미노산 자동분석기(Pharmacia Bioteck Biochrom 30, England)에 주입하여 실시하였으며, 이를 토대로 동정 및 정량하였다.
대상 데이터
- 관능 평가 요원은 고온가압 추출액의 농도에 따른 색, 맛 및 냄새에 대하여 잘 훈련된 식품가공 전공의 대학생과 대학원생 10인(남녀 동일 비율)으로 구성하였다.
- 러시아산 명태(Theragra chalcogramma)두부와 완도산 비정형 다시마(Laminaria japonica)는 경상남도 거제시 소재 거제 수협 수산물종합가공공장으로부터 학교급식 소재로 가공할 때 부산물로 발생하는 것을 2011년 1월에 제공받아 사용하였다. 즉, 제공받은 명태 두부는 동결된 채로, 그리고 비정형 다시마는 비닐 백에 넣어 실험실로 신속히 운반하였다.
- 명태 두부 및 다시마 부산물 유래 고온가압 추출물(이하 고온 가압 추출물로 칭함)의 수율 및 기능성 개선을 위하여 사용한 효소 즉, Alcalase 2.4 L FG (최적 온도는 55-70℃이고, 최적 pH는 6.5-8.5: 이하 Alcalase로 칭함), Flavourzyme 500 MG (최적 온도는 50℃이고, 최적 pH는 5.0-7.0: 이하 Flavourzyme으로 칭함), Neutrase 0.8 L (최적 온도는 45-55℃이고, 최적 pH는 5.5-7.5: 이하 Neutrase로 칭함) 및 Protamex 1.5 MG (최적 온도는 40℃이고, 최적 pH는 6.0-7.0: 이하 Protamex로 칭함)는 Novo Co. (Novo Nordisk, Bagsvared, Denmark)에서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- 본 실험에서 얻어진 데이터의 표준 편차 및 유의차 검정(5% 유의 수준)은 SPSS 통계 패키지〔spss window, release 10.0.1 (1 Jun 2000)〕에 의한 ANOVA test를 이용하여 분산분석한 후 Duncan의 다중위 검정을 실시하였다.
이론/모형
- Angiotensin-I converting enzyme (ACE) 저해 활성은 Horiuchi et al. (1982)의 방법으로 측정하였다. 일정량(15 μL)의 시료에 정제 ACE (60 mU/mL) 50 μL를 가하여 예비 가온(37℃, 5 min)시켰다.
- Taste value는 Kato et al. (1989)이 제시한 유리아미노산의 맛에 대한 역치 (threshold)를 이용하여 Cha et al. (1999a;1999b)과 같은 방법으로 계산하였다.
- Trichloroacetic acid (TCA) 가용성 질소 함량은 시료액과 동량의 20% (w/v) TCA를 넣고, 혼합하여 제단백한 다음 원심분리(1,000 ×g, 20분)하고, 이를 semimicro Kjeldahl법으로 정량한 질소 함량으로 하였다.
- 무기질은 Tsutagawa et al. (1994)이 실시한 방법에 따라 질산으로 유기질을 습식 분해하여 시료를 조제한 다음 inductively coupled plasma spectrophotometer (ICP, Atomscan 25, TJA, USA)로 분석하였다.
성능/효과
- , 1995). Taste value의 결과로 미루어 효소 가수분해물의 주요 맛성분은 glutamic acid와 aspartic acid로 판단되었고, 추출액과 비교하였을 때 강도의 차이는 있으리라 판단되었으나, 종류(glutamic acid, aspartic acid)에 있어서는 차이가 없었다.
- 따라서, 효소 가수분해물의 주요 구성아미노산은 추출액(대조구)의 그것에 비하여 종류 및 조성의 경우 유사하였으나, 함량의 경우 많았다. Tryptophan을 제외한 9종의 필수아미노산(threonine, valine, leucine, isoleucine, lysine, methionine, phenylalanine, histidine 및 arginine)의 함량은 효소 가수분해물의 경우 2,349.4 mg/100 mL로, 대조구의 1,075.1 mg/100 mL에 비하여 2.2배가 높아 영양적으로 의미가 있다고 판단되었다.
- 3)에 비하여 낮았다. 가수분해물에 대한 색조의 결과로 미루어 보아 색의 강도가 Neutrase 가수분해물이 Flavourzyme 가수분해물과 Protamex 가수분해물에 비하여 진할 것으로 판단되었으나, Alcalase 가수분해물에 비하여서는 다소 연하리라 예상되었다.
- 따라서, 효소 가수분해물은 대조구에 비하여 색이 다소 진하면서 탁한 경향을 나타내었다. 가수분해물의 명도, 적색도 및 황색도는 5% 유의 수준에서 Neutrase 가수분해물(각각 24.7, 5.5 및 15.3)이 Flavourzyme 가수분해물(각각 34.8, 7.5 및 19.9) 및 Protamex 가수분해물(각각 31.7, 7.9 및 18.3)에 비하여 낮았고, Alcalase 가수분해물(각각 17.5, 5.0 및 10.4)에 비하여 높았다. 가수분해물에 대한 명도의 결과는 관능적인 탁도와 일치하는 경향을 나타내었다.
- 그러나, Alcalase 처리 가수분해물의 수율은 6시간까지 계속적으로 증가하는 경향을 나타내었다. 고온가압 추출물에 효소 4종을 4시간 처리한 후의 수율은 Neutrase 가수분해물이 47.6%로 가장 높았고, 다음으로 Protamex 가수분해물(45.0%) 및 Flavourzyme 가수분해물(42.7%)의 순이었으며, Alcalase 가수분해물이 31.8%로 가장 낮았다. 효소로 4시간동안 처리한 가수분해물의 수율은 추출물의 그것(19.
- 고온 가압 추출물에 상업적 효소 4종을 4시간 동안 반응시켜 얻은 가수분해물의 색을 헌터 색차계로 살펴본 결과는 Table 2와 같다. 관능적으로 살펴본 고온가압 추출물(대조구)의 색은 맑으면서 옅은 갈색이었던 반면 가수분해물의 색은 이보다 불투명하고 짙은 갈색을 나타내었다(데이터 미제시). 효소 가수분해물 간의 관능적 색은 Alcalase 가수분해물이 가장 짙은 갈색을 나타내었고, 다음으로 Neutrase 가수분해물의 순이었으며, Protamex 가수분해물 및 Flavourzyme 가수분해물 간에는 차이가 없었다(데이터 미제시).
- 따라서, TCA soluble index에 의한 효소 가수분해물의 맛의 강도로 판단할 때 적정 효소 가수분해 시간은 Flavourzyme 가수분해물의 경우 2시간, Protamex 가수분해물의 경우 3시간, Alcalase 가수분해물의 경우 4시간, 그리고 Neutrase 가수분해물의 경우 6시간이었다. 한편, 추출물을 4시간 동안 효소 처리한가수분해물의 TCA soluble index는 Protamex 가수분해물이 55.
- 3%) 간 항산화 활성은 그 차이가 2% 이내이었다. 따라서, 고온가압 추출물을 4시간 동안 적용하는 경우 가수분해물은 고혈압 저해 활성은 물론이고 항산화 활성도 기대되었다. 효소 4종(Alcalase, Neutrase, Flavourzyme 및 Protamex)을 굴 자숙액에 적용한 결과 항산화성이 대조구에 비하여 51%가 개선되고, 이들은 DPPH 라디칼의 소거 활성보다 superoxide 라디칼, hydroxyl 라디칼 및 alkyl 라디칼의 소거 활성이 우수하였다(Kang et al.
- 7%로 가장 낮았다. 따라서, 실험에 사용한 효소는 수율을 개선하기 위한 적정 조건에서 처리하는 경우에도 가수분해물은 맛의 강도 또한 개선하리라고 판단되었고, 그 중에서도 특히, Protamex로 처리한 가수분해물의 개선 효과가 가장 뚜렷하리라 판단되었다.
- 3 범위를 나타내어, 대조구에 비하여 명도 및 황색도의 경우 낮았고, 색차의 경우 높았으나, 적색도의 경우 가수분해물에 따라 높거나 낮아 일정한 경향을 나타내지 않았다. 따라서, 효소 가수분해물은 대조구에 비하여 색이 다소 진하면서 탁한 경향을 나타내었다. 가수분해물의 명도, 적색도 및 황색도는 5% 유의 수준에서 Neutrase 가수분해물(각각 24.
- 이들 추출물 및 가수분해물의 단백질을 구성하는 주요 아미노산으로는 효소 가수분해물과 대조구가 모두 aspartic acid, glutamic acid, glycine 및 alanine 등이었다. 따라서, 효소 가수분해물의 주요 구성아미노산은 추출액(대조구)의 그것에 비하여 종류 및 조성의 경우 유사하였으나, 함량의 경우 많았다. Tryptophan을 제외한 9종의 필수아미노산(threonine, valine, leucine, isoleucine, lysine, methionine, phenylalanine, histidine 및 arginine)의 함량은 효소 가수분해물의 경우 2,349.
- 주요 유리아미노산은 효소 가수분해물과 대조구가 모두 taurine, glutamic acid 등이었다. 따라서, 효소 가수분해물의 주요 유리아미노산은 대조구의 그것에 비하여 함량에 있어 약간의 차이가 있었으나, 종류와 조성 등의 경우 차이가 없었고, 기타 유리아미노산의 경우도 주요 유리아미노산의 경향과 유사하였다. 한편, 고온 가압 명태 두부 추출액에는 근년에 항산화성 등과 같은 건강 기능성으로 주목을 받고 있는 anserine과 carnosine (Fu et al.
- 030 g/100 mL) 등의 순으로 낮아 맛에 민감하리라 생각되었다. 유리아미노산 함량을 토대로 맛의 주성분과 강도를 확인하기 위하여 taste value를 환산한 결과 효소 가수분해물의 total taste value는 24.03이었고, 이는 대조구의 12.91에 비하여 높았다. Total taste value가 대조구에 비하여 효소 가수분해물이 높은 것은 상업적 효소에 의해 추출물의 고형물로부터 많은 단백질이 가용화되어 가수분해물로 이행되었을 뿐만이 아니라 기존 가용화 단백질의 경우도 절단 유리되었기 때문이라 판단되었다.
- 이어서 명태 두부는 저온실(5℃ 부근)에서 해동하고 두 쪽으로 쪼개어 냉풍건조(18℃, 4일) 시킨 후, 그리고 다시마 부산물은 비닐 백에 넣은 후 -25℃ 냉동고에 보관하여 두고 실험에 사용하였다. 이 때 원료로 사용한 명태 두부, 및 비정형 다시마의 일반성분 함량은 수분의 경우 각각 78.0% 및 13.5%이었고, 조단백질의 경우 각각 14.1% 및 7.9%이었으며, 조지방의 경우 각각 2.2% 및 1.0%, 회분의 경우 각각 5.5% 및 32.3%이었다.
- , 2006). 이러한 일면에서 효소 가수분해물과 대조구의 각각 100 mL를 섭취하는 경우 건강 기능 효과를 기대할 수 있는 일일 섭취량에 대하여 철은 각각 8.3% 및 3.3%, 칼슘(성인기준)은 각각 1.7% 및 1.2%, 칼륨은 각각 11.3% 및 14.1%, 인은 각각 20.0% 및 14.4%, 마그네슘(500 mg 기준)은 각각 4.6% 및 5.1%에 해당하여 칼륨과 인의 보강 효과 이외에는 크게 기대할 수 없으리라 판단되었다.
- 이상에서 언급한 결과에 의하면 고온가압 추출물에 Neutrase를 적정온도에서 4시간 동안 처리하는 경우 수율과 맛이 개선되고 생리활성도 개선될 것으로 판단되었다.
- 고온가압 추출 마쇄물에 최적 효소로 구명된 Neutrase를 4시간 동안 반응시켜 얻은 가수분해물과 추출액(대조구)의 총아미노산 함량은 Table 3과 같다. 총 아미노산의 총함량은 효소 가수분해물이 5,897.7 mg/100 mL로, 대조구의 2,876.5 mg/100mL에 비하여 약 2.1배가 높았다. 이와 같은 결과는 상업적 효소에 의해 추출물에 함유되어 있던 고형물이 가용화되어 가수분해물로 이행되었기 때문이라 판단된다.
- 7%이었다. 한편, 고온가압 추출물에 효소를 4시간 동안 처리한 가수분해물의 ACE 저해 활성은 Neutrase 가수분해물이 80.7%로 가장 높았고, 다음으로 Alcalase 가수분해물(76.3%), Protamex 가수분해물(74.0%)의 순이었으며, Flavourzyme 가수분해물의 경우 57.3%로 가장 낮았다. 효소의 종류를 달리하여 제조한 가수분해물 간 ACE 저해 활성 차이는 가수분해를 위하여 사용한 효소의 기질 특이성에 의해 생성된 peptide의 구조 차이 때문이라 판단되었다.
- 따라서, TCA soluble index에 의한 효소 가수분해물의 맛의 강도로 판단할 때 적정 효소 가수분해 시간은 Flavourzyme 가수분해물의 경우 2시간, Protamex 가수분해물의 경우 3시간, Alcalase 가수분해물의 경우 4시간, 그리고 Neutrase 가수분해물의 경우 6시간이었다. 한편, 추출물을 4시간 동안 효소 처리한가수분해물의 TCA soluble index는 Protamex 가수분해물이 55.3%로 가장 높았고, 다음으로 Neutrase 가수분해물(53.5%), Alcalase 가수분해물(51.8%)의 순이었으며, Flavourzyme 가수분해물이 50.7%로 가장 낮았다. 따라서, 실험에 사용한 효소는 수율을 개선하기 위한 적정 조건에서 처리하는 경우에도 가수분해물은 맛의 강도 또한 개선하리라고 판단되었고, 그 중에서도 특히, Protamex로 처리한 가수분해물의 개선 효과가 가장 뚜렷하리라 판단되었다.
- 관능적으로 살펴본 고온가압 추출물(대조구)의 색은 맑으면서 옅은 갈색이었던 반면 가수분해물의 색은 이보다 불투명하고 짙은 갈색을 나타내었다(데이터 미제시). 효소 가수분해물 간의 관능적 색은 Alcalase 가수분해물이 가장 짙은 갈색을 나타내었고, 다음으로 Neutrase 가수분해물의 순이었으며, Protamex 가수분해물 및 Flavourzyme 가수분해물 간에는 차이가 없었다(데이터 미제시). 이러한 결과는 가수분해물의 고형물과 가용성 질소 화합물의 농도 및 가수분해 중 진행된 갈변 반응 등에 의한 영향이라 판단되었다.
- 3%이었다. 효소 가수분해물의 TCA soluble index는 효소의 종류에 관계없이 서서히 증가하는 경향을 나타내었으나, Flavourzyme 가수분해물의 경우 2시간까지 49.1%로, Protamex 가수분해물의 경우 3시간까지 54.1%로, Alcalase 가수분해물의 경우 4시간까지 51.8%로, 그리고 Neutrase 가수분해물의 경우 6시간까지 56.1%로 증가하였고, 이후 미미한 변화가 있거나 거의 변화가 없었다. 효소 종류에 따라 가수분해물의 TCA soluble index 변화 패턴에 차이가 있는 것은 이들 효소 간의 기질 특이성 때문이라 판단되었다.
- 4%이었다. 효소 가수분해물의 항산화 활성은 Alcalase 가수분해물이 88.7%로 가장 우수하였고, Neutrase 가수분해물(74.1%), Flavourzyme 가수분해물(73.8%) 및 Protamex 가수분해물(72.3%) 간 항산화 활성은 그 차이가 2% 이내이었다. 따라서, 고온가압 추출물을 4시간 동안 적용하는 경우 가수분해물은 고혈압 저해 활성은 물론이고 항산화 활성도 기대되었다.
- 8%로 가장 낮았다. 효소로 4시간동안 처리한 가수분해물의 수율은 추출물의 그것(19.5%)에 비하여 Neutrase 가수분해물의 경우 144.1%가, Protamex 가수분해물의 경우 130.8%가, Flavourzyme 가수분해물의 경우 119.0%가, Alcalase 가수분해물의 경우 63.1%가 개선되었다. 따라서, 천연 향미 물질의 베이스로 제조하기 위하여 이들 효소 4종을 원료 추출물에 응용하는 경우 수율 개선 효과는 확연히 인지되었다.
후속연구
- 이상의 결과로부터 고온가압 처리한 명태 두부 및 다시마 부산물 유래 추출물에 Neutrase로 4시간 동안 가수분해하는 경우 이의 수율 개선 뿐만이 아니라, 맛과 생리활성도 개선되어, 이의 용도 확대가 기대되었다.
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