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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 platycodin D의 항암활성에 관한 기전을 조사하기 위하여 다양한 인체 암세포주를 대상으로 항암 활성의 정도를 비교하였으며, 그 중 세포독성에 대한 감수성이 가장 높았던 인체 혈구암세포인 U937 세포를 대상으로 platicodin D에 의한 암세포 성장억제 효과와 apoptosis 유발에 어떠한 영향을 미치는 지를 유전자 수준에서 조사한 결과 Bcl-2 family와 IAP family에 관여하는 몇 가지 중요한 유전자들과 caspase-3의 발현 변화에 대한 유의적인 결과를 얻었기에 이를 보고하는 바이다.
- 3). 또한 caspase의 활성화가 apoptosis의 유발에 대한 증거가 될 수 있다고 보고되어진 바 본 연구에서는 effector caspase인 caspase-3의 발현 및 활성에 platycodin D가 어떠한 영향을 미치는 지를 조사하였다. 그 결과, caspase-3의 불활성화 단백질의 발현이 감소하는 반면 활성화 단백질의 발현이 증가하는 것으로 나타났으며, caspase-3의 기질단백질인 PARP의 경우에도 platycodin D의 처리에 의하여 단편화가 유발되는 것으로 나타났다(Fig.
- 본 연구에서는 도라지 뿌리에서 유래된 platycodin D에 의하여 유발되는 인체암세포의 증식억제 및 apoptosis 기전을 알아보기 위하여 고형암세포인 간암세포(HepG2 및 Hep3B), 대장암세포(HT29 및 HCT116) 및 인체 혈구암세포(U937 및 HL-60)를 대상으로 증식억제 정도를 조사하였다. Fig.
- 따라서 caspase의 활성화는 apoptosis의 유발에 대한 직접적인 증거로서 많은 선행연구 등에서 검증되어 왔다. 본 연구에서는 지금까지 알려진 caspase 중 apoptosis가 유발될 때 최종적으로 높은 활성도를 보여주는 caspase-3의 발현 및 in vitro 활성에 미치는 platycodin D의 영향을 조사하였다. Fig.
제안 방법
- 150 μg의 단백질이 함유된 50 μl의 sample에 기질 100 μM이 함유된 reaction buffer [40 mM HEPES (pH 7.4), 20% glycerol (v/v), 1 mM EDTA, 0.2% NP-40 and 10 mM DL-DTT] 50 μl를 혼합하여 각 sample 당 총 volume이 100 μl가 되게 하였다.
- Apoptosis 유발의 증거 중 하나인 DNA fragmentation 현상의 분석을 위하여 정상 및 platycodin D가 48시간 동안 처리된 세포들을 모은 다음 lysis buffer [5 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM EDTA, 0.5% Triton X-100]를 첨가하여 상온에서 30분간 lysis 시킨 다음 14,000 rpm, 4℃에서 20분간 원심분리하여 찌꺼기가 제거된 상층액 750 μl를 회수하였다.
- Apoptosis가 유발되었을 경우 특이적으로 나타나는 핵의 형태적 변화를 관찰하기 위하여 platycodin D가 처리된 세포를 모은 다음 37% formaldehyde 용액과 PBS를 1:9의 비율로 섞은 fixing solution으로 10분 동안 고정하였다. 고정된 세포를 cytospin을 이요하여 slide glass에 부착하였다.
- Caspases-3의 활성 정도가 platycodin D 처리에 의하여 어떠한 변화를 유발하는지 알아보기 위하여 정상 및 platycodin D가 처리된 배지에서 48 시간 배양된 세포를 모은 뒤 상기와 동일한 방법으로 단백질을 추출하고 정량하였다. 150 μg의 단백질이 함유된 50 μl의 sample에 기질 100 μM이 함유된 reaction buffer [40 mM HEPES (pH 7.
- 배양이 끝난 다음 MTT 시약을 제거하고 dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma)로 생성된 formazan을 모두 녹인 후 ELISA reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Platycodi D 처리에 의한 U937 세포의 형태 변화 정도를 살펴보기 위하여 platycodin D를 적정 농도로 희석 처리하여 배양 48시간 경과 후 도립 현미경을 이용하여 200배의 배율로 관찰하였다.
- Platycodin D 처리시 생존율 감소 및 증식억제 현상에 따른 U937 세포의 형태변화를 관찰하기 위하여 platycodin D를 다양한 농도 범위로 48시간 동안 처리한 후 도립현미경을 이용하여 정상 및 platycodin D이 처리된 조건에서 배양된 U937의 모양을 관찰하였다. Fig.
- Platycodin D 처리에 따른 apoptosis 유발과정에서 미토콘드리아막 전위(MMP)의 변화 여부를 조사하기 위하여 dual-emission potential-sensitive probe인 5,5 V, 6,6 V-tetrachloro-1,1 V,3,3 V-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide (JC-1, Sigma) 염색을 실시하였다. 이를 위하여 정상 및 platycodin D이 처리된 배지에서 배양된 세포들을 원심분리를 이용하여 모으고, PBS로 수세 후, 2 mg/l의 JC-1을 배지에 희석하여 37℃에서 20분간 염색하고 수세 후, flow cytometer를 이용하여 분석하였다.
- 2A). Platycodin D 처리에 의하여 나타나는 증식 억제 및 형태 변화가 apoptosis 유발과 어떠한 연관성이 있는지를 확인하기 위하여 먼저 암세포의 핵 형태 변화를 관찰한 결과, platycodin D 처리 농도의 증가에 따라 핵의 밀도 감소와 더불어 nucleosome의 linker DNA 부분의 절단을 유발함으로써 나타나는 DNA 단편화 현상으로서 apoptosis 유발 시 전형적으로 관찰되는 염색질 응축에 의한 apoptotic body 형성을 관찰할 수 있었고, anexin V 분석에 의한 apoptosis 유도의 정량적 증가를 제시하였다 (Fig. 2B 및 C). 아울러 또 다른 apoptosis 유발의 직접적인 증거인 DNA 단편화 여부를 확인한 결과, platycodin D를 처리하지 않은 조건에서 배양된 세포의 경우 DNA 단편화 현상을 관찰할 수 없었지만 platycodin D 처리농도 증가에 따라 endonuclease가 활성화되어 chromosomal DNA가 단편화되어 나타나는 DNA 단편화 현상을 관찰할 수 있었다(Fig.
- Platycodin D 처리에 의한 apoptosis 유발 기전해석의 일환으로 주요 apoptosis 조절인자들의 발현에 미치는 platycodin D의 영향을 RT-PCR과 Western blotting을 통하여 mRNA 및 단백질 수준에서의 변화 여부를 확인하였다. 먼저 Bcl-2 family에 속하는 인자들 중, pro-apoptotic 유전자인 Bax의 발현이 platycodin D 처리농도 의존적으로 현저하게 증가된 반면, anti-apoptotic 유전자인 Bcl-2 및 Bcl-xL의 발현에는 큰 변화가 관찰되지 않았다(Fig.
- Platycodin D의 처리에 의한 U937 세포의 증식억제에 미치는 Bcl-2의 영향을 비교하기 위하여 Bcl-2가 과발현된 U937/Bcl-2 세포주의 Bcl-2 단백질 발현의 정도를 U937/ vector 세포주와 먼저 비교하였다. Fig.
- U937 세포에서 platycodin D가 유발하는 apoptosis 정도를 정량적으로 분석하기 위하여 정상 및 platycodin D가 48시간 동안 처리된 세포들을 모은 다음 2,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 상층액을 제거한 후 PBS를 이용하여 2~3회 정도 세척하였다. 준비된 세포는 CycleTEST PLUS DNA REAGENT Kit(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 이용하여 고정 및 염색을 하여 4℃, 암실에서 30분 동안 반응을 시켰다.
- 분리된 RNA를 정량한 후, 각각의 primer, DEPC water 그리고 ONE-STEP RT-PCR PreMix Kit (Intron, Korea)를 넣고 Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany)를 이용하여 증폭하였다. 각 PCR 산물들의 양적 차이를 확인하기 위하여 1X TAE buffer로 1.5% agarose gel을 만들고 well 당 각각의 primer에 해당하는 PCR 산물에 DNA gel loading solution을 섞어서 loading 한 후 50 V에서 전기영동을 행하였다. 전기영동으로 DNA 분리가 끝난 gel을 EtBr로 염색한 후 UV 하에서 관찰하였으며, glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase (GAPDH)를 internal control로 사용하였다.
- 동일한 조건에서 배양된 U937 세포들에 TRIzol reagent (Invitrogen Co., Carlsbad, CA)를 이용하여 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 정량한 후, 각각의 primer, DEPC water 그리고 ONE-STEP RT-PCR PreMix Kit (Intron, Korea)를 넣고 Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany)를 이용하여 증폭하였다.
- 또한 caspases-3의 in vitro 활성 측정을 위한 colorimetric assay kits는 R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였으며, caspase-3의 활성을 억제하기 위하여 사용된 caspase-3 specific inhibitor인 z-DEVD-fmk는 CalBiochem (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다.
- DNA pellet에 RNase A가 적당량 들어있는 TE buffer를 이용하여 녹인 후, 6X gel loading dye (Bioneer, Daejeon, Korea)를 섞어 주었다. 마지막으로 1.6% agarose gel을 만들어서 1시간 동안 50 V로 전기영동 시킨 후 ethidium bromide (EtBr, Sigma)로 염색하여 DNA fragmentation 현상을 확인한 다음 ultra vilolet (UV) 하에서 관찰하였다.
- 준비된 세포는 CycleTEST PLUS DNA REAGENT Kit(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 이용하여 고정 및 염색을 하여 4℃, 암실에서 30분 동안 반응을 시켰다. 반응시킨 세포를 35-mm mesh를 이용하여 단일세포로 분리한 후 FACSCalibur (Becton Dickinson)를 적용시켜 형광반응에 따른 Cellular DNA content 및 histogram을 CellQuest software 및 ModiFit LT (Becton Dickinson) 프로그램을 이용하여 분석하였다.
- 분리된 단백질이 전이된 nitrocellulose membrane을 5% skim milk를 처리하여 비특이적인 단백질들에 대한 blocking을 실시하고 1차 antibody를 처리하여 상온에서 2시간 이상 또는 4℃에서 over night 시킨 다음 PBS-T로 세척하고 처리된 1차 antibody에 맞는 2차 antibody 를 사용하여 상온에서 1시간 정도 반응시켰다. 반응이 끝난 후 암실에서 Enhanced Chemiluminoesence(ECL) solution (Amersham Life Science Corp., Arlington Heights, IL, USA)을 적용시킨 다음 X-ray film에 감광시켜 특정단백질의 발현 양을 분석하였다.
- , Carlsbad, CA)를 이용하여 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 정량한 후, 각각의 primer, DEPC water 그리고 ONE-STEP RT-PCR PreMix Kit (Intron, Korea)를 넣고 Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany)를 이용하여 증폭하였다. 각 PCR 산물들의 양적 차이를 확인하기 위하여 1X TAE buffer로 1.
- 세포 배양용 6 well plate에 3×105개/ml로 암세포를 분주하고 platycodin D를 배지에 희석하여 각 well 당 적정 농도로 처리하였다.
- 세포가 부착된 slide glass를 PBS로 2~3회 정도 세척하고 PBS가 마르기 전에 0.2%의 Triton X-100 (Amresco)을 첨가하여 상온에서 10분간 고정한 후 2.5 μg/ml 농도의 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Sigma) 용액을 처리하여 상온에서 15분간 염색하였다.
- 실험에 사용된 인체 혈구암세포(U937 및 HL-60), 인체 간암세포(HepG2 및 Hep3B), 대장암세포(HT29 및 HCT116)는 한국생명공학연구소(KRIBB, Daejeon, Korea)에서 분양 받았으며, 암세포의 배양을 위해 RPMI-1640 배지(Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA)와 10%의 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS) 및 1%의 penicillin 및 streptomycin (Biofluids, Rockville, MD, USA)이 포함된 성장배지를 사용하여 37℃, 5%, CO2 조건 하에서 배양하였다. 세포수의 증식에 따른 과밀도 현상을 해소하기 위하여 성장배지의 교환을 매 48시간마다 실시하여 적정수의 세포를 유지하였다. 아울러 Bcl-2의 과발현이 platicodin D에 의한 apoptosis에 미치는 영향을 조사하기 위하여 U937 세포에서 Bcl-2가 과발현된 세포주(U937/Bcl-2)를 사용하였다.
- 2B에서도 platycodin D 처리시 농도 의존적으로 세포의 밀도가 감소하였고, 전형적으로 apoptosis가 일어난 세포에서 관찰되는 apoptotic body의 형성이 증가하는 것을 확인하였다. 아울러 platycodin D 처리에 의하여 유발되는 apoptosis의 정도를 정량화하기 위하여 annexin V에 positive한 염색 반응을 보이는 세포의 정도를 DNA flow cytometry를 이용하여 분석하였다. Fig.
- 여기에 caspase-3에 따른 기질 5 μl를 첨가하여 37℃, 암실에서 3시간 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 405 nm의 흡광도를 이용하여 반응의 정도를 측정하였다.
- 5 μg/ml 농도의 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Sigma) 용액을 처리하여 상온에서 15분간 염색하였다. 염색이 끝난 후 400배의 배율로 각 농도에 따른 암세포의 핵의 형태 변화를 관찰하였다.
- 2D에 나타낸 바와 같이 platycodin D 처리에 의해 DNA가 단편화되는 것을 알 수 있었다. 이러한 apoptosis 유발 정도를 정량적으로 재분석하기 위하여 상기와 동일한 조건으로 배양된 U937 세포를 대상으로 DNA flow cytometry를 이용하여 sub-G1기에 해당하는 세포의 빈도를 조사하였다. Fig.
- 2A에 나타난 바와 같이 platycodin D 처리농도가 증가할수록 전체적인 세포의 밀도가 감소하였고 apoptosis 유발 시 특이하게 관찰되는 membrane blebbing 현상을 포함한 형태적 변형이 관찰되었다. 이러한 세포의 형태적 변형이 apoptosis의 유발과 관계가 있을 것으로 예상되어 핵산에 특이적으로 결합하는 DAPI 염색을 통하여 현광현미경으로 관찰하였다. 그 결과 Fig.
- Platycodin D 처리에 따른 apoptosis 유발과정에서 미토콘드리아막 전위(MMP)의 변화 여부를 조사하기 위하여 dual-emission potential-sensitive probe인 5,5 V, 6,6 V-tetrachloro-1,1 V,3,3 V-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide (JC-1, Sigma) 염색을 실시하였다. 이를 위하여 정상 및 platycodin D이 처리된 배지에서 배양된 세포들을 원심분리를 이용하여 모으고, PBS로 수세 후, 2 mg/l의 JC-1을 배지에 희석하여 37℃에서 20분간 염색하고 수세 후, flow cytometer를 이용하여 분석하였다.
- 이상의 결과에서 platycodin D 처리에 따른 인체 혈구암세포인 U937 세포에서의 apoptosis 유발에 있어서 caspase-3의 활성화가 중요한 역할을 하는 것으로 나타났으므로 caspase-3의 활성을 억제하였을 경우에 apoptosis가 억제되는지의 여부를 MTT assay를 통한 세포 생존율 변화로서 조사하였다. 그 결과, Fig.
- 5% agarose gel을 만들고 well 당 각각의 primer에 해당하는 PCR 산물에 DNA gel loading solution을 섞어서 loading 한 후 50 V에서 전기영동을 행하였다. 전기영동으로 DNA 분리가 끝난 gel을 EtBr로 염색한 후 UV 하에서 관찰하였으며, glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase (GAPDH)를 internal control로 사용하였다.
대상 데이터
- U937/Bcl-2 세포는 계명대학교 의과대학 면역학교실 권택규 교수에게 제공받았으며 0.7 μg/ml geneticin(G418 sulfate, Calbiochem)이 첨가된 배지를 사용하여 배양하였다.
- 본 실험에 사용된 actin, Bcl-2, Bcl-XL, Bax, XIAP, cIAP-1, cIAP-2, caspase-3 및 PARP 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였으며, immunoblotting을 위해 2차 항체로 사용된 horseradish peroxidase(HRP)-conjugated anti-mouse 및 anti-rabbit 항체는 Amersham Life Science Corp. (Arlington Heights, IL, USA)에서 구입하였다. 또한 caspases-3의 in vitro 활성 측정을 위한 colorimetric assay kits는 R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였으며, caspase-3의 활성을 억제하기 위하여 사용된 caspase-3 specific inhibitor인 z-DEVD-fmk는 CalBiochem (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다.
- 여기에 caspase-3에 따른 기질 5 μl를 첨가하여 37℃, 암실에서 3시간 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 405 nm의 흡광도를 이용하여 반응의 정도를 측정하였다. 실험에 사용된 기질은 Asp-Glu-Val-Asp (DEVD)-p-nitroaniline (pNA)였다.
- 실험에 사용된 인체 혈구암세포(U937 및 HL-60), 인체 간암세포(HepG2 및 Hep3B), 대장암세포(HT29 및 HCT116)는 한국생명공학연구소(KRIBB, Daejeon, Korea)에서 분양 받았으며, 암세포의 배양을 위해 RPMI-1640 배지(Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA)와 10%의 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS) 및 1%의 penicillin 및 streptomycin (Biofluids, Rockville, MD, USA)이 포함된 성장배지를 사용하여 37℃, 5%, CO2 조건 하에서 배양하였다. 세포수의 증식에 따른 과밀도 현상을 해소하기 위하여 성장배지의 교환을 매 48시간마다 실시하여 적정수의 세포를 유지하였다.
- 세포수의 증식에 따른 과밀도 현상을 해소하기 위하여 성장배지의 교환을 매 48시간마다 실시하여 적정수의 세포를 유지하였다. 아울러 Bcl-2의 과발현이 platicodin D에 의한 apoptosis에 미치는 영향을 조사하기 위하여 U937 세포에서 Bcl-2가 과발현된 세포주(U937/Bcl-2)를 사용하였다. U937/Bcl-2 세포는 계명대학교 의과대학 면역학교실 권택규 교수에게 제공받았으며 0.
이론/모형
- (D) The cells were pre-treated with z-DEVD-fmk (50 μM) for 1 hr before a challenge with platycodin D for 48 hr. The level of cell viability was measured using a MTT assay. Results are expressed as percentage of the vehicle treated control ± SD of three separate experiments.
- 5), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM phenymethylsulfonyl fluoride (PMSF), 5 mM dithiothreitol (DTT)]를 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 총 단백질을 분리하였다. 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 정량 시약(Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 사용방법에 준하여 정량 후 다음 동량의 Laemmli sample buffer (Bio-Rad)를 섞어서 sample을 만들었다. 동량의 sample을 sodium dodecyl sulphate (SDS)-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리한 후, nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)으로 electroblotting에 의해 전이시켰다.
성능/효과
- 본 연구에서는 도라지 뿌리에서 유래된 platycodin D에 의하여 유발되는 인체암세포의 증식억제 및 apoptosis 기전을 알아보기 위하여 고형암세포인 간암세포(HepG2 및 Hep3B), 대장암세포(HT29 및 HCT116) 및 인체 혈구암세포(U937 및 HL-60)를 대상으로 증식억제 정도를 조사하였다. Fig. 1B의 결과에 의하면 동일 조건에서 부착성 암세포주에서는 platycodin D에 의한 증식억제 효과가 크게 나타나지 않은 반면 혈구암세포주에서는 증식억제 효과가 크게 나타났으며, 특히 U937 세포에서 platycodin D에 대한 감수성이 가장 높게 나타났다. 이러한 증식 억제 현상이 암세포의 형태 변화에 영향을 미치는 지를 확인한 결과, platycodin D 처리농도 의존적으로 급격한 세포 밀도의 감소 현상이 나타났으며, 특히 apoptosis 유발 시 특이하게 관찰되는 membrane blebbing 현상 등과 같은 심한 형태적 변형이 관찰되었다(Fig.
- 아울러 platycodin D 처리에 의하여 유발되는 apoptosis의 정도를 정량화하기 위하여 annexin V에 positive한 염색 반응을 보이는 세포의 정도를 DNA flow cytometry를 이용하여 분석하였다. Fig. 2C에서 알 수 있듯이 platycodin D의 처리 농도 증가에 따라, annexin V에 positive한 세포의 수가 점점 증가하는 것을 확인하였다. 또한 apoptosis 유발의 직접적인 증거에 해당하는 DNA의 단편화 여부를 확인한 결과, Fig.
- 이러한 apoptosis 유발 정도를 정량적으로 재분석하기 위하여 상기와 동일한 조건으로 배양된 U937 세포를 대상으로 DNA flow cytometry를 이용하여 sub-G1기에 해당하는 세포의 빈도를 조사하였다. Fig. 2E의 결과에서 알 수 있듯이 platycodin D 처리 농도의 증가에 따라 sub-G1기에 해당하는 세포의 빈도는 매우 증가함을 알 수 있었다. 즉 정상배지에서 자란 암세포의 경우에는 자연적 apoptosis 유발 빈도가 약 4.
- 본 연구에서는 지금까지 알려진 caspase 중 apoptosis가 유발될 때 최종적으로 높은 활성도를 보여주는 caspase-3의 발현 및 in vitro 활성에 미치는 platycodin D의 영향을 조사하였다. Fig. 4A의 결과에서 알 수 있듯이 platycodin D 처리 농도 의존적으로 비활성화 상태의 pro-form의 caspase-3의 발현이 감소하였으며, 활성화 상태의 cleavage-form이 점차 증가됨을 알 수 있었다. 또한 caspase-3의 활성 여부를 재확인하기 위하여 in vitro caspase-3 활성을 정량적인 방법으로 분석한 결과, Fig.
- Platycodin D의 처리에 의한 U937 세포의 증식억제에 미치는 Bcl-2의 영향을 비교하기 위하여 Bcl-2가 과발현된 U937/Bcl-2 세포주의 Bcl-2 단백질 발현의 정도를 U937/ vector 세포주와 먼저 비교하였다. Fig. 5A에 나타낸 Western botting의 결과에서 알 수 있듯이 U937/Bcl-2 세포에서의 Bcl-2 단백질의 발현은 U937/vector 세포보다 약 5배 이상 과발현되어 있음을 확인하였다. 다음은 이와 같은 Bcl-2 발현의 차이가 있는 두 세포주에서 platycodin D의 세포증식 억제의 정도를 MTT assay와 DAPI 염색을 통해서 확인한 결과 U937/Bcl-2에서도 U937/vector와 유사한 정도의 억제를 나타내었다(Fig.
- Platycodin D (Fig. 1A)의 처리에 따른 암세포 생존율 및 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 다양한 암세포들을 대상으로 MTT assay를 통하여 조사한 결과, Fig. 1B에서 볼 수 있듯이 조사된 모든 종류의 암세포에서 platycodin D 처리 농도 의존적으로 증식억제 효과를 보였으며, 12 μM 처리군에서 인체 혈구암세포인 U937에서 약 50% 이상의 증식억제 효과가 있었으나 HL-60 세포에서는 약 30% 정도의 증식억제를 보였다.
- 이러한 세포의 형태적 변형이 apoptosis의 유발과 관계가 있을 것으로 예상되어 핵산에 특이적으로 결합하는 DAPI 염색을 통하여 현광현미경으로 관찰하였다. 그 결과 Fig. 2B에서도 platycodin D 처리시 농도 의존적으로 세포의 밀도가 감소하였고, 전형적으로 apoptosis가 일어난 세포에서 관찰되는 apoptotic body의 형성이 증가하는 것을 확인하였다. 아울러 platycodin D 처리에 의하여 유발되는 apoptosis의 정도를 정량화하기 위하여 annexin V에 positive한 염색 반응을 보이는 세포의 정도를 DNA flow cytometry를 이용하여 분석하였다.
- 이상의 결과에서 platycodin D 처리에 따른 인체 혈구암세포인 U937 세포에서의 apoptosis 유발에 있어서 caspase-3의 활성화가 중요한 역할을 하는 것으로 나타났으므로 caspase-3의 활성을 억제하였을 경우에 apoptosis가 억제되는지의 여부를 MTT assay를 통한 세포 생존율 변화로서 조사하였다. 그 결과, Fig. 4D에서 나타난 바와 같이 platycodin D에 의하여 유발된 세포 증식억제가 caspase-3 특이적 저해제인 z-DEVDfmk를 1시간 선처리하여 caspase-3의 활성을 억제한 다음 platycodin D를 처리하였을 경우에는 정상배지에서 자란 암세포의 수준으로 회복되어platycodin D에 의하여 유발되는 apoptosis에 있어서 caspase-3이 중요한 조절자로서 역할을 하였음을 알 수 있었다.
- 또한 caspase의 활성화가 apoptosis의 유발에 대한 증거가 될 수 있다고 보고되어진 바 본 연구에서는 effector caspase인 caspase-3의 발현 및 활성에 platycodin D가 어떠한 영향을 미치는 지를 조사하였다. 그 결과, caspase-3의 불활성화 단백질의 발현이 감소하는 반면 활성화 단백질의 발현이 증가하는 것으로 나타났으며, caspase-3의 기질단백질인 PARP의 경우에도 platycodin D의 처리에 의하여 단편화가 유발되는 것으로 나타났다(Fig. 4). 이상의 결과에서 platycodin D에 의해 유발되는 apoptosis에 있어서 caspase-3가 중요한 역할을 할 것으로 생각되어 caspase-3 특이적 억제제인 z-DEVD-fmk를 이용하여 caspase-3의 활성을 억제하였을 경우에 platycodin D에 의하여 유발되는 apoptosis가 억제되는 지를 MTT assay를 이용하여 확인한 결과, platycodin D를 단독으로 처리하였을 경우에 나타난 증식억제 효과가 z-DEVD-fmk의 선처리에 의하여 현저하게 회복되었다(Fig.
- 3). 다음으로 caspases 활성을 억제함으로서 apoptosis를 억제하는 것으로 알려진 IAP family의 발현에 platycodin D이 어떠한 영향을 미치는 지를 확인한 결과, cIAP-1의 발현에는 큰 변화가 관찰되지 않았지만 XIAP 및 cIAP-2의 발현이 platycodin D 처리에 의하여 감소되는 것으로 나타났다. 이상의 결과를 살펴볼 때 platycodin D에 의하여 유발되는 apoptosis는 pro-apoptotic 유전자인 Bax의 증가와 IAP family 유전자 중 XIAP 및 cIAP-2의 발현 감소가 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.
- 4C에 나타난 바와 같이 DEVD-pNA를 기질로 한 in vitro 활성 결과에서도 caspase-3이 platycodin D 처리농도 의존적으로 증가하였다. 다음으로 활성화된 caspase-3에 의하여 특이하게 분해가 일어나는 기질 단백질의 발현에 미치는 platycodin D의 영향을 조사한 결과, platycodin D의 처리에 의하여 DNA repair와 genomic stability에 관여하는 PARP 단백질의 주단백질 발현감소와 더불어 단편화된 단백질의 발현 증가가 관찰되었다(Fig. 4A). 이러한 platycodin D 처리에 의한 U937 세포의 apoptosis 유발은 세포 내 에너지 생산 기관으로 세포의 생존에 중요한 기능을 주행하는 미토콘드리아의 손상과 연계성을 가지는지를 조사하기 위하여 JC-1 염색을 통한 MMP 소실의 정도를 조사한 결과, platycodin D 처리농도 의존적으로 MMP의 소실이 증가되어 platycodin D 처리에 의한 U937 세포의 apoptosis 유발은 미토콘드리아 기능 손상과 연계성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다(Fig.
- 5A에 나타낸 Western botting의 결과에서 알 수 있듯이 U937/Bcl-2 세포에서의 Bcl-2 단백질의 발현은 U937/vector 세포보다 약 5배 이상 과발현되어 있음을 확인하였다. 다음은 이와 같은 Bcl-2 발현의 차이가 있는 두 세포주에서 platycodin D의 세포증식 억제의 정도를 MTT assay와 DAPI 염색을 통해서 확인한 결과 U937/Bcl-2에서도 U937/vector와 유사한 정도의 억제를 나타내었다(Fig. 5B 및 C). 이러한 결과는 platycodin D에 의한 apoptosis 유발은 Bcl-2의 발현 차이와는 무관하다는 것을 의미한다.
- 2C에서 알 수 있듯이 platycodin D의 처리 농도 증가에 따라, annexin V에 positive한 세포의 수가 점점 증가하는 것을 확인하였다. 또한 apoptosis 유발의 직접적인 증거에 해당하는 DNA의 단편화 여부를 확인한 결과, Fig. 2D에 나타낸 바와 같이 platycodin D 처리에 의해 DNA가 단편화되는 것을 알 수 있었다. 이러한 apoptosis 유발 정도를 정량적으로 재분석하기 위하여 상기와 동일한 조건으로 배양된 U937 세포를 대상으로 DNA flow cytometry를 이용하여 sub-G1기에 해당하는 세포의 빈도를 조사하였다.
- 4A의 결과에서 알 수 있듯이 platycodin D 처리 농도 의존적으로 비활성화 상태의 pro-form의 caspase-3의 발현이 감소하였으며, 활성화 상태의 cleavage-form이 점차 증가됨을 알 수 있었다. 또한 caspase-3의 활성 여부를 재확인하기 위하여 in vitro caspase-3 활성을 정량적인 방법으로 분석한 결과, Fig. 4C에 나타난 바와 같이 DEVD-pNA를 기질로 한 in vitro 활성 결과에서도 caspase-3이 platycodin D 처리농도 의존적으로 증가하였다. 다음으로 활성화된 caspase-3에 의하여 특이하게 분해가 일어나는 기질 단백질의 발현에 미치는 platycodin D의 영향을 조사한 결과, platycodin D의 처리에 의하여 DNA repair와 genomic stability에 관여하는 PARP 단백질의 주단백질 발현감소와 더불어 단편화된 단백질의 발현 증가가 관찰되었다(Fig.
- 또한 인체 간암세포에서는 약 30-40%, 대장암세포에서는 약 10-20% 정도의 증식억제를 보여주었다. 또한 platycodin D 처리시 시간 의존적으로 세포 증식억제 효과를 보였으며(Fig. 1C), platycodin D는 특히 인체 혈구암세포인 U937 세포에서 농도 및 시간 의존적으로 감수성이 높게 나타났음을 알 수 있었다.
- 더불어 PARP와 β-catenin과 같은 단백질들의 단편화는 caspase의 활성화와 연관된 apoptosis가 유발되었음을 보여주는 지표 단백질로 활성화된 caspase-3의 표적 단백질로 알려져 있다[13, 16]. 많은 선행 연구들의 결과에서와 부분적으로 유사하게 RT-PCR과 Western blot 분석의 결과에서 알 수 있듯이 platycodin D가 처리된 배지에서 배양된 U937 세포에서 이들 유전자들은 매우 다양한 발현 양의 변화를 보여주었는데, apoptosis를 유도하는 Bax가 증가하는 반면, apoptosis를 억제하는데 관여하는 XIAP와 cIAP-2가 감소하였으나, Bcl-2, Bcl-xL 및 cIAP-1은 아무런 변화가 보이지 않았다(Fig. 3). 또한 caspase의 활성화가 apoptosis의 유발에 대한 증거가 될 수 있다고 보고되어진 바 본 연구에서는 effector caspase인 caspase-3의 발현 및 활성에 platycodin D가 어떠한 영향을 미치는 지를 조사하였다.
- Platycodin D 처리에 의한 apoptosis 유발 기전해석의 일환으로 주요 apoptosis 조절인자들의 발현에 미치는 platycodin D의 영향을 RT-PCR과 Western blotting을 통하여 mRNA 및 단백질 수준에서의 변화 여부를 확인하였다. 먼저 Bcl-2 family에 속하는 인자들 중, pro-apoptotic 유전자인 Bax의 발현이 platycodin D 처리농도 의존적으로 현저하게 증가된 반면, anti-apoptotic 유전자인 Bcl-2 및 Bcl-xL의 발현에는 큰 변화가 관찰되지 않았다(Fig. 3). 다음으로 caspases 활성을 억제함으로서 apoptosis를 억제하는 것으로 알려진 IAP family의 발현에 platycodin D이 어떠한 영향을 미치는 지를 확인한 결과, cIAP-1의 발현에는 큰 변화가 관찰되지 않았지만 XIAP 및 cIAP-2의 발현이 platycodin D 처리에 의하여 감소되는 것으로 나타났다.
- 2B 및 C). 아울러 또 다른 apoptosis 유발의 직접적인 증거인 DNA 단편화 여부를 확인한 결과, platycodin D를 처리하지 않은 조건에서 배양된 세포의 경우 DNA 단편화 현상을 관찰할 수 없었지만 platycodin D 처리농도 증가에 따라 endonuclease가 활성화되어 chromosomal DNA가 단편화되어 나타나는 DNA 단편화 현상을 관찰할 수 있었다(Fig. 2D). 이러한 apoptosis 유발 정도를 정량적으로 다시 확인하기 위하여 flow cytometry 분석에 의한 apoptosis 유발 세포군에 해당하는 sub-G1기에 속하는 세포들의 빈도를 조사한 결과, platycodin D를 처리하지 않았을 경우에는 약 4%의 apoptosis 유발 빈도가 나타났으나 platycodin D 처리 농도가 증가할수록 sub-G1기의 세포의 빈도가 증가하여 고농도인 15 μM 처리군에서는 약 30%에 해당하는 세포가 sub-G1기로 관찰되어 고농도 처리군에서 현저하게 증가한다는 것을 알 수 있었다(Fig.
- 이러한 apoptosis 유발 정도를 정량적으로 다시 확인하기 위하여 flow cytometry 분석에 의한 apoptosis 유발 세포군에 해당하는 sub-G1기에 속하는 세포들의 빈도를 조사한 결과, platycodin D를 처리하지 않았을 경우에는 약 4%의 apoptosis 유발 빈도가 나타났으나 platycodin D 처리 농도가 증가할수록 sub-G1기의 세포의 빈도가 증가하여 고농도인 15 μM 처리군에서는 약 30%에 해당하는 세포가 sub-G1기로 관찰되어 고농도 처리군에서 현저하게 증가한다는 것을 알 수 있었다(Fig. 4B).
- 4A). 이러한 platycodin D 처리에 의한 U937 세포의 apoptosis 유발은 세포 내 에너지 생산 기관으로 세포의 생존에 중요한 기능을 주행하는 미토콘드리아의 손상과 연계성을 가지는지를 조사하기 위하여 JC-1 염색을 통한 MMP 소실의 정도를 조사한 결과, platycodin D 처리농도 의존적으로 MMP의 소실이 증가되어 platycodin D 처리에 의한 U937 세포의 apoptosis 유발은 미토콘드리아 기능 손상과 연계성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다(Fig. 4B). 이상의 결과를 살펴볼 때 platycodin D 처리에 따른 인체 혈구암세포인 U937 세포에서의 apoptosis 유발은 pro-apoptotic 유전자인 Bax의 증가와 IAP family 유전자 중 XIAP 및 cIAP-2의 감소를 통해 미토콘드리아 기능 손상을 초래하여 caspase-3의 활성화와 더불어 기질단백질들의 단편화 및 발현 감소 등과 같은 전형적인 mitochodrial pathway를 통하여 일어난다는 것을 알 수 있었으며, 특히 caspase-3의 활성화가 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.
- 1B의 결과에 의하면 동일 조건에서 부착성 암세포주에서는 platycodin D에 의한 증식억제 효과가 크게 나타나지 않은 반면 혈구암세포주에서는 증식억제 효과가 크게 나타났으며, 특히 U937 세포에서 platycodin D에 대한 감수성이 가장 높게 나타났다. 이러한 증식 억제 현상이 암세포의 형태 변화에 영향을 미치는 지를 확인한 결과, platycodin D 처리농도 의존적으로 급격한 세포 밀도의 감소 현상이 나타났으며, 특히 apoptosis 유발 시 특이하게 관찰되는 membrane blebbing 현상 등과 같은 심한 형태적 변형이 관찰되었다(Fig. 2A). Platycodin D 처리에 의하여 나타나는 증식 억제 및 형태 변화가 apoptosis 유발과 어떠한 연관성이 있는지를 확인하기 위하여 먼저 암세포의 핵 형태 변화를 관찰한 결과, platycodin D 처리 농도의 증가에 따라 핵의 밀도 감소와 더불어 nucleosome의 linker DNA 부분의 절단을 유발함으로써 나타나는 DNA 단편화 현상으로서 apoptosis 유발 시 전형적으로 관찰되는 염색질 응축에 의한 apoptotic body 형성을 관찰할 수 있었고, anexin V 분석에 의한 apoptosis 유도의 정량적 증가를 제시하였다 (Fig.
- 5%가 관찰되었고 15 μM 의 농도에서는 약 30%에 해당하는 세포가 sub-G1기로 관찰되었다. 이상의 결과는 U937 세포에서 platycodin D 처리에 의한 생존율 감소, 증식억제 및 형태변화는 apoptosis 유발과 밀접한 연관이 있음을 의미한다.
- 4B). 이상의 결과를 살펴볼 때 platycodin D 처리에 따른 인체 혈구암세포인 U937 세포에서의 apoptosis 유발은 pro-apoptotic 유전자인 Bax의 증가와 IAP family 유전자 중 XIAP 및 cIAP-2의 감소를 통해 미토콘드리아 기능 손상을 초래하여 caspase-3의 활성화와 더불어 기질단백질들의 단편화 및 발현 감소 등과 같은 전형적인 mitochodrial pathway를 통하여 일어난다는 것을 알 수 있었으며, 특히 caspase-3의 활성화가 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.
- 다음으로 caspases 활성을 억제함으로서 apoptosis를 억제하는 것으로 알려진 IAP family의 발현에 platycodin D이 어떠한 영향을 미치는 지를 확인한 결과, cIAP-1의 발현에는 큰 변화가 관찰되지 않았지만 XIAP 및 cIAP-2의 발현이 platycodin D 처리에 의하여 감소되는 것으로 나타났다. 이상의 결과를 살펴볼 때 platycodin D에 의하여 유발되는 apoptosis는 pro-apoptotic 유전자인 Bax의 증가와 IAP family 유전자 중 XIAP 및 cIAP-2의 발현 감소가 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.
- 이상의 결과를 종합해 보면 인체 혈구암세포주인 U937 세포에 platycodin D를 처리하였을 경우에 유발되는 생존율 감소, 증식 억제 및 형태 변화는 apoptosis 유발과 밀접한 연관이 있었다. 이러한 apoptosis 유발은 Bax의 발현 증가와 연관된 미토콘드리아 막 전위의 소실 및 caspase-3의 활성화와 기질단백질들의 분해에 의한 것임을 알 수 있었으며, IAP family 인자들의 발현 감소가 caspase의 활성 증가에도 영향을 미친 것으로 추정된다.
- 4B). 이상의 결과에서 platycodin D 처리에 의한 인체 혈구암세포인 U937 세포의 생존율 감소, 증식 억제 및 형태변화는 apoptosis 유발에 의하여 일어나는 현상이라는 것을 알 수 있었다.
- 4). 이상의 결과에서 platycodin D에 의해 유발되는 apoptosis에 있어서 caspase-3가 중요한 역할을 할 것으로 생각되어 caspase-3 특이적 억제제인 z-DEVD-fmk를 이용하여 caspase-3의 활성을 억제하였을 경우에 platycodin D에 의하여 유발되는 apoptosis가 억제되는 지를 MTT assay를 이용하여 확인한 결과, platycodin D를 단독으로 처리하였을 경우에 나타난 증식억제 효과가 z-DEVD-fmk의 선처리에 의하여 현저하게 회복되었다(Fig. 4D). 한편 platycodin D의 처리에 의한 U937 세포의 증식억제에 미치는 Bcl-2의 영향을 비교하기 위하여 Bcl-2 과발현세포주인 U937/Bcl-2 세포를 사용하여 확인한 결과, platycodin D에 의한 apoptosis 유발에 Bcl-2의 과발현은 큰 영향을 주지 못하였다.
- 즉 정상배지에서 자란 암세포의 경우에는 자연적 apoptosis 유발 빈도가 약 4.5%로 매우 낮았으나 platycodin D 처리 농도가 증가할수록 sub-G1기의 세포의 빈도가 증가하여 12 μM의 농도에서는 약 24.5%가 관찰되었고 15 μM 의 농도에서는 약 30%에 해당하는 세포가 sub-G1기로 관찰되었다.
- 4D). 한편 platycodin D의 처리에 의한 U937 세포의 증식억제에 미치는 Bcl-2의 영향을 비교하기 위하여 Bcl-2 과발현세포주인 U937/Bcl-2 세포를 사용하여 확인한 결과, platycodin D에 의한 apoptosis 유발에 Bcl-2의 과발현은 큰 영향을 주지 못하였다.
후속연구
- 대부분의 혈구암은 항암제에 대한 화학적 저항성을 가지고 있으므로 치료가 어려우며 재발의 확률도 매우 높은 것으로 보고되어지고 있으며, 혈구암의 치료를 위하여 사용되어지고 있는 다양한 종류의 항암제들은 개개인에 따라서 약리작용이 다르게 나타나고 독성에 의한 부작용이 문제점으로 지적되고 있다. 따라서 혈구암을 치료하는데 있어서 보다 더 효과적인 후보 물질을 발굴하고 분자 및 세포 수준에서의 기전을 밝히는 것이 중요 할 것이다.
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