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문제 정의
- 따라서 무화과에 발생되는 잿빛곰팡이병의 정확한 분류·동정을 위해서는 병원균의 형태적 특성 및 유전자의 염기서열 분석이 필요하다. 따라서 본 연구에서는 무화과 수확기 과실에서 발생되는 잿빛곰팡이병에 대하여 형태적 특성 및 유전자의 염기서열 분석을 기초로 동정하였고, 그 결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
- ITS rDNA 영역의 염기서열을 분석하였다. 무화과에서 분리하여 GenBank에 등록된 JBARES31(KC184410), JBARES32, JBARES 33 균주(PCR product 515 bp)는 B.
- 분리 배양된 병원균의 정확한 동정을 위해서 ribosomal DNA(rDNA)의 internal transcribed spacer(ITS) 영역의 염기서열을 분석하였다. PDA에서 1주일동안 배양된 병원균의 균총을 긁어 마쇄한 후 DNeasy Plant Mini kit (QIAGEN, Valencia, CA)를 이용하여 genomic DNA를 분리하였다. rDNA ITS 영역을 프라이머 ITS1(5’-TCCGTA GGTGAAC CTGCGG-3’)과 ITS4(5’-TCCTC CGCTTA TTGATATGC-3’) 를 사용하여 PCR로 증폭시켰다(White et al.
- , 1994)로 정렬하였다. Phylogenetic analysis은 GenBank BLAST로 ITS 영역의 염기서열을 검색한 후 MEGA 4 program으로 neighbor-joining하였다. Sequence distance는 Tamura-Nei parameter model로 계산하였고, bootstrap analysis은 1,000반복으로 수행하였다 (Tamura et al.
- rDNA ITS 영역을 프라이머 ITS1(5’-TCCGTA GGTGAAC CTGCGG-3’)과 ITS4(5’-TCCTC CGCTTA TTGATATGC-3’) 를 사용하여 PCR로 증폭시켰다(White et al., 1990).
- 접종된 열매는 오염이나 건조한 상태를 방지하고자 비닐로 포장하였다. 또한 대조로는 병원균이 없는 PDA 절편을 병원성 검정과 같은 방법으로 접종하였다.
- 무화과에 대한 잿빛곰팡이병 병원성 검정은 전북농업기 술원 하우스 포장에서 수확기에 있는 무화과 열매에 접종하여 확인하였다. 접종원은 PDA에서 1주일간 배양된 잿빛곰팡이 균사의 균총을 cork-borer(No.
- 병원균 분리를 위해 실험실에서 병든 과실을 덮고 있는 병원균의 포자를 감자한천배지(PDA)에 옮겨 25°C에서 2-3일간 배양하였다. 병원균의 형태적 특징은 주사전자현미경(SEM)을 이용하여 병든 주에서 발생된 병원균과 PDA에서 배양된 병원균의 분생자경과 분생포자를 관찰하였다.
- 분리 배양된 병원균의 정확한 동정을 위해서 ribosomal DNA(rDNA)의 internal transcribed spacer(ITS) 영역의 염기서열을 분석하였다.
- 무화과에 대한 잿빛곰팡이병 병원성 검정은 전북농업기 술원 하우스 포장에서 수확기에 있는 무화과 열매에 접종하여 확인하였다. 접종원은 PDA에서 1주일간 배양된 잿빛곰팡이 균사의 균총을 cork-borer(No. 2)로 찍어 무화과 열매의 주머니 모양으로 오목하게 열개된 입구부분에 접종하였다. 접종된 열매는 오염이나 건조한 상태를 방지하고자 비닐로 포장하였다.
대상 데이터
- 무화과 잿빛곰팡이병은 2010년부터 2011년에 아열대작목을 시범적으로 재배하고 있는 전북 농업기술원 하우스 포장에서 발병하였다. 잿빛곰팡이병은 11월경의 저온상태 에서 발병이 심하였으며, 병원균은 갈색의 일부분으로 시작하여 점차 진전되어 후기에는 과실 전체가 잿빛곰팡이로 뒤덮였다.
이론/모형
- 5% agarose gel에서 분리한 후 PCR purification kit(Core-oneTM, Core-bio, Korea)로 정제하였다. ABI 3030 autosequencer를 이용하여 ITS1과 ITS4 염기서열을 분석하였으며, ITS rDNA sequence data는 DNASTAR program(DNASTAR Inc, USA)에서 CLUSTAL W method(Thompson et al., 1994)로 정렬하였다. Phylogenetic analysis은 GenBank BLAST로 ITS 영역의 염기서열을 검색한 후 MEGA 4 program으로 neighbor-joining하였다.
- Phylogenetic analysis은 GenBank BLAST로 ITS 영역의 염기서열을 검색한 후 MEGA 4 program으로 neighbor-joining하였다. Sequence distance는 Tamura-Nei parameter model로 계산하였고, bootstrap analysis은 1,000반복으로 수행하였다 (Tamura et al., 2007).
성능/효과
- 분생자경의 크기는 15-33 × 2 µm이며, 갈색 또는 투명한 색을 띄고 있었다. rDNA ITS 영역의 염기서열 분석결과 무화과 잿빛곰팡이병을 일으키는 병원균은 Botrytis cinerea로 등록된 GenBank accession number HQ171052, EU519210, HQ171053, FN812726, HM849615, EU563120 과 100% 일치하는 것으로 나타났다. 또한 Botrytis spp.
- 2). 따라서 무화과 잿빛곰팡이병을 일으키는 병원균을 분리배양하여 균학적 특성과 rDNA ITS영역의 염기서열을 분석한 결과 Yu 등(2011)과 Kwon 등(2011)이 보고한 B. cinerea와 일치하였다.
- cinerea와 같은 clade에 속함을 확인할 수 있었으며, 다른 group과는 57%의 similarity를 보였다. 따라서 무화과 잿빛곰팡이병을 일으키는 병원균을 분리배양하여 균학적 특성과 rDNA ITS영역의 염기서열을 분석한 결과 이미 보고된 B. cinerea와 일치하였다.
- 이는 무화과의 열매는 주머니 모양으로 오목하게 쑥 들어가 있고 안쪽에 잔꽃이 많이 달려있어 단맛의 점 액성 물질이 병원균 생장의 영양분으로 작용하였기 때문이다. 따라서 무화과에 잿빛곰팡이병을 일으키는 B. cinerea 는 병원성을 가지는 것으로 판단되었으며, 대조구로 병원 균이 없는 PDA만을 접종한 처리에서는 발병되지 않았다.
- ITS rDNA 영역의 염기서열을 분석하였다. 무화과에서 분리하여 GenBank에 등록된 JBARES31(KC184410), JBARES32, JBARES 33 균주(PCR product 515 bp)는 B. cinerea로 등록된 GenBank accession number HQ171052, EU519210, HQ171053, FN812726, HM849615, EU563120 과 100% 일치하는 것으로 나타났다. 또한 ITS영역에 대해 Botrytis spp.
- 또한 ITS영역에 대해 Botrytis spp.의 종간 비교에서도 B. cinerea와 같은 clade에 속함을 확인할 수 있었으며, 다른 group과는 57%의 similarity를 보였다(Fig. 2). 따라서 무화과 잿빛곰팡이병을 일으키는 병원균을 분리배양하여 균학적 특성과 rDNA ITS영역의 염기서열을 분석한 결과 Yu 등(2011)과 Kwon 등(2011)이 보고한 B.
- 또한 ITS영역에 대해 Botrytis spp.의 종간 비교에서도 B. cinerea와 같은 clade에 속함을 확인할 수 있었으며, 다른 group과는 57%의 similarity를 보였다(Fig. 2).
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