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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 국내산 울금의 항산화작용을 규명하기 위하여 흰쥐에 고지방·고콜레스테롤 식이와 함께 울금 분말을 농도별로 공급했을 경우 간조직의 자유라디칼 생성계와 제거계 및 산화적 손상에 미치는 영향을 관찰하였다.
제안 방법
- 1-chloro-2,4-dinitrobenzene(DCNB)과 환원형 glutathione(GSH)을 기질로 하여 25°C에서 20분간 반응하는 동안에 생성된 GSH-DCNB conjugate의 분자 흡광계수를 이용하였다.
- 0 mL가 되도록 하고 25°C, 240 nm에서 5분간 흡광도를 측정하였다. H2O2의 흡광도 변화와 H2O2의 몰흡광계수로 H2O2의 농도를 구하여 효소활성도를 계산하였다.
- , Bucheon, Korea)를 사용하여 감압농축 하고, 동결건조기(Bondiro, Ilshin, Dongducheon, Korea)로 건조하여 사용하였다. 각각의 추출물에 대한 수율은 추출 전의 시료 무게에 대한 동결건조 후 추출물의 무게를 측정하여 나타내었다. 본 연구에서 사용한 울금 추출물 분말은 추출한 후 동결건조 시켜 조제하여 사용하였다.
- 간장을 각 간엽에서 고르게 일정량을 취하여 Potter Elvehjem homogenizer(Dalhan, Seoul, Korea)를 사용하여 0.25 M sucrose/0.5 mM ethylene diamine teraacetic acid(EDTA)/5 mM N-2-hydroxyethyl-piperazine-N-2-ethane sulfonic acid(HEPES) 용액으로 10%(w/v) 마쇄액을 만들었다. 마쇄액의 일부를 8,000×g에서 20분간 원심분리 하여 그 상층액을 과산화지질 정량에 사용하였고, 나머지는 10,000×g에서 30분간 원심분리 하여 그 상층액 중 일정량을 취하여 0.
- 또 10,000×g 상층액의 일부는 다시 105,000×g에서 30분간 원심분리 하여 얻은 cytosol은 GSH-px의 활성도를 측정하였다.
- 마쇄액의 일부를 8,000×g에서 20분간 원심분리 하여 그 상층액을 과산화지질 정량에 사용하였고, 나머지는 10,000×g에서 30분간 원심분리 하여 그 상층액 중 일정량을 취하여 0.4배량의 ethanol : chloroform 냉혼합액(5:3)을 가하고 2분간 진탕한 다음 10,000×g에서 30분간 원심분리 하여 얻은 상층액을 세포질 SOD 원액으로 사용하였다.
- 본 연구는 흰쥐에 고지방․고콜레스테롤 식이와 함께 울금 분말을 농도별로 2.5%(TPA group), 5%(TPB gorup)의 수준으로 공급하였을 시 항산화계 및 산화적 손상에 미치는 영향을 관찰하였다. SOD 활성을 간조직에서 관찰한 결과, 울금 분말을 공급한 군에서 HF군에 비해 SOD 활성이 증가하였으며, 특히 TPB군에서는 유의적으로 증가하였다.
- 사육기간 완료 후 실험동물을 12시간 절식시키고 가벼운 ether 마취 하에서 복부대동맥으로부터 혈액을 채취한 후 즉시 간을 채취하여 생리식염수로 헹군 다음 거즈로 수분을 제거하고 무게를 측정한 후 액체질소로 급속동결 시켜 -80 °C에 보관하였다.
- 식이 그룹은 정상군(N group)과 1% 고지방·고콜레스테롤 식이 실험군으로 나눈 후 고지방·고콜레스테롤 실험군은 고지방․고콜레스테롤 대조군(HF group), 고지방·고콜레스테롤식이＋2.5% 울금 분말 공급군(TPA group), 고지방·고콜레스테롤＋5% 울금 분말 공급군(TPB group) 총 4군으로 나누어 사육하였다.
- , Seoul, Korea)에서 구입하여 각 군당 10마리씩 사용하였다. 실험식이 시작 전 일주일간 일반배합사료(Purina Co., Seoul, Korea)로 예비사육한 후 평균체중이 유사하도록 난괴법(randomized complete block design)에 의해 대조군과 실험군으로 나눈 후 Table 1과 같이 나누어 4주간 사육하였다. 실험 기간 중 식이는 4°C에서 보관하였으며, 매일 일정 시간에 공급하여 자유로이 섭취하게 하였다.
- 울금은 분쇄기(대성파워 믹서/분쇄기 DA-280G, Seoul, Korea)로 분쇄한 울금당 6배에 해당하는 증류수(w/v)를 가하여 4°C에서 24시간 추출한 후, 위와 같은 조건으로 3회 반복하고 상등액을 모아 Whatman No. 1(Whatman, Lawrence, KS, USA) 여과지로 여과하였다.
- 즉 GOT 기질로 L-aspartate와 ∝-ketoglutaric acid, GPT 기질로 D,L-alanine과 ∝-ketoglutaric acid 용액에 각각 혈청을 가하여 37°C에서 GOT는 60분, GPT는 30분간 효소반응을 시킨 후 생성된 oxaloacetate 및 pyruvic acid에 2,4-dinitrophenyl hydrazine 정색시약과 0.4 N NaOH를 가하여 잘 혼합한 다음 실온에 10분간 방치한 후 505 nm에서 비색정량을 하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 동물은 체중 130±10 g 내외의 Sprague-Dawley 종 수컷을 (주)바이오 제노믹스사(Bio genomics, Inc., Seoul, Korea)에서 구입하여 각 군당 10마리씩 사용하였다.
- 본 연구에 사용한 울금은 진도에서 제공받아 농가형 열풍건조기를 이용하여 85～80°C로 건조하였다.
- 각각의 추출물에 대한 수율은 추출 전의 시료 무게에 대한 동결건조 후 추출물의 무게를 측정하여 나타내었다. 본 연구에서 사용한 울금 추출물 분말은 추출한 후 동결건조 시켜 조제하여 사용하였다.
데이터처리
- 각 실험 군별로 표준차이가 있는가를 검증하기 위해 분산분석을 수행하였으며 분산 분석(ANOVA 검증) 결과 유의성이 발견된 경우 Tuckey's HSD test(31)에 의해 군 간의 유의도를 분석하였다.
- 모든 실험결과에 대한 통계처리는 SPSS(Statistical Package for Social Science, version 18.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여 처리하였다. 각 실험 군별로 표준차이가 있는가를 검증하기 위해 분산분석을 수행하였으며 분산 분석(ANOVA 검증) 결과 유의성이 발견된 경우 Tuckey's HSD test(31)에 의해 군 간의 유의도를 분석하였다.
이론/모형
- SOD 활성은 알칼리 상태에서 pyrogallol의 자동산화에 의한 발색을 이용한 Marklund와 Marklund(22)의 방법에 따라 측정하였다. GSH-px 활성은 산화형 glutathione(GSSG)이 glutathione reductase와 NADPH에 의해 환원될 때 340 nm에서 NADPH의 흡광도가 감소하는 것을 이용한 Lawrence와 Burk(23)의 방법에 따라 측정하였다. 간조직의 CAT 활성은 Abei 등(24)의 방법으로 측정하였다.
- 25 M sucrose 용액으로 균질화 시킨 후 8,000× g에서 원심분리 하여 mitochondria 분획을 얻은 후 다시 105,000×g에서 원심분리 하여 cytosol과 microsome 분획을 얻었다. H2O2 생성량 측정은 Gay와 Gebicki(26)의 방법에 따라 xylenol orange를 이용하여 560 nm에서 흡광도 증가로 측정하였다. O2․-함량 측정은 Azzi 등(27)의 방법에 준해 실시하였다.
- H2O2 생성량 측정은 Gay와 Gebicki(26)의 방법에 따라 xylenol orange를 이용하여 560 nm에서 흡광도 증가로 측정하였다. O2․-함량 측정은 Azzi 등(27)의 방법에 준해 실시하였다.
- SOD 활성은 알칼리 상태에서 pyrogallol의 자동산화에 의한 발색을 이용한 Marklund와 Marklund(22)의 방법에 따라 측정하였다. GSH-px 활성은 산화형 glutathione(GSSG)이 glutathione reductase와 NADPH에 의해 환원될 때 340 nm에서 NADPH의 흡광도가 감소하는 것을 이용한 Lawrence와 Burk(23)의 방법에 따라 측정하였다.
- 각 시료의 단백질량은 Lowry 등(30)의 방법으로 하였으며, bovin serum albumin을 표준품으로 사용하였다.
- 간조직 중의 TBARS는 Uchiyama와 Mihara의 방법(29)에 따라 조직 0.5 g에 9배 부피의 0.01 M sodium phosphate buffer(pH7.0)를 넣어 균질화한 후 0.5 mL를 취하여 1% phosphoric acid 3 mL와 0.06 M TBA용액 1 mL를 첨가하여 2,500×g에서 10분간 원심분리 한 다음, TBA 반응물이 존재하는 n-butanol 층을 취하여 535 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- GSH-px 활성은 산화형 glutathione(GSSG)이 glutathione reductase와 NADPH에 의해 환원될 때 340 nm에서 NADPH의 흡광도가 감소하는 것을 이용한 Lawrence와 Burk(23)의 방법에 따라 측정하였다. 간조직의 CAT 활성은 Abei 등(24)의 방법으로 측정하였다. 즉 50 mM potassium phosphate buffer(PH 7.
- 간조직의 GST 활성은 Habig 등(25)의 방법에 따라 측정하였다. 1-chloro-2,4-dinitrobenzene(DCNB)과 환원형 glutathione(GSH)을 기질로 하여 25°C에서 20분간 반응하는 동안에 생성된 GSH-DCNB conjugate의 분자 흡광계수를 이용하였다.
- 간조직의 microsome 및 mitochondria 중의 산화된 단백질의 함량은 Levine 등(28)의 방법에 따라 측정하였다. 0.
- 혈청 GOT와 GPT 활성도는 Reitman과 Frankel의 방법(21)을 응용한 아산제약(Seoul, Korea)의 kit를 사용하여 측정하였다. 즉 GOT 기질로 L-aspartate와 ∝-ketoglutaric acid, GPT 기질로 D,L-alanine과 ∝-ketoglutaric acid 용액에 각각 혈청을 가하여 37°C에서 GOT는 60분, GPT는 30분간 효소반응을 시킨 후 생성된 oxaloacetate 및 pyruvic acid에 2,4-dinitrophenyl hydrazine 정색시약과 0.
성능/효과
- GPx 활성은 정상군에 비해 HF군에서 감소되었으나, 울금 분말을 공급한 군에서 HF군에 비해 GPx 활성이 유의적으로 증가되었다. Catalase를 관찰한 결과는 정상군에 비해 고지방․고콜레스테롤군에서 감소되었으며 울금 분말을 공급한 군에서는 증가되었다. Superoxide radical 함량을 간조직의 microsome에서는 정상군에 비해 HF군에서 증가되었으나 울금 분말을 공급한 모든 군에서 감소되었다.
- 1과 같다. GOT 활성은 정상군에 비해 HF군에서 유의적으로 증가되어졌으며, 5% 울금 공급군인 TPA군은 HF군에 비해 유의적으로 감소하는 경향을 나타내었다. GPT 활성 또한 정상군에 비해 HF 군에서 유의적으로 증가되어졌으며, 울금 공급군 모두에서 유의적이지는 않았지만 감소하는 경향을 나타내었다.
- GOT 활성은 정상군에 비해 HF군에서 유의적으로 증가되어졌으며, 5% 울금 공급군인 TPA군은 HF군에 비해 유의적으로 감소하는 경향을 나타내었다. GPT 활성 또한 정상군에 비해 HF 군에서 유의적으로 증가되어졌으며, 울금 공급군 모두에서 유의적이지는 않았지만 감소하는 경향을 나타내었다. 최근 Fu 등(32)의 연구에 의하면 울금의 성분인 커큐민 투여가 ALT와 AST가 증가하는 것을 막고 CCI-4에 의해 손상된 간의 작용을 향상시킨다는 보고와 비슷한 경향을 보였다.
- SOD 활성을 간조직에서 관찰한 결과, 울금 분말을 공급한 군에서 HF군에 비해 SOD 활성이 증가하였으며, 특히 TPB군에서는 유의적으로 증가하였다. GPx 활성은 정상군에 비해 HF군에서 감소되었으나, 울금 분말을 공급한 군에서 HF군에 비해 GPx 활성이 유의적으로 증가되었다. Catalase를 관찰한 결과는 정상군에 비해 고지방․고콜레스테롤군에서 감소되었으며 울금 분말을 공급한 군에서는 증가되었다.
- 5%(TPA group), 5%(TPB gorup)의 수준으로 공급하였을 시 항산화계 및 산화적 손상에 미치는 영향을 관찰하였다. SOD 활성을 간조직에서 관찰한 결과, 울금 분말을 공급한 군에서 HF군에 비해 SOD 활성이 증가하였으며, 특히 TPB군에서는 유의적으로 증가하였다. GPx 활성은 정상군에 비해 HF군에서 감소되었으나, 울금 분말을 공급한 군에서 HF군에 비해 GPx 활성이 유의적으로 증가되었다.
- Catalase를 관찰한 결과는 정상군에 비해 고지방․고콜레스테롤군에서 감소되었으며 울금 분말을 공급한 군에서는 증가되었다. Superoxide radical 함량을 간조직의 microsome에서는 정상군에 비해 HF군에서 증가되었으나 울금 분말을 공급한 모든 군에서 감소되었다. 간조직의 mitochondria에서는 정상군에 비해 HF군에서 유의적으로 증가하였고, 울금 분말을 공급한 모든 군에서는 감소하였다.
- 간조직의 산화 단백질의 생성지표인 carbonyl 가 함량을 mitochondria에서 측정한 결과 정상군에 비해 고지방․고콜레스테롤군에서 증가되었으며, HF군에 비해 울금 분말을 공급한 모든 군에서 유의적으로 감소하는 경향을 나타내었다. 간조직에서의 TBARS를 측정한 결과 HF군에 비해 울금 분말을 공급한 모든 군에서 유의적으로 감소하는 경향을 나타내었다. 이러한 결과로부터 국내산 울금은 고콜레스테롤 식이 흰쥐에서 항산화계를 강화시켜 조직의 산화적 손상을 감소시키는 항산화 효과가 있음이 규명되었다.
- 울금 분말을 공급한 모든 군에서는 HF군에 비해 감소되었으며 정상군 수준으로 감소되었다. 간조직의 cytosol에서는 정상군에 비해 HF군에서 유의적으로 증가되었으나 울금 분말을 공급한 군에서는 감소되었으며 정상군 수준으로 감소되었다. 간조직의 산화 단백질의 생성지표인 carbonyl 가 함량을 mitochondria에서 측정한 결과 정상군에 비해 고지방․고콜레스테롤군에서 증가되었으며, HF군에 비해 울금 분말을 공급한 모든 군에서 유의적으로 감소하는 경향을 나타내었다.
- 는 지질과산화물을 생성하고 이로 인해 세포 상해를 주며 특히 세포막의 다불포화지방산에 작용하여 기능을 손상시키는 것으로 알려져 있다(39). 간조직의 mitochondria 및 cytosol에서 H2O2의 함량을 관찰한 결과(Table 4), 두 분획 모두에서 정상군에 비해 HF군에서 유의적으로 증가되었으며, 울금 분말을 공급한 모든 군에서는 HF군에 비해 정상군 수준으로 감소되었다. 이러한 결과는 울금 분말의 항산화 성분이 효과적으로 활성산소종의 소거에 관여한 것으로 보인다.
- Superoxide radical 함량을 간조직의 microsome에서는 정상군에 비해 HF군에서 증가되었으나 울금 분말을 공급한 모든 군에서 감소되었다. 간조직의 mitochondria에서는 정상군에 비해 HF군에서 유의적으로 증가하였고, 울금 분말을 공급한 모든 군에서는 감소하였다. 특히 TPB군에서는 유의적으로 감소하는 것을 볼 수 있었다.
- 간조직의 microsome에서는 정상군에 비해 HF군에서 증가되었으나 울금 분말을 공급한 모든 군에서 감소되었다. 간조직의 mitochondria에서는 정상군에 비해 HF군에서 유의적으로 증가하였고, 울금 분말을 공급한 모든 군에서는 정상군 수준으로 감소하였다. 특히 TPB군에서는 유의적으로 감소하는 것을 볼 수 있었다.
- 간조직의 cytosol에서는 정상군에 비해 HF군에서 유의적으로 증가되었으나 울금 분말을 공급한 군에서는 감소되었으며 정상군 수준으로 감소되었다. 간조직의 산화 단백질의 생성지표인 carbonyl 가 함량을 mitochondria에서 측정한 결과 정상군에 비해 고지방․고콜레스테롤군에서 증가되었으며, HF군에 비해 울금 분말을 공급한 모든 군에서 유의적으로 감소하는 경향을 나타내었다. 간조직에서의 TBARS를 측정한 결과 HF군에 비해 울금 분말을 공급한 모든 군에서 유의적으로 감소하는 경향을 나타내었다.
- 최근 Fu 등(32)의 연구에 의하면 울금의 성분인 커큐민 투여가 ALT와 AST가 증가하는 것을 막고 CCI-4에 의해 손상된 간의 작용을 향상시킨다는 보고와 비슷한 경향을 보였다. 따라서 울금 내 함유된 성분이 고지방․고콜레스테롤 식이로 유도된 비만 쥐의 간 손상 완화에 효과적으로 작용 가능할 것으로 사료되어진다.
- 34 μg/ mL의 높은 폴리페놀 함량을 보였다. 따라서 이러한 항산화 효소 활성 변화들은 고콜레스테롤 공급으로 인해 불포화지방산의 함량이 높은 생체막의 지질과산화가 촉진되어 세포소기관들의 산화적 손상이 가속화되어 효소 활성이 저하되었으나 본 연구에서 관찰한 바와 같이 폴리페놀 함량이 높은 울금의 공급으로 항산화 효소 활성이 증가된 것으로 볼 수 있다.
- 간조직의 microsome에서의 산화단백질 함량은 정상군에 비해 고지방․고콜레스테롤군에서 증가하였으나 유의적인 차이는 없었다. 또한 mitochondria에서 carbonyl 가의 함량을 측정한 결과 정상군에 비해 고지방․고콜레스테롤 군에서 증가되었으며, HF군에 비해 울금 분말을 공급한 모든 군에서 유의적으로 감소하는 경향을 나타내었다. 이러한 결과는 울금에 항산화력의 지표가 되는 페놀함량이 다량 함유되어 있다는 Kim 등(40)의 보고에서와 같이 울금의 풍부한 항산화 성분들로 인하여 단백질 산화를 억제하고 조직의 산화를 억제시킨 것으로 여겨진다.
- 간조직에서의 TBARS를 측정한 결과 HF군에 비해 울금 분말을 공급한 모든 군에서 유의적으로 감소하는 경향을 나타내었다. 이러한 결과로부터 국내산 울금은 고콜레스테롤 식이 흰쥐에서 항산화계를 강화시켜 조직의 산화적 손상을 감소시키는 항산화 효과가 있음이 규명되었다.
- 따라서 울금은 조직 중의 과산화지질의 함량을 감소시키는 효과가 있는 것으로 사료된다. 이로 미루어 볼 때 울금에 함유된 유기산 등 여러 항산화계 물질이 조직의 산화를 억제 하는 항산화계의 기능을 하는 것을 알 수 있었다.
- 울금분말을 공급한 군에서 HF군에 비해 SOD 활성이 증가하였으며, 특히 TPB군에서는 유의적으로 증가하였다. 일종의 peroxidase로 NADP+를 전자수용체로 하여 H2O2를 제거하면서 환원형 glutathione(GSH)을 산화형 glutathione(GSSG)으로 전환시키는 효소로 알려져 있는(33) GPx를 관찰한 결과(Table 2), 정상군에 비해 HF군에서 감소되었으나 울금 분말을 공급한 군에서 HF군에 비해 GPx 활성이 유의적으로 증가되었다. 조직 세포 속에 존재하여 대사산물인 H2O2를 순간적으로 산화시켜 H2O2와 O2로 분해하고 생체를 산소독으로부터 보호함으로써 과산화적 손상을 방지하는 간조직의 catalase를 관찰한 결과(Table 2), 정상군에 비해 HF군에서 감소되었으며 울금 분말을 공급한 군에서는 증가되었으나 유의적인 차이는 없었다.
- 2와 같다. 정상군에 비해 HF군에 유의적으로 감소되었고, 울금 분말을 공급한 모든 군에서 HF에 비해 정상군 수준으로 증가하는 경향을 나타내었다. Adaramoye 등(37)의 연구에서 울금의 커큐민을 먹인 마우스에서 GST의 활성이 대조군에서보다 증가된다는 것과 일치하며 본 실험에 사용된 울금 분말에 항산화적 해독 기능이 있음을 알 수 있었다.
- 조직의 산화적 손장, 노화 및 기타 퇴행성 질환 유발의 요인이 되는 과산화지질 함량을 간조직에서 관찰한 결과는 Table 5와 같다. 정상군에 비해 고지방․고콜레스테롤군에서 유의적으로 증가되었으며, HF군에 비해 울금 분말을 공급한 모든 군에서 유의적으로 감소하는 경향을 나타내었다. 이러한 결과는 고지방식이와 콜레스테롤 식이의 공급으로 간조직의 TBARS가 증가하였다는 이전의 보고(42,43)와 유사한 경향을 보였다.
- 일종의 peroxidase로 NADP+를 전자수용체로 하여 H2O2를 제거하면서 환원형 glutathione(GSH)을 산화형 glutathione(GSSG)으로 전환시키는 효소로 알려져 있는(33) GPx를 관찰한 결과(Table 2), 정상군에 비해 HF군에서 감소되었으나 울금 분말을 공급한 군에서 HF군에 비해 GPx 활성이 유의적으로 증가되었다. 조직 세포 속에 존재하여 대사산물인 H2O2를 순간적으로 산화시켜 H2O2와 O2로 분해하고 생체를 산소독으로부터 보호함으로써 과산화적 손상을 방지하는 간조직의 catalase를 관찰한 결과(Table 2), 정상군에 비해 HF군에서 감소되었으며 울금 분말을 공급한 군에서는 증가되었으나 유의적인 차이는 없었다.
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