원산지별 감초 추출물의 항산화 활성 비교 연구 Comparative Study on Antioxidative Activity of Glycyrrhiza uralensis and Glycyrrhiza glabra Extracts by Country of Origin원문보기
본 연구에서는 한국과 중국 감초(Glycyrrhiza uralensis) 및 우즈베키스탄 감초(Glycyrrhiza glabra)를 이용하여 원산지별 감초 추출물의 항산화 활성에 관한 비교 연구를 수행하였다. 감초 추출물의 자유 라디칼(1, 1-phenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH) 소거활성($FSC_{50}$)은 각 3가지 원산지 중 한국 감초가 50% 에탄올 추출물(21.15 ${\mu}g/mL$), 에틸아세테이트 분획(29.15 ${\mu}g/mL$), 아글리콘 분획(3.26 ${\mu}g/mL$)에서 모두 가장 우수한 활성을 나타내었다. 루미놀-의존성 화학발광법을 이용한 $Fe^{3+}-EDTA/H_2O_2$ 계에서 생성된 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)에 대한 감초 추출물의 총 항산화능($OSC_{50}$)은 중국 감초의 50% 에탄올 추출물(1.00 ${\mu}g/mL$)과 에틸아세테이트 분획(0.34 ${\mu}g/mL$)이 가장 높은 활성을 나타내었다. Rose-bengal로 증감된 사람 적혈구의 광용혈에 대한 억제 효과를 측정하였을 때 원산지별 감초의 50% 에탄올 추출물과 아글리콘 분획 모두 농도범위(5 ~ 50 ${\mu}g/mL$)에서 농도의존적으로 세포 보호 효과를 나타내었으며, 특히 아글리콘 분획(10 ${\mu}g/mL$)의 경우 한국 감초(${\tau}_{50}$ = 847.4 min)가 동일한 종인 중국 감초(${\tau}_{50}$ = 194.3 min)보다 약 4배 더 우수한 활성을 나타내었다. 이상의 결과를 통해 미백 소재로만 주로 사용되어오던 감초 추출물이 천연 항산화제로서 화장품 분야에 응용될 수 있을 것으로 예상된다. 특히 세포보호 효과가 우수한 것으로 보아 감초 추출물이 자외선으로 유도된 $^1O_2$와 외 ROS로부터 피부를 효과적으로 보호할 수 있을 것으로 예상된다.
본 연구에서는 한국과 중국 감초(Glycyrrhiza uralensis) 및 우즈베키스탄 감초(Glycyrrhiza glabra)를 이용하여 원산지별 감초 추출물의 항산화 활성에 관한 비교 연구를 수행하였다. 감초 추출물의 자유 라디칼(1, 1-phenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH) 소거활성($FSC_{50}$)은 각 3가지 원산지 중 한국 감초가 50% 에탄올 추출물(21.15 ${\mu}g/mL$), 에틸아세테이트 분획(29.15 ${\mu}g/mL$), 아글리콘 분획(3.26 ${\mu}g/mL$)에서 모두 가장 우수한 활성을 나타내었다. 루미놀-의존성 화학발광법을 이용한 $Fe^{3+}-EDTA/H_2O_2$ 계에서 생성된 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)에 대한 감초 추출물의 총 항산화능($OSC_{50}$)은 중국 감초의 50% 에탄올 추출물(1.00 ${\mu}g/mL$)과 에틸아세테이트 분획(0.34 ${\mu}g/mL$)이 가장 높은 활성을 나타내었다. Rose-bengal로 증감된 사람 적혈구의 광용혈에 대한 억제 효과를 측정하였을 때 원산지별 감초의 50% 에탄올 추출물과 아글리콘 분획 모두 농도범위(5 ~ 50 ${\mu}g/mL$)에서 농도의존적으로 세포 보호 효과를 나타내었으며, 특히 아글리콘 분획(10 ${\mu}g/mL$)의 경우 한국 감초(${\tau}_{50}$ = 847.4 min)가 동일한 종인 중국 감초(${\tau}_{50}$ = 194.3 min)보다 약 4배 더 우수한 활성을 나타내었다. 이상의 결과를 통해 미백 소재로만 주로 사용되어오던 감초 추출물이 천연 항산화제로서 화장품 분야에 응용될 수 있을 것으로 예상된다. 특히 세포보호 효과가 우수한 것으로 보아 감초 추출물이 자외선으로 유도된 $^1O_2$와 외 ROS로부터 피부를 효과적으로 보호할 수 있을 것으로 예상된다.
In this work, comparative study on antioxidative activities of extracts from Glycyrrhiza uralensis (G. uralensis) produced in Korea and in China and Glycyrrhiza glabra (G. glabra) produced in Uzbekistan was conducted. Among three origins, 50% ethanol extracts (21.15 ${\mu}g/mL$), ethyl ac...
In this work, comparative study on antioxidative activities of extracts from Glycyrrhiza uralensis (G. uralensis) produced in Korea and in China and Glycyrrhiza glabra (G. glabra) produced in Uzbekistan was conducted. Among three origins, 50% ethanol extracts (21.15 ${\mu}g/mL$), ethyl acetate fraction (29.15 ${\mu}g/mL$) and aglycone fraction (3.26 ${\mu}g/mL$) of G. uralensis from Korea showed the higher free radical (1,1-phenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH) scavenging activity ($FSC_{50}$) than extracts from other origins. Reactive oxygen species (ROS) scavenging activities ($OSC_{50}$) of extracts from three origins on ROS generated in $Fe^{3+}-EDTA/H_2O_2$ system were investigated using luminol-dependent chemiluminescence assay 50% ethanol extract (1.00 ${\mu}g/mL$) and ethyl acetate fraction (0.34 ${\mu}g/mL$) of G. uralensis from China showed the most prominent ROS scavenging activity. The protective effects of extract/fractions of G. uralensis and G. glabra extracts on the rose-bengal sensitized photohemolysis of human erythrocytes were investigated. 50% ethanol extract and aglycone fraction of G. uralensis and G. glabra extracts from three origins showed cellular protective effects in a concentration dependent manner (5 ~ 50 ${\mu}g/mL$). Aglycone fraction of G. uralensis from Korea (${\tau}_{50}$ = 847.4 min)especially showed cellular protective effects four times higher than that from China (${\tau}_{50}$ = 194.3 min). These results indicate that G. uralensis and G. glabra extracts, which have been used as whitening agent, could be applicable to functional cosmetic ingredient as a natural antioxidant. Judging from the prominent cellular protecitve effects, it is concluded that G. uralensis and G. glabra extracts can protect the skin from $^1O_2$ and various ROS induced by UV.
In this work, comparative study on antioxidative activities of extracts from Glycyrrhiza uralensis (G. uralensis) produced in Korea and in China and Glycyrrhiza glabra (G. glabra) produced in Uzbekistan was conducted. Among three origins, 50% ethanol extracts (21.15 ${\mu}g/mL$), ethyl acetate fraction (29.15 ${\mu}g/mL$) and aglycone fraction (3.26 ${\mu}g/mL$) of G. uralensis from Korea showed the higher free radical (1,1-phenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH) scavenging activity ($FSC_{50}$) than extracts from other origins. Reactive oxygen species (ROS) scavenging activities ($OSC_{50}$) of extracts from three origins on ROS generated in $Fe^{3+}-EDTA/H_2O_2$ system were investigated using luminol-dependent chemiluminescence assay 50% ethanol extract (1.00 ${\mu}g/mL$) and ethyl acetate fraction (0.34 ${\mu}g/mL$) of G. uralensis from China showed the most prominent ROS scavenging activity. The protective effects of extract/fractions of G. uralensis and G. glabra extracts on the rose-bengal sensitized photohemolysis of human erythrocytes were investigated. 50% ethanol extract and aglycone fraction of G. uralensis and G. glabra extracts from three origins showed cellular protective effects in a concentration dependent manner (5 ~ 50 ${\mu}g/mL$). Aglycone fraction of G. uralensis from Korea (${\tau}_{50}$ = 847.4 min)especially showed cellular protective effects four times higher than that from China (${\tau}_{50}$ = 194.3 min). These results indicate that G. uralensis and G. glabra extracts, which have been used as whitening agent, could be applicable to functional cosmetic ingredient as a natural antioxidant. Judging from the prominent cellular protecitve effects, it is concluded that G. uralensis and G. glabra extracts can protect the skin from $^1O_2$ and various ROS induced by UV.
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문제 정의
이렇게 개시된 연쇄반응은 세포를 파괴시켜 피부노화를 촉진시킨다. 따라서 본 실험에서는 광증감제인 rose-bengal로 유도된 ROS에 대한 감초 추출물의 세포보호 효과를 측정함으로써 감초 추출물의 항산화제로서의 이용 가능성을 확인하였다.
따라서 본 연구에서는 한국 감초(G. uralensis from Korea), 중국 감초(G. uralensis from China) 및 우즈베키스탄 감초(G. glabra from Uzbekistan)를 이용하여 3가지 분획 (50% 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 분획, 아글리콘 분획)을 제조하였고 이들의 항산화 활성, 1O2로 유도된 세포손상에 대한 보호 작용을 비교해 보았다. 이와 같은 감초의 원산지별, 분획별 비교 연구를 통해 감초 추출물의 항산화 및 항노화 화장품 소재로서의 이용 가능성을 검토하였다.
이렇듯 원산지별 감초 추출물은 항산화 활성 및 세포 보호 효과에 차이를 나타내었는데 이는 각 감초가 재배되는 지역의 토양 및 기온, 일조량, 강수량 등의 재배 환경 차이와 이들을 채취한 후의 가공, 유통, 보존하는 방법의 차이 때문인 것으로 여겨진다. 이상의 연구 결과를 통해 원산지별 감초 추출물이 항산화 및 항노화 기능성 화장품 소재로서 다양하게 응용될 수 있음을 보고하는 바이다.
glabra from Uzbekistan)를 이용하여 3가지 분획 (50% 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 분획, 아글리콘 분획)을 제조하였고 이들의 항산화 활성, 1O2로 유도된 세포손상에 대한 보호 작용을 비교해 보았다. 이와 같은 감초의 원산지별, 분획별 비교 연구를 통해 감초 추출물의 항산화 및 항노화 화장품 소재로서의 이용 가능성을 검토하였다.
제안 방법
5 mL를 가하고 15 min 동안 광조사하여 광증감 반응을 일으켰다. 15 min의 광조사가 끝난 후 암반응 시간에 따른 적혈구의 용혈 정도를 15 min 간격으로 700 nm에서 투광도 (transmittance, %)를 측정하였다. 이 700 nm의 파장에서 적혈구 현탁액의 투광도 증가는 적혈구의 용혈 정도에 비례한다.
그후 Fenton 반응을 일으키기 위해 150 mM H2O2 40 μL 를 넣고 25 min 동안 화학발광 정도를 측정하였다. 대조군(Control)은 추출물 대신 증류수를 첨가하였고, 공시험(Blank)은 FeCl3⦁6H2O와 H2O2 대신 증류수를 첨가하였다. 활성산소 소거활성은 다음 식에 의해 화학발광의 세기가 50% 감소되는데 필요한 시료의 농도(reactive oxygen species scavenging activity concetration, OSC50, µg/mL)로 표기하였다.
2 mM DPPH 1 mL에 에탄올 1 mL를 여러 농도의 추출물 1 mL를 첨가하여 섞은 후 실온에서 10 min 동안 반응시킨 다음 spectrophotometer를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군(Control)은 추출물을 첨가하지 않았고, 공시험(Blank)은 DPPH를 첨가하지 않고 시료의 영향을 보정하였다. 자유 라디칼 소거 활성은 다음 식에 의해 DPPH의 농도가 50% 감소되는 필요한 시료의 농도(free radical scavenging activity concentration, FSC50, µg/mL)로 표기하였다.
아글리콘 분획을 얻기 위하여 에틸아세테이트 분획에서 얻은 파우더 일부를 사용하여 산 가수분해 반응을 통해 당을 제거하였다. 산 가수분해 반응을 위하여 에틸아세테이트 파우더에 H2SO4 및 아세톤 용액을 넣고 4 h 동안 중탕 가열하면서 환류⋅냉각시켰다.
원산지별 감초 추출물의 비교 물질로서 지용성 항산화제인 (+)-α-tocopherol을 사용하였으며 결과 값은 적혈구 세포가 50% 파괴되는데 걸리는 시간(τ50)으로 표시하였다(Tables 1 ∼ 3).
)를 생성시키며 철과 같은 전이금속은 특히 반응성이 큰 ⦁ OH를 생성시키는데 중요한 역할을 한다. 이 실험에서는 이러한 ROS에 의해 루미놀이 나타내는 빛을 화학발광기로 검출하여 측정하였다. 실험 방법은 화학발광 측정용 튜브에 증류수 1.
이와 같이 얻어진 원산지별 감초 50% 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 분획 및 아글리콘 분획을 이용하여 항산화 활성을 평가하였다.
대상 데이터
UV-VIS spectrophotometer는 Varian (Australia), 화학발광 실험에 사용된 6-channel LB9505 LT는 Berthold (Germany)사의 제품을 사용하였다. Milton Roy Co.
또한 화학발광 실험에 사용한 FeCl3⦁6H2O는 Junsei Chemical Co. (Japan)에서, H2O2는 Daejung Chemical & Metals (Korea)에서 구입하였다.
실험에 사용된 적혈구 현탁액은 700 nm에서 O.D. 값이 0.6이었으며 이때 적혈구 수는 1.5 × 107 cells/mL이었다.
실험에 사용된 한국산(충북 제천) 감초와 우즈베키스탄 감초는 경동시장 약업사를 통해 한약재로 판매 되는 원료를 구입하였고, 중국산 감초는 (주)대봉LS에서 제공받아 실험에 사용하였다. 100 g의 건조된 감초를 1 L의 50% 에탄올 용액에 24 h 동안 침적시킨 후 여과 건조하여 50% 에탄올 추출물 파우더를 얻었다.
(Japan)에서, H2O2는 Daejung Chemical & Metals (Korea)에서 구입하였다. 완충 용액 제조에 사용된 Na2HPO4⦁12H2O, NaH2PO4⦁2H2O, NaCl 그리고 에탄올, 메탄올, 에틸아세테이트, n-헥산등 각종 용매는 시판 특급 시약을 사용하였다.
이와 같이 라디칼 소거 능력을 확인하기 위하여 원산지별 감초추출물과 DPPH를 반응시켰으며 비교 물질로는 (+)-α-tocopherol을 사용하였다.
자유 라디칼 소거활성에 사용한 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical과 화학발광 실험에 사용한 luminol과 EDTA, 적혈구 광용혈 실험에서 광증감제로 사용된 rose-bengal 및 비교물질로 사용된 (+)-α-tocopheol과 L-ascorbic acid은 Sigma (USA)에서 구입하여 사용하였다.
적혈구는 건강한 성인 남녀 3명으로부터 채혈하였고, 즉시 heparin이 첨가된 시험관에 넣었다. 3,000 rpm 으로 5 min 동안 원심분리하여 혈구와 혈장을 분리하였고, 분리한 혈구는 0.
데이터처리
Rose-bengal을 첨가하고 광조사를 안 했을 경우와 rose-bengal을 첨가하지 않고 광조사만 했을 경우는 모두 암반응 120 min까지는 용혈이 거의 일어나지 않았다. 모든 실험은 3회 반복하여 평균하였다.
성능/효과
1) 원산지별 감초 추출물의 자유 라디칼 소거 활성 (FSC50)을 비교한 결과 50% 에탄올 추출물은 한국 감초(21.15 µg/mL) > 중국 감초(243.22 µg/mL) > 우즈베키스탄 감초(388.25 µg/mL) 순서로 나타났다.
10µg/mL 농도를 기준으로 하였을 때 원산지별 감초 추출물의 50% 에탄올 추출물의 경우 τ50은 한국 감초 (123.00 min) > 우즈베키스탄 감초(97.00 min) > 중국감초(86.40 µg/mL) 순서로 나타났다.
2) 원산지별 감초 추출물의 활성산소 소거 활성(OSC50)을 확인한 결과, 50% 에탄올 추출물은 중국 감초(1.00 µg/mL) > 우즈베키스탄 감초(1.36 µg/mL) >한국 감초(4.08 µg/mL) 순서로 나타났다.
3) 원산지별 감초 추출물의 1O2로 유도된 적혈구 파괴에 대한 세포 보호 효과 실험 결과, 원산지별 감초의 50% 에탄올 추출물과 아글리콘 분획은 농도의존적으로 세포 보호 효과가 증가하였다. 하지만 세 원산지의 에틸아세테이트 분획에 대하여 한국 감초와 우즈베키스탄 감초는 25 µg/mL 농도 이상에서, 중국 감초는 10 µg/mL 농도 이상에서 세포 보호 효과가 감소하는 것으로 세포 독성을 갖는 것으로 사료된다.
50% 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획에서 중국 감초의 OSC50은 각각 1.00, 0.34 µg/ mL로 세 원산지 중 가장 우수한 활성을 나타내었으며 비교 물질인 L-ascorbic acid보다 우수한 ROS 소거 능력을 갖는 것으로 확인하였다.
한국 감초의 50% 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획 및 우즈베키스탄 감초의 에틸아세테이트 분획을 제외한 모든 분획에서 비교 물질인 L-ascorbic acid보다 높은 활성산소 소거 활성을 확인하였다. 각 원산지별로는 한국과 우즈베키스탄 감초는 아글리콘 분획, 중국 감초는 에틸아세테이트 분획이 가장 높은 활성산소 소거 활성을 나타내었으며 그 중에서도 우즈베키스탄의 아글리콘 분획이 가장 높은 활성을 나타내었다.
대조군(Control)은 τ50이 30 min으로 오차범위 ± 1 min 이내로 모든 경우의 실험에서 재현성이 양호하게 나타났다.
동일한 종인 한국 감초와 중국 감초의 세 분획 모두 10, 50 µg/mL의 농도에서 (+)-α-tocopherol보다 월등히 높은 세포 보호 효과를 갖는 것을 확인하였다.
본 실험에서 생성된 ROS는 루미놀을 산화시켜 아미노프탈산을 생성시키고 이는 다시 바닥상태로 떨어지면서 형광을 일으킨다. 따라서 루미놀의 화학발광 정도를 측정함으로써 감초 추출물의 ROS 소거 능력을 확인할 수 있다.
31 µg/mL로 비교 물질인 L-ascorbic acid보다 약 5배 더 높은 활성을 갖는 것을 확인하였다. 또한 한국, 중국 감초의 아글리콘 분획도 비교 물질인 L-ascorbic acid의 약 2배 우수한 활성산소 소거 활성이 있음을 확인하였다.
반면에 중국 감초의 에틸아세테이트 분획과 한국 감초의 세 분획 모두 비교 물질인 (+)-α-tocopherol과 유사한 활성을 나타내었으며 특히 한국 감초의 아글리콘 분획은(+)-α-tocopherol보다 높은 자유라디칼 소거 활성을 갖는 것을 확인하였다.
본 연구에서는 감초의 원산지별 항산화 효과를 확인 · 비교하였으며 이를 통해 G. uralensis 종인 한국과 중국 감초의 높은 항산화 활성을 확인하였으며 특히 한국 감초가 우수한 세포 보호 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
시료를 넣지 않은 대조군의 경우 적혈구 세포가 50% 파괴되는데 걸리는 시간은 약 30 ± 1 min으로 재현성이 양호하게 나타났다.
아글리콘분획에서 우즈베키스탄 감초의 OSC50은 0.31 µg/mL로 비교 물질인 L-ascorbic acid보다 약 5배 더 높은 활성을 갖는 것을 확인하였다.
원산지별 감초의 대부분의 분획은 비교 물질인 (+)-α-tocopherol보다 우수한 세포보호 효과를 나타내었으며 특히 50% 에탄올 추출물과 아글리콘 분획은 농도의존적인 세포보호 효과를 나타내었다.
원산지별 감초의 모든 분획은 비교 물질로 사용한 (+)-α-tocopherol보다 높은 세포보호 활성을 나타내었으며, 특히 아글리콘분획에서 동종인 한국 감초는 중국 감초보다 약 4배 더 높은 세보 보호 활성을 나타내었다.
중국 감초의 50% 에탄올 추출물 및 아글리콘 분획과 우즈베키스탄 감초의 세 분획 모두 비교 물질인 (+)-α-tocopherol보다 상당히 낮은 자유 라디칼 소거 활성을 나타내었다.
82µg/mL) 순서로 나타났다. 한국 감초의 50% 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획 및 우즈베키스탄 감초의 에틸아세테이트 분획을 제외한 모든 분획에서 비교 물질인 L-ascorbic acid보다 높은 활성산소 소거 활성을 확인하였다. 각 원산지별로는 한국과 우즈베키스탄 감초는 아글리콘 분획, 중국 감초는 에틸아세테이트 분획이 가장 높은 활성산소 소거 활성을 나타내었으며 그 중에서도 우즈베키스탄의 아글리콘 분획이 가장 높은 활성을 나타내었다.
한국 감초의 아글리콘 분획의 세포 보호 효과는 비교물질인 (+)-α-tocopherol보다 약 22배 높은 효과를 나타내었으며 이는 한국 감초의 아글리콘 분획이 항산화제로서 응용 가능성이 매우 크다는 것을 나타낸다.
한국, 중국, 우즈베키스탄 감초 추출물의 자유 라디칼 소거 활성(FSC50)을 비교한 결과, 한국 감초의 FSC50은 50% 에탄올 추출물과 아글리콘 분획에서 각각 21.15, 3.26 µg/mL로 세 원산지 중에서 가장 우수한 활성을 나타내었다.
한편 에틸아세테이트 분획은 0 ∼ 25 µg/mL의 농도 범위에서는 농도의존적인 세포 보호 효과를 나타내었지만 50 µg/mL 의 농도에서는 세포 보호 효과가 감소하는 것을 확인 하였다.
후속연구
Photohemolysis법을 이용한 활성산소에 의한 세포손상 모델로 사람 적혈구를 이용하였으며 이를 통해 감초 추출물의 활성산소 소거에 대한 좀 더 실질적인 효능을 확인할 수 있다. 생체에는 porphyrin과 riboflabin과 같은 광증감제가 존재하는데 이러한 광증감제가 자외선에 노출되면 광증감 반응이 일어나 주 생성물인 1O2를 비롯하여 다양한 활성산소가 생성된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
피부가 노화되는 가장 큰 원인은 무엇인가?
피부가 노화되는 가장 큰 원인으로는 일상생활에서 지속적으로 피부에 노출되는 자외선을 들 수 있다. 자외선으로 유도된 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 피부의 광산화적 손상을 일으켜 피부노화를 가속화시킨다.
국내 화장품 법에 근거하여 기능성 화장품은 몇 가지로 한정되어 있는가?
오늘날 화장품의 개발방향은 소비자 욕구의 다양화와 관련 개발 기술의 발달로 인하여 기존 청결, 피부 미화 등의 단순한 효능을 갖는 화장품에서 다양한 효능⋅효과를 갖는 화장품 개발로 변화되고 있다. 국내 화장품 법에 근거하여 기능성 화장품은 자외선 차단제, 피부 미백제, 주름 개선제 등 3가지 종류로 한정되어 있다[1]. 이렇듯 기능성 화장품은 노화 방지와 미백 효능에 주안점을 두고 있다고 할 수 있다.
활성산소종이란 무엇인가?
자외선으로 유도된 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 피부의 광산화적 손상을 일으켜 피부노화를 가속화시킨다. ROS란 큰 산화력을 갖는 산소종으로서 superoxide anioin radical (O2⦁- ), hydroxyl radical (⦁OH) 과 같은 산소 중심의 라디칼뿐만 아니라 hydrogen peroxide (H2O2), singlet oxygen (1O2)와 같은 비라디칼 종 그리고 이들이 생체 성분과 반응하여 생성된 peroxyl radical (ROO⦁), alkoxyl radical (RO⦁) 등이 포함된다. ROS는 산소의 대사과정에서 생기는 자연적인 부산물이지만 자외선이나 스트레스와 같은 환경적 요인에 의해 생체 내 ROS의 수치가 증가하게 된다.
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