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문제 정의
- 그러므로 본 연구에서는 항암제인 cisplatin과 타우린을 유방암세포인 MCF-7에 병용 투여하였을 때 일어나는 apoptosis와 그와 관련된 기전을 연구하고자 한다.
- 이는 실험에서 사용된 세포가 이전 논문에서 사용되는 정상세포와 달리 암세포이기 때문인 것으로 사료된다. 본 실험결과를 통하여, 암세포에 고농도의 타우린을 처리함으로써 암의 증식을 억제할 수 있는 가능성을 시사한다.
- 본 연구에서는 타우린과 항암제인 cisplatin을 인간 유방암 세포인 MCF-7에 처리하였을 때 발생되는 apoptosis와 이와 관련된 기전을 조사하였다. 타우린의 처리 농도가 증가함에 따라 세포증식이 억제되었으며, cisplatin을 단독으로 처리한 것에 비하여 타우린과 병용 처리하였을 때 세포증식이 효과적으로 억제되었다.
- 약물을 처리하면 세포내 여러 단백질들이 발현하여 apoptosis 기전이 조절된다. 타우린과 cisplatin의 병용처리가 apoptosis를 유발하는 것을 확인하였으므로, 다음 실험에서는 apoptosis와 관련된 단백질의 발현을 조사함으로써 관련 기전을 알아보았다
제안 방법
- 따라서 암세포에서만 특이적으로 apoptosis를 유발하는 것이 항암제의 개발과 항암치료 주요 목적이 되고 있다.25,26) 타우린과 cisplatin을 처리하였을 때 발생하는 apoptotic cell을 확인하기 위하여 DAPI staining을 시행하였다. DAPI는 세포 내 핵을 염색하는 형광물질로, 세포에서 apoptosis가 발생하였을 때 나타나는 DNA의 뭉침, 절편 등의 현상을 형광현미경으로 관찰할 수 있으며, 이를 통하여 세포 내 apoptosis의 발생 정도를 확인할 수 있다.
- 다음 실험으로 Bcl-2와 BAX, 그리고 cytochrome c의 발현을 살펴보았다. Bcl-2와 BAX는 apoptosis의 유발과 밀접한 관련을 가지는 단백질로 두 단백질의 발현으로 인하여 미토콘드리아 막전위에 영향을 주어 결과적으로 cytochrome c가 미토콘드리아로부터 방출되어 apoptosis를 유발하게 된다.
- 12시간 반응 후, membrane을 세척하여 2차 항체와 2시간 동안 실온에서 반응시켰다. 단백질의 발현은 ECL advanced detection kit(GE Healthcare Bio-Sciences Corp., NJ, USA)를 사용하여 LAS-3000(Fujifilm, Tokyo, Japan)에서 관찰하였다.
- 발생된 apoptosis를 다른 방법으로 확인하기 위하여 PARP의 cleavage를 측정하였다. PARP는 손상된 DNA를 복구시키는 역할을 하며, caspase에 의해 cleavage된 경우 손상된 DNA를 복구하지 못하여 결과적으로 apoptosis가 발생하게 된다.
- 세포 고정 후 0.2% triton X-100이 포함된 PBS로 세척한 후에 1 µg/ml의 농도가 되도록 DAPI를 처리한 후 형광현미경상에서 세포 사멸을 관찰한다.
- 세포 증식율을 측정하기 위하여 MTT assay를 사용하였다. 세포에 48 또는 72시간 동안 타우린과 cisplatin을 단독 또는 병용처리한 후, methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)을 첨가하였다. 4시간 후 형성된 formazan crystal을 DMSO로 녹인 후 microplate reader(EL800, Bio-TEK instrument inc.
- 세포증식과 세포사멸 실험을 위하여, 세포에 타우린 또는 cisplatin을 48 또는 72시간 동안 처리하였으며, 타우린은 5, 10, 20 mM, cisplatin 은 5 µM로 단독 또는 병용처리 하였다.
- 우선, 세포 사멸 및 DNA repair와 관련을 가지고 있는 p53의 발현에 대하여 조사하였다. p53은 apoptosis와 밀접한 관련을 가지는 단백질이다.
- 5))로 lysis 시켜 4oC에서 1시간 동안 방치하였다. 원심분리를 통하여 상층액을 분리하였으며, Bradford protein assay kit II(Bio-rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 단백질의 양을 정량 하였다. 단백질(25 µg/well)은 denature하여 10% SDS-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동하였다.
- 타우린 또는 cisplatin의 단독 처리 시 세포증식의 변화를 확인하기 위하여, 48시간 또는 72시간 동안 타우린은 5, 10, 20 mM의 농도로 처리하였으며, cisplatin은 5 µM로 처리하였다.
- 타우린과 cisplatin을 병용처리 하였을 때 세포증식의 효과를 알아보기 위하여 48 또는 72시간 동안 타우린 20 mM과 cisplatin 5 µM을 동시에 처리하였다.
- 타우린과 cisplatin을 세포에 처리하였을 때 세포증식에 영향을 미치는지 조사하기 위하여 MTT assay를 시행하였다. 타우린 또는 cisplatin의 단독 처리 시 세포증식의 변화를 확인하기 위하여, 48시간 또는 72시간 동안 타우린은 5, 10, 20 mM의 농도로 처리하였으며, cisplatin은 5 µM로 처리하였다.
대상 데이터
- Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)와 DAPI(4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
- p53, phospho-p53(ser15), phospho-p53(ser20), cleaved caspase-6, cleaved caspase-7, caspase-8, cleaved caspase-9, PARP, cleaved PARP, bcl-2, BAX, β-actin의 항체는 Cell Signaling(Danvers, MA, USA)에서 구입하였으며, cytochrome c는 BD Biosciences(San Jose, CA, USA)에서 구입하였다.
- Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 구입한 타우린과 cisplatin은 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 용해하여 사용하였으며, 약물 처리 후 배지 내의 DMSO 농도가 0.1%가 되도록 세포에 처리하였다. Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)와 DAPI(4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)는 Sigma-Aldrich(St.
- p53, phospho-p53(ser15), phospho-p53(ser20), cleaved caspase-6, cleaved caspase-7, caspase-8, cleaved caspase-9, PARP, cleaved PARP, bcl-2, BAX, β-actin의 항체는 Cell Signaling(Danvers, MA, USA)에서 구입하였으며, cytochrome c는 BD Biosciences(San Jose, CA, USA)에서 구입하였다. 단백질 발현의 검출은 Amersham Pharmacia Biotech(Piscataway, NJ, USA)에서 detection kit(ECL solution)를 구입하여 사용하였다.
- 본 실험에서는 유방암 세포인 MCF-7을 사용하였으며, 세포는 한국 세포주은행(KCLB; Korean Cell Line Bank, Korea)에서 구입하였다. 세포 배양에 사용된 RPMI1640, fetal bovine serum(FBS), 항생제(penicillin/streptomycin)는 WelGENE(Daegu, South Korea)에서 구입하였다.
- 본 실험에서는 유방암 세포인 MCF-7을 사용하였으며, 세포는 한국 세포주은행(KCLB; Korean Cell Line Bank, Korea)에서 구입하였다. 세포 배양에 사용된 RPMI1640, fetal bovine serum(FBS), 항생제(penicillin/streptomycin)는 WelGENE(Daegu, South Korea)에서 구입하였다. 타우린은 Acros Organics(Thermo Fisher Scientific Inc.
- 유방암 세포인 MCF-7 세포는 10%의 FBS와 항생제(penicillin 50 U/ml, steptomycin 50 µg/ml)가 포함된 RPMI1640 배지에서 5% CO2, 37oC의 환경을 유지시켜주며 배양하였다.
- 세포 배양에 사용된 RPMI1640, fetal bovine serum(FBS), 항생제(penicillin/streptomycin)는 WelGENE(Daegu, South Korea)에서 구입하였다. 타우린은 Acros Organics(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham, MA, USA)에서 구입하였으며, cisplatin은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 구입한 타우린과 cisplatin은 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 용해하여 사용하였으며, 약물 처리 후 배지 내의 DMSO 농도가 0.
데이터처리
- 모든 실험값은 임의대로 100%로 표시한 대조군에 대하여 백분율로 나타내었다. 실험 결과는 Tukey test(SigmaStat; Jandel, Sna Rafael, CA, USA)로 검정하였으며, p값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의성이 있다고 판정하였다.
이론/모형
- Cells were treated with different concentration of taurine and cisplatin (0, 5, 10, and 20 mM of taurine and 5 µM of cisplatin) for 48 (A) and 72 hrs (B). Cell proliferation was determined using the MTT assay. *p<0.
- 단백질 발현은 western blotting으로 측정하였다. 세포는 protease inhibitor가 포함된 RIPA buffer(1% NP-40, 150 mM NaCl, 0.
- 세포 증식율을 측정하기 위하여 MTT assay를 사용하였다. 세포에 48 또는 72시간 동안 타우린과 cisplatin을 단독 또는 병용처리한 후, methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)을 첨가하였다.
- 세포의 사멸을 관찰하기 위하여 DAPI 염색법을 사용하였다. 세포에 48 또는 72시간 동안 타우린과 cisplatin을 단독 또는 병용처리한 후 methanol과 DMSO가 4:1로 섞여있는 용액을 사용하여 4oC에서 24시간 동안 세포를 고정시킨다.
성능/효과
- Apoptosis는 주변의 환경이나 영향으로 세포가 스스로 사멸하는 현상을 말한다.24) 항암제나 약물을 처리하여 정상세포가 아닌 암세포에서만 특이적으로 apoptosis가 발생한다면, 항암제의 부작용을 최소화 하면서 높은 항암효과를 기대할 수 있게 된다. 따라서 암세포에서만 특이적으로 apoptosis를 유발하는 것이 항암제의 개발과 항암치료 주요 목적이 되고 있다.
- DAPI는 세포 내 핵을 염색하는 형광물질로, 세포에서 apoptosis가 발생하였을 때 나타나는 DNA의 뭉침, 절편 등의 현상을 형광현미경으로 관찰할 수 있으며, 이를 통하여 세포 내 apoptosis의 발생 정도를 확인할 수 있다.27) 실험 결과 정상군에서 관찰되지 않는 apoptotic cells이 타우린을 20 mM로 처리하였을 때 약하게 증가하였다. 타우린 20 mM과 cisplatin 5 µM을 병용 처리한 경우 cisplatin을 단독 처리한 경우에 비하여 apoptotic cells이 더욱 증가했으며, 48시간보다 72시간 처리한 실험군에서 더욱 뚜렷하게 증가했다(Fig.
- 따라서 PARP의 cleavage를 통하여 apoptosis를 확인할 수 있다.28) 타우린과 cisplatin을 병용처리 한 경우, 정상군에 비하여 PARP의 발현이 감소하였으며, cleaved PARP가 증가하였다(Fig. 3). 본 실험 결과를 통하여 타우린과 cisplatin을 병용 처리한 경우 apoptosis가 발생되었음을 알 수 있었다.
- Apoptosis의 발생을 관찰한 결과도 세포증식의 억제 결과와 유사하게 나타났다. DAPI 염색법과 PARP cleavage를 통하여 살펴본 결과에서도 정상군이나 단독 처리군에 비하여 병용 처리한 경우에 apoptosis가 증가하였다. Apoptosis와 관련된 단백질의 발현을 조사한 결과 단독처리 시 caspase의 활성에 의해 apoptosis가 발생하였으나, 병용처리 시에는 caspase의 활성보다는 다른 기전이 apoptosis의 발생에 관여한다고 볼 수 있다.
- 4A). 본 실험 결과를 보면 타우린과 cisplatin의 단독처리에서는 apoptosis가 p53 의존적으로 발생한다는 것을 알 수 있었으나, 병용처리 하는 경우에는 p53과 다른 기전을 통하여 apoptosis가 발생된다는 것을 확인할 수 있었다.
- 5). 본 실험 결과를 통하여 apoptosis가 미토콘드리아에 의존적으로 발생하나 Bcl-2와 BAX의 발현에 의해서 조절되는 것은 아님을 알 수 있었다.
- 3). 본 실험 결과를 통하여 타우린과 cisplatin을 병용 처리한 경우 apoptosis가 발생되었음을 알 수 있었다.
- 1). 본 실험 결과에서 볼 때, cisplatin과 타우린을 병용처리 하는 것은 cisplatin의 부작용을 줄이면서도 항암효과를 증가시킨다는 것을 알 수 있었다.
- 4B). 본 실험결과는 타우린과 cisplatin을 단독처리 하는 경우 caspase를 통하여 apoptosis가 유발되나, 병용처리 하는 경우에는 caspase가 아닌 다른 기전을 통하여 apoptosis가 발생된다는 것을 시사한다.
- 2). 본 실험결과를 통하여, 타우린과 cisplatin을 병용 처리하는 것이 cisplatin을 단독처리 하는 것에 비하여 apoptosis를 효과적으로 증가시킨다는 것을 확인할 수 있었다.
- 타우린 또는 cisplatin의 단독 처리 시 세포증식의 변화를 확인하기 위하여, 48시간 또는 72시간 동안 타우린은 5, 10, 20 mM의 농도로 처리하였으며, cisplatin은 5 µM로 처리하였다. 실험결과 세포증식은 타우린의 처리 농도와 시간이 증가함에 따라 더 억제되었다(Fig. 1). 이러한 결과는 이전 타우린을 10 mM로 단독 처리 하였을 때 신경줄기세포증식이 120% 증가시킨다는 기존의 논문21)과 상반된 결과이다.
- 또한 타우린이나 cisplatin의 단독 또는 병용처리 시 모두 cytochrome c의 발현을 통하여 미토콘드리아에 의존적으로 apoptosis가 발생하였다. 실험을 통하여 타우린과 항암제를 병용처리 할 경우 항암제의 항암효과를 증가시킨다는 것을 알 수 있었다.
- 타우린 20 mM과 cisplatin 5 µM을 병용 처리한 경우 cisplatin을 단독 처리한 경우에 비하여 apoptotic cells이 더욱 증가했으며, 48시간보다 72시간 처리한 실험군에서 더욱 뚜렷하게 증가했다(Fig. 2).
- 본 연구에서는 타우린과 항암제인 cisplatin을 인간 유방암 세포인 MCF-7에 처리하였을 때 발생되는 apoptosis와 이와 관련된 기전을 조사하였다. 타우린의 처리 농도가 증가함에 따라 세포증식이 억제되었으며, cisplatin을 단독으로 처리한 것에 비하여 타우린과 병용 처리하였을 때 세포증식이 효과적으로 억제되었다. Apoptosis의 발생을 관찰한 결과도 세포증식의 억제 결과와 유사하게 나타났다.
후속연구
- 유방암 세포에 타우린과 cisplatin의 병용처리 하였을 때 단독 처리에 비하여 세포 증식이 억제되고 apoptosis가 증가하였다. 그러나 병용처리로 인해 발생된 apoptosis의 기전은 밝혀지지 않은 부분이 많으므로 차후에 연구되어야 할 것이다.
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