자두(후무사, 대석, 피자두) 추출물이 LPS로 염증을 유발한 Raw 264.7 세포와 암 세포에 미치는 영향 Effect of Extracts from Oriental Plum (Formosa, Oishiwase, Soldam) on LPS-stimulated Raw 264.7 Cells원문보기
The objective of this study is to evaluate the anti-cancer and anti-inflammatory activities of plum (Formosa, Oishiwase, Soldam) for the future development of functional food products. To determine the anti-inflammatory effect of different types of plums, the inhibitory effect of plum extracts on ni...
The objective of this study is to evaluate the anti-cancer and anti-inflammatory activities of plum (Formosa, Oishiwase, Soldam) for the future development of functional food products. To determine the anti-inflammatory effect of different types of plums, the inhibitory effect of plum extracts on nitric oxide (NO) production were measured in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated Raw 264.7 mouse macrophage cells and human cancer cell lines (A549, Ags, Hela, Hep3B). Among the three different plum cultivars, Oishiwase at a concentration of 1 mg/mL showed the highest inhibitory effects on NO production (%) in Raw 264.7 macrophage cells. Moreover, Oishiwase exhibited a higher anti-cancer activity against A549 (renal carcinoma, 50%), Ags (gastric carcinoma, 35%), HeLa (cervical carcinoma, 50%), and Hep3B (hepatocellular carcinoma, 31%) at a concentration on 1 mg/mL, respectively, compared to Formosa and Soldam. Our findings suggest Oishiwase plum extracts may serve as potential dietary sources of natural health promoting substances.
The objective of this study is to evaluate the anti-cancer and anti-inflammatory activities of plum (Formosa, Oishiwase, Soldam) for the future development of functional food products. To determine the anti-inflammatory effect of different types of plums, the inhibitory effect of plum extracts on nitric oxide (NO) production were measured in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated Raw 264.7 mouse macrophage cells and human cancer cell lines (A549, Ags, Hela, Hep3B). Among the three different plum cultivars, Oishiwase at a concentration of 1 mg/mL showed the highest inhibitory effects on NO production (%) in Raw 264.7 macrophage cells. Moreover, Oishiwase exhibited a higher anti-cancer activity against A549 (renal carcinoma, 50%), Ags (gastric carcinoma, 35%), HeLa (cervical carcinoma, 50%), and Hep3B (hepatocellular carcinoma, 31%) at a concentration on 1 mg/mL, respectively, compared to Formosa and Soldam. Our findings suggest Oishiwase plum extracts may serve as potential dietary sources of natural health promoting substances.
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문제 정의
더욱 이 우리나라에서는 자두를 주로 생물로만 이용하고 있어 계 절적인 제약이 크기 때문에 자두 가공품 개발이나 자두의 부 가가치 향상을 위한 건강기능성 효과 구명에 대한 연구가 더 욱 시급히 요구되고 있다. 이에 본 연구에서는 자두의 항염 활성 및 암세포에 미치는 영향을 통하여 식품으로서의 자두 의 가치를 구명하고자 하였다.
제안 방법
각 well에 100 μL의 Raw 264.7 배양 상등액과 표준용액을 넣어 37℃에서 2시간 배양하고, 5회의 세척과정을 반복한 후 working detector(Detection antibody와 SAv-HRP reagent를 1:250의 농도로 assay diluent에 희석)를 100 μL 첨가해 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 7회 세척과정을 반복하였다.
LPS에 의해 자극된 Raw 264.7 cell의 염증성 사이토카인 TNF-α의생성을측정하기 위해BD OptEIATM set mouse TNF-α (BD Biosciences, USA)를 이용하여 측정하였다.
RPMI-1640에 녹여 농도별로 조제된 시료(최종농도 0.25, 0.5, 1 mg/mL)에 대한 암세포 성장 억제능을 측정하기 위해서 MTT assay를 실행하였다 각 암세포주의 농도를 3×103cells/mL로 조절한 후 96 well plate에 분주하여 24시간 전배양(37℃, 5% CO2)후 시료를 각 농도별로 100 μL씩 첨가하여 48시간 동안 배양하였다.
, USA)를 100 μL 첨가해 상온에서 10분 동안 반응 시켜, microplate reader를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로 염증을 유발한 후 샘플을 처리하지 않은 처리군을 사용하였다.
우리나라 주요 품종별 자두의 생리활성 효과를 구명하기 위해 후무사, 대석, 피자두의 추출물을 이용해 암세포 증식에 미치는 영향과 및 LPS로 염증을 유발한 Raw 264.7에 대한 효과를 관찰하였다. 대식세포 Raw 264.
실험에 사 용된 세 품종의 자두는 푸르스름한 빛이 돌고, 단단한 질감 의 형태로 섭취하기에 적당한 적숙기의 자두로 판단되었다. 자두는 동결건조하여 각 5 g씩 정량하고, 시료 중량의 10배 의 80% 에탄올을 첨가하여 실험적 조건에서 추출의 수율을 높여줄 수 있다고 알려져 있는 초음파 병행 추출 혹은 교반 추출로 1시간 추출 후, 60℃ 환류 추출기에서 12시간씩 2회 반복 추출하였다. 추출물은 40℃ 감압농축기(rotary vacuum evaporator)를 이용하여 농축하여 동결건조하여 -78℃에서 보관하면서 실험에 사용하였다.
후무사, 대석, 피자두의 세포 독성을 조사하기 위해서 Raw 264.7 세포에 0.25, 0.5, 1.0 mg/mL 농도의 추출물을 처리하고 MTT assay를 수행한 결과는 Fig. 1과 같다. 각 추출물의 최고 농도인 1.
대상 데이터
Lipopolysaccharide(LPS)에 의한 염증 유발은 대식세포 Raw 264.7을 사용하였다. 세포를 4 well plate에 5×105 cell/well의 농도로 분주하고, LPS를 1 μg/mL의 농도로 처리하여 24시간 염증상태를 유지시킨 다음 각 시료를 1 mg/mL의 농도로 처리하여 24시간 반응시켰다.
본 실험에 사용된 자두 후무사(Formosa), 대석(Oishiwase) 및 피자두(Soldam) 3종은 경북 김천에서 구매하였으며, 수확 시기는 각각 7월 중순, 7월 하순, 8월 초순이었다. 실험에 사 용된 세 품종의 자두는 푸르스름한 빛이 돌고, 단단한 질감 의 형태로 섭취하기에 적당한 적숙기의 자두로 판단되었다.
세포 독성 측정에 사용한 세포주는 Raw 264.7(KCLB40071) 로 한국세포주은행(KCLB)으로부터 분양받아 사용하였다. 세포의 농도를 3×103 cells/mL로 조절한 후 96 well plate에 분주하고, 동시에 농도별(1, 0.
암세포 성장 억제능 측정에 사용한 세포주 A-549(폐암세 포), Ags(위암세포), Hep3b(간암세포), Hela(자궁경부암세포) 는 한국세포주은행(KCLB)으로부터 분양받아 사용하였다. RPMI-1640에 녹여 농도별로 조제된 시료(최종농도 0.
데이터처리
모든 자료는 SPSS program에 의해 일원배치 분산분석과 이원배치 분산분석을 이용하여 분석하였다. 사후 분석 다중비교는 Duncan's multiple range test를 이용하여 실험군의 평균값 간의 유의성을 검정하였다.
사후 분석 다중비교는 Duncan's multiple range test를 이용하여 실험군의 평균값 간의 유의성을 검정하였다.
성능/효과
1과 같다. 각 추출물의 최고 농도인 1.0 mg/mL에서 Raw 264.7 세포가 생존하였고, 오히려 20% 이상의 세포증식을 보여 세포 독성이 없는 것으로 조사되었다.
간암 세포인 Hep3B에 대한 각 추출물의 세포 성장 억제효과를 검토한 결과, 1 mg/mL 처리했을 때 품종 간 유의한 차이를 보였으며, 대석 초음파 추출물에서 가장 높은 억제효과를 보였다. Kim et al(2004)의 연구 결과에 따르면 생육시기별 피자두의 간암세포 HepG2에 대한 억제 효과를 조사한 결과, 자두 추출물 1 mg/mL 농도에서 38% 이상의 저해효과를 보인 것과는 다소 상이한 결과였는데, 이는 피자두가 숙성됨에 따라 존재하는 catechins이 감소하여 나타나는 활성변화라 사료된다(Yu et al 2009).
7에 대한 효과를 관찰하였다. 대식세포 Raw 264.7에 대한 세포 독성 측정 결과, 세 품종 추출물 모두 가장 높은 농도인 1 mg/mL에서도 세포 증식능을 보여 세포 독성이 없는 것을 확인하였다. 인체 유래 암세포주인 폐암(A549), 위암(Ags), 자궁경부암 (Hela) 및 간암(Hep3B) 세포주를 이용하여 성장 억제 효과를 조사한 결과, 모든 세포주에서 다소 차이는 있으나 20% 이상의 암세포 성장 억제 효과를 보였다.
25mg/mL에서도 폐암세포의 성장을 20% 이상 억제하였다. 모든 처리구에서 품종별 농도별 유의한 억제 효과를 보였고, 특히 대석 추출물 고농도 처리군(1 mg/mL)에서는 초음파 병행 추출물이 교반 추출물에 비해 약 9% 이상의 억제 효과를 보여 초음파를 이용하여 추출하는 방법에 암세포 생육을 억제하는 유효성분을 추출하는데 효과적인 것을 알 수 있었다. 위암 세포인 Ags에 대한 각 추출물의 세포 성장 억제 효과를 검토한 결과, 농도 의존적으로 세포의 성장을 억제하였고, 특히 피자두 초음파 병행 추출물은 가장 높은 37% 억제효과를 나타내었다.
본 실험에 사용된 자두 후무사(Formosa), 대석(Oishiwase) 및 피자두(Soldam) 3종은 경북 김천에서 구매하였으며, 수확 시기는 각각 7월 중순, 7월 하순, 8월 초순이었다. 실험에 사 용된 세 품종의 자두는 푸르스름한 빛이 돌고, 단단한 질감 의 형태로 섭취하기에 적당한 적숙기의 자두로 판단되었다. 자두는 동결건조하여 각 5 g씩 정량하고, 시료 중량의 10배 의 80% 에탄올을 첨가하여 실험적 조건에서 추출의 수율을 높여줄 수 있다고 알려져 있는 초음파 병행 추출 혹은 교반 추출로 1시간 추출 후, 60℃ 환류 추출기에서 12시간씩 2회 반복 추출하였다.
우리나라 주요 품종별 자두 후무사, 대석, 피자두의 NO 소거에 미치는 영향을 알아보기 위해 LPS로 염증을 유발한 대식세포 NO 분비능을 조사한 결과, 모든 처리군구에서 NO의 농도가 감소하였다. 염증을 유발하고 자두 추출물을 처리하지 않은 대조군의 NO 생성농도 35.6 nM에 비교하였을 때, 대석 추출물이 NO의 농도를 가장 많이 감소시켜 25.1～2 nM의 농도를 나타내었고, 후무사 추출물은 26.2～26.8 nM, 피자두 추출물은 28.2～28.4 nM의 농도를 나타내었다.
염증을 유발한 대식세포 Raw 264.7에 대한 항염증 효과를 알아보기 위해 NO, TNF-α 의 분비에 미치는 영향을 조사한 결과, 전처리구에서 LPS만을 처리한 대조군구에 비해 NO 생성능이 저해되었고, 세 품종 중 가장 NO의 생성을 억제한 품종은 대석으로 암세포의 성장 억제와 같은 결과를 보여줬다.
LPS 자극에 의해 과 생성된 NO는 세포 독성뿐만 아니라, 염증반응, 세포의 돌연변이 및 종양 발생 등에도 관여하며, 염증에 의한 조직 손상 시 NO의 분비가 증가되었다는 연구 결과가 보고되었다(Weisz et al 1996). 우리나라 주요 품종별 자두 후무사, 대석, 피자두의 NO 소거에 미치는 영향을 알아보기 위해 LPS로 염증을 유발한 대식세포 NO 분비능을 조사한 결과, 모든 처리군구에서 NO의 농도가 감소하였다. 염증을 유발하고 자두 추출물을 처리하지 않은 대조군의 NO 생성농도 35.
모든 처리구에서 품종별 농도별 유의한 억제 효과를 보였고, 특히 대석 추출물 고농도 처리군(1 mg/mL)에서는 초음파 병행 추출물이 교반 추출물에 비해 약 9% 이상의 억제 효과를 보여 초음파를 이용하여 추출하는 방법에 암세포 생육을 억제하는 유효성분을 추출하는데 효과적인 것을 알 수 있었다. 위암 세포인 Ags에 대한 각 추출물의 세포 성장 억제 효과를 검토한 결과, 농도 의존적으로 세포의 성장을 억제하였고, 특히 피자두 초음파 병행 추출물은 가장 높은 37% 억제효과를 나타내었다. Kim et al(2004)이 생육 시기별 피자두의 Ags 증식 억제 효과를 조사한 결과에 따르면 미숙과에서 숙성이 될수록 암세포의 생육을 저해하는 효과가 작아져 과숙기에는 뚜렷한 저해 효과를 찾을 수 없다고 보고하였는데, 이는 본 실험과 다소 상이한 결과로 이는 실험에 사용된 자두의 숙성도 차이에 의한 추출물 속 유효 성분의 의한 영향이라 사료된다.
7에 대한 세포 독성 측정 결과, 세 품종 추출물 모두 가장 높은 농도인 1 mg/mL에서도 세포 증식능을 보여 세포 독성이 없는 것을 확인하였다. 인체 유래 암세포주인 폐암(A549), 위암(Ags), 자궁경부암 (Hela) 및 간암(Hep3B) 세포주를 이용하여 성장 억제 효과를 조사한 결과, 모든 세포주에서 다소 차이는 있으나 20% 이상의 암세포 성장 억제 효과를 보였다. 특히 대석 품종은 자궁 경부암 세포의 성장에 가장 큰 영향을 미치는 품종으로 50%의 저해 효과를 보였으며, 추출물 제조의 방법으로 초음파 병행 추출이 유효 성분의 추출에 유리한 것으로 밝혀졌다.
Kim et al(2004)이 생육 시기별 피자두의 Ags 증식 억제 효과를 조사한 결과에 따르면 미숙과에서 숙성이 될수록 암세포의 생육을 저해하는 효과가 작아져 과숙기에는 뚜렷한 저해 효과를 찾을 수 없다고 보고하였는데, 이는 본 실험과 다소 상이한 결과로 이는 실험에 사용된 자두의 숙성도 차이에 의한 추출물 속 유효 성분의 의한 영향이라 사료된다. 자궁경부암 세포인 Hela에 대한 각 추출물의 세포 성장 억제 효과를 검토한 결과, 1 mg/mL 첨가 시 품종 간 유의한 차이를 보이며, 후무사 초음파 추출물은 40%, 교반 추출물 36%, 대석 초음파 추출물 50%, 교반 추출물 48%, 피자두 초음파추출물 26%, 교반 추출물 25%의 억제 효과를 나타내었고, 대석 추출물에서 비교적 높은 저해 효과를 보였다. 이와는 다르게 Han et al(2007)에 보고에 의하면 인체 유두종 바이러스 유래 자궁경부암세포주인 Hela 세포증식에 미치는 자두의유기 용매 추출물로 솔담의 에틸아세트 분획물을 도출하였는데, 이는 유효 성분의 함량 차이라 사료되며, 이에 대한 정확한 효과를 구명하기 위해 자두 성분들에 대한 물질 분석 연구도 필요할 것이라 사료된다.
5와 같다. 초음파 병행 추출과 교반 추출 방법을 이용하여 추출된 자두 세 품종의 추출액은 측정한 3가지 암세포에서 생육을 억제하였는데, 대석 초음파 추출물은 가장 낮은 농도인 0.25mg/mL에서도 폐암세포의 성장을 20% 이상 억제하였다. 모든 처리구에서 품종별 농도별 유의한 억제 효과를 보였고, 특히 대석 추출물 고농도 처리군(1 mg/mL)에서는 초음파 병행 추출물이 교반 추출물에 비해 약 9% 이상의 억제 효과를 보여 초음파를 이용하여 추출하는 방법에 암세포 생육을 억제하는 유효성분을 추출하는데 효과적인 것을 알 수 있었다.
인체 유래 암세포주인 폐암(A549), 위암(Ags), 자궁경부암 (Hela) 및 간암(Hep3B) 세포주를 이용하여 성장 억제 효과를 조사한 결과, 모든 세포주에서 다소 차이는 있으나 20% 이상의 암세포 성장 억제 효과를 보였다. 특히 대석 품종은 자궁 경부암 세포의 성장에 가장 큰 영향을 미치는 품종으로 50%의 저해 효과를 보였으며, 추출물 제조의 방법으로 초음파 병행 추출이 유효 성분의 추출에 유리한 것으로 밝혀졌다. 자두세 품종이 갖는 암세포 성장 저해 효과는 이들이 함유하고 있는 Phytochemical의 영향으로 여겨지며, 선행연구에 의하면 자두에 함유된 페놀성 화합물이 항산화, 노화 방지, 고지혈증 억제 및 항종양 작용을 하고(Utsunomiya et al 2002, Lee et al 2003, Franklin et al 2006), 과일 및 채소의 페놀성 화합물이 면역세포에서 INF-γ, IL-5, IL-2 TNF-α의 분비를 촉진하며(Bu et al 2009, Lin & Tna 2008), 채소 및 과일 등의 식물성 식품의 섭취량이 증가할수록 심혈관계 질환에 의한 사망률이 낮아진다(Lee & Do 2005)는 등의 보고에서 뒷받침되고 있다.
후속연구
TNF-α의 분비능에 대한 조사 결과, 전체적으로 분비 저해에 큰 영향을 미치지는 못했는데, 이는 자두 추출물이 INOS의 신호 전달 체계에는 영향을 미치나, TNF-α의 신호체계에는 영향을 미치지 못하는 것으로 이와 관련하는 염증 관련 물질에 대한 추가 연구를 통해 더욱 확인해 봐야 할 것이다.
자두세 품종이 갖는 암세포 성장 저해 효과는 이들이 함유하고 있는 Phytochemical의 영향으로 여겨지며, 선행연구에 의하면 자두에 함유된 페놀성 화합물이 항산화, 노화 방지, 고지혈증 억제 및 항종양 작용을 하고(Utsunomiya et al 2002, Lee et al 2003, Franklin et al 2006), 과일 및 채소의 페놀성 화합물이 면역세포에서 INF-γ, IL-5, IL-2 TNF-α의 분비를 촉진하며(Bu et al 2009, Lin & Tna 2008), 채소 및 과일 등의 식물성 식품의 섭취량이 증가할수록 심혈관계 질환에 의한 사망률이 낮아진다(Lee & Do 2005)는 등의 보고에서 뒷받침되고 있다. 다만 Han et al(2007)의 자두 추출 분획별 항암 활성 조사 결과에 따르면 세포주의 종류와 추출분획에 따라 항암 활성이 다르고, 헥산, 에틸아세테이트 분획에서 높은 항암 효과를 나타냈지만, 다른 분획 층에서는 별다른 항암효과가 나타나지 않는다는 보고와 같이 후무사, 대석, 피자두의 추출분획물의 함유 물질의 암세포 성장에 미치는 영향과 그 메커니즘에 대한 추가 연구가 필요하다고 하겠다. 염증을 유발한 대식세포 Raw 264.
본 연구 결과, 대자두 세 품종의 추출물은 TNF-α의 분비에는 영향을 미치지 못했는데(Fig. 7), 이는 자두 추출물이 INOS의 신호 전달 체계에는 영향을 미치나, TNF-α의 신호체계에는 영향을 미치지 못하는 것으로 여겨지며, 이에 대해 염증 관련인자 INOS, Cox-2, NF-κB, IκB의 발현 및 PGE-2 등 물질 분비에 대한 추가 연구를 통해 더욱 확인해 봐야 할 것이다.
이상의 결과에서 우리나라 주요 품종별 자두의 생리활성 효과를 알 수 있었으며, 이러한 우수성 구명을 통해 자두를 소재로 한 면역 강화 식품, 항암 식품 등의 개발과 건강식품으로서 자두의 소비가 촉진될 수 있을 것으로 보인다.
자궁경부암 세포인 Hela에 대한 각 추출물의 세포 성장 억제 효과를 검토한 결과, 1 mg/mL 첨가 시 품종 간 유의한 차이를 보이며, 후무사 초음파 추출물은 40%, 교반 추출물 36%, 대석 초음파 추출물 50%, 교반 추출물 48%, 피자두 초음파추출물 26%, 교반 추출물 25%의 억제 효과를 나타내었고, 대석 추출물에서 비교적 높은 저해 효과를 보였다. 이와는 다르게 Han et al(2007)에 보고에 의하면 인체 유두종 바이러스 유래 자궁경부암세포주인 Hela 세포증식에 미치는 자두의유기 용매 추출물로 솔담의 에틸아세트 분획물을 도출하였는데, 이는 유효 성분의 함량 차이라 사료되며, 이에 대한 정확한 효과를 구명하기 위해 자두 성분들에 대한 물질 분석 연구도 필요할 것이라 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
동양계 자두 중 우리나라에서 주로 재배되고 있는 자두는?
우리나라에서 주로 재배되고 있는 자두는 동양계 자두 중 Soldam(피자두), Formosa(후무사), Oishisase(대석)이다. 자두 의 식품학적 연구보고에 의하면 건조 자두와 생자두에는 폴 리페놀류와 식이섬유가 많이 함유되어 있으며(Judith et al 1994), 주요 폴리페놀류는 neochlorogenic acid와 chlorogenec acid 같은 페놀릭산과 myricetin, quercetin 같은 플라보노이 드가 함유되어 있고(Peng et al 2003), 특히 myricetin은 Soldam 과 Formosa에 각각 3.
퇴 행성 및 대사성 질병에는 어떤 것들이 있는가?
현대인의 질병은 물질적 풍요와 함께 급성 질환에서 만성 적으로 진행되는 퇴행성 및 대사성 질환들이 대부분이다. 퇴 행성 및 대사성 질병에는 암, 고혈압, 당뇨병, 골다공증, 갱년 기 질환, 심혈관 질환, 뇌혈관 질환, 피부병, 동맥경화, 신장 병, 간경화, 변비 비만 등으로 현대인의 질환 대부분이 여기 에 속한다고 할 수 있다(Kim et al 2012). 만성 질환은 발생 후 의학적 치료도 중요하지만 평소 식습관을 올바르게 영위 함으로써 발생을 줄일 수도 있고 치료에 효과를 더할 수 있 어, 사람들은 의약이 아닌 먹을거리로부터 이들 질병들을 극 복하기 위한 해결책을 찾으려 노력하고 있고, 최근 식물소재 phytochemicals에 대한 연구가 활발히 진행되고 있는 것도 이러한 흐름의 하나라 볼 수 있다.
만성 적으로 진행되는 퇴행성 및 대사성 질환을 의약이 아닌 먹을거리로 극복하려는 이유는 무엇인가?
퇴 행성 및 대사성 질병에는 암, 고혈압, 당뇨병, 골다공증, 갱년 기 질환, 심혈관 질환, 뇌혈관 질환, 피부병, 동맥경화, 신장 병, 간경화, 변비 비만 등으로 현대인의 질환 대부분이 여기 에 속한다고 할 수 있다(Kim et al 2012). 만성 질환은 발생 후 의학적 치료도 중요하지만 평소 식습관을 올바르게 영위 함으로써 발생을 줄일 수도 있고 치료에 효과를 더할 수 있 어, 사람들은 의약이 아닌 먹을거리로부터 이들 질병들을 극 복하기 위한 해결책을 찾으려 노력하고 있고, 최근 식물소재 phytochemicals에 대한 연구가 활발히 진행되고 있는 것도 이러한 흐름의 하나라 볼 수 있다.
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