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문제 정의
- 특히, Chlorella는 고등식물과 유사한 대사과정을 가지고 있고, 생장이 빠르며 비교적 균일한 생육과 반응을 나타낼 뿐만 아니라 세포배양 환경을 조절하기가 쉽기 때문에 수중 생태계의 환경오염을 평가하는데 적당하다(Ma 등, 2002; Plekhanov와 Chemeris, 2003). 따라서 본 연구에서는 담수산 녹조류인 Chlorella vulgaris를 대상으로 형광이미지와 O-J-I-P 분석을 통해 수서생태계에 미치는 수은의 영향을 평가하고 엽록소형광 변수들의 환경지표로서의 활용 가능성을 살펴보았다.
- 본 연구는 수은이 수서생태계에 미치는 영향을 평가하기 위하여 담수산 녹조류인 Chlorella를 대상으로 수은의 농도와 배양 시간을 달리하여 엽록소형광 이미지 분석과 O-J-I-P 분석을 실시하였다. 엽록소 a와 b, carotenoid 함량은 높은 농도의 수은에서는 농도가 증가함에 따라 현저히 감소하였으나 낮은 농도에서는 변화가 거의 없었다.
제안 방법
- 수은의 농도와 배양 시간에 따른 Chlorella의 반응을 신속하게 모니터링하기 위해서 엽록소형광 이미지 분석을 통하여 형광변수의 변화 양상을 살펴보았다. Chlorella에 수은의 농도를 달리하여 처리한 후 24시간 동안 배양하면서 배양 시간에 따라 Fv/Fm, Fm과 Fo 이미지의 변화를 살펴보았다(Fig. 1). 그 결과, Fv/Fm 이미지를 보면 200 μM 이상의 수은에서는 30분 이후에 적색 이미지에서 노란색 또는 녹색 이미지로의 변화가 감지되어 Fv/Fm 값이 감소하고 있음을 알 수 있었다(Fig.
- 식물체가 빛, 온도, 건조 또는 화학적 스트레스 등에 의해 영향을 받았을 때, O-J-I-P 곡선의 패턴이 변하게 된다. Fig. 1과 2에서 살펴본 바와 같이 수은의 농도별 차이가 뚜렷하게 나타나는 시간인 수은처리 후 4시간에서 Chlorella의 O-J-I-P 곡선의 패턴을 비교하고 이를 토대로 형광변수들을 산출하여 제시하였다(Fig. 3). Chlorella의 O-J-I-P 곡선을 살펴보면, 수은 농도가 증가할수록 J, I, P값이 크게 감소하고 있으며, 특히 P-단계에서 형광 세기가 크게 감소하였다(Fig.
- Fig. 1의 엽록소형광 이미지 분석으로는 짧은 시간 동안 Chlorella를 배양하였을 때 100 µM 이하의 수은 처리구에서 가시적인 구별이 쉽지 않아 Fv/Fm, Fm과 Fo 값을 산출하여 정량적으로 제시하였다(Fig. 2).
- 따라서 Chlorella의 배양에서 중금속에 의해 야기된 손상을 예측하는 데에도 엽록소 함량의 변화로 나타낼 수 있다. Fig. 2에서 수은의 농도별 Fv/Fm의 차이가 뚜렷하게 나타나는 시간인 수은처리 후 4시간에서의 엽록소 및 carotenoid 함량의 변화를 살펴보았다(Table 2). 엽록소 a와 b의 함량은 대조구와 비교하여 수은에 노출되었을 때 수은의 농도가 높을 때에는 현저히 감소하였으며, 특히 400 µM의 수은에서 엽록소 a와 b의 함량이 각각 61.
- O-J-I-P 곡선의 분석으로 8개의 기본적 형광변수(Fo, Fm, Fv/Fo, VJ, VI, Mo, Sm, N)들을 제시하였으며, 이를 토대로 다시 구조적 변수(structural parameters: RC/CS, ΦPO, ΨO, ΦEO 등)와 기능적 변수(functional parameters: ABS/RC, TRo/RC, ETo/RC, DIo/RC, ETo/CS, DIo/CS 등)들을 산출하여 제시하였다(Table 1).
- O-J-I-P 곡선의 분석으로 8개의 기본적 형광변수(Fo, Fm, Fv/Fo, VJ, VI, Mo, Sm, N)들을 제시하였으며, 이를 토대로 다시 구조적 변수(structural parameters: RC/CS, ΦPO, ΨO, ΦEO 등)와 기능적 변수(functional parameters: ABS/RC, TRo/RC, ETo/RC, DIo/RC, ETo/CS, DIo/CS 등)들을 산출하여 제시하였다(Table 1). 그리고, 측정된 형광 변수들을 토대로 광계Ⅱ의 반응중심을 통한 활성 또는 불활성 상태의 반응중심의 밀도, 에너지 흐름의 변화 등을 pipeline model로 제시하였다.
- 수은 농도의 증가에 따라 RC/CS와 광계Ⅱ에서의 에너지 흐름의 변화를 살펴보았다(Fig. 5). 먼저, RC/CS은 수은 농도가 증가할수록 점차적으로 감소하였으며, 400 µM의 수은 처리구에서는 대조구에 비해 21.
- 수은의 농도를 달리하여 배양하였을 때 시료가 녹색 상태를 유지하여 육안으로는 차이가 없으면서 형광이미지에서 검출이 가능한 시간대인 4시간 동안 배양하여 엽록소 및 carotenoid 함량을 분석하였다. 각각의 시료는 1 mL씩 취하여 10,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다.
- 수은의 농도와 배양 시간에 따른 Chlorella의 반응을 신속하게 모니터링하기 위해서 엽록소형광 이미지 분석을 통하여 형광변수의 변화 양상을 살펴보았다. Chlorella에 수은의 농도를 달리하여 처리한 후 24시간 동안 배양하면서 배양 시간에 따라 Fv/Fm, Fm과 Fo 이미지의 변화를 살펴보았다(Fig.
- 수은의 농도와 배양 시간에 따른 Chlorella의 반응을 신속하게 스크리닝하기 위해서 엽록소 형광이미지를 분석하였다. 형광이미지 분석은 Nedbal 등(2000)의 방법에 따라 Imaging Fluorometer (FluorCam 700MF, Photon System Instruments, Czech)를 이용하여 수행하였다.
- 수은의 효과를 알아보기 위하여 배지에 염화수은(HgCl2, Sigma-Aldrich Co., Ltd.)의 농도를 0, 50, 100, 200, 400 µM로 다양하게 처리하여 배양하였다.
- 즉, 수은의 농도(0, 50, 100, 200, 400µM)를 달리하여 24시간 동안 배양하면서 배양 시간에 따라 일정량의 시료를 취하여 15분간 광을 차단하여 암적응시킨 후 1,500 µmole/m2/sec의 saturation light와 100 µmole/m2/sec의 actinic light를 조사하고 quenching analysis에 의해 유도하였다.
- 즉, 수은의 농도를 달리하여 배양중인 시료를 시간별로 일정량씩 취하여 15분간 광을 차단하여 암적응시킨 후 1,500 µmole/m2/sec의 광량을 5초간 조사하여 Fo, Fm, Fv/Fm 등의 기본 형광변수와 O-J-I-P 곡선을 유도하였다.
- 즉, 수은의 농도(0, 50, 100, 200, 400µM)를 달리하여 24시간 동안 배양하면서 배양 시간에 따라 일정량의 시료를 취하여 15분간 광을 차단하여 암적응시킨 후 1,500 µmole/m2/sec의 saturation light와 100 µmole/m2/sec의 actinic light를 조사하고 quenching analysis에 의해 유도하였다. 형광이미지는 saturation light를 쪼인 후 1,000 ㎳와 3,960 ㎳에서 방출되는 형광을 CCD 카메라로 포획하여 각각 Fo와 Fm의 형광이미지로 나타내었으며, 이로부터 Fv/Fm의 형광이미지를 산출하여 제시하였다.
대상 데이터
- JM 배지의 조성은 Ca(NO3)2·4H2O (4 ㎎/L), KH2PO4 (2.48 ㎎/L), MgSO4·7H2O (10.0 ㎎/L), NaHCO3 (3.18 ㎎/L), EDTA·FeNa (0.45 ㎎/L), EDTA·Na2 (0.45 ㎎/L), H3BO3 (0.496 ㎎/L), MnCl2· 4H2O (0.278 ㎎/L), (NH4)·6Mo7O4·4H2O (0.20 ㎎/L), cyanocobalamin (0.008 ㎎/L), thiamine HCl (0.008㎎/L), biotin (0.008 ㎎/L), NaNO3 (16.0 ㎎/L), Na2HPO4·12H2O (7.2 ㎎/L) 등으로 이루어졌다.
- 본 실험에 사용한 담수산 녹조류인 Chlorella vulgaris(strain KMCC FC-012)는 부경대학교에 소재하는 한국해양미세조류은행(KMCC)에서 분양받았으며, 최적 배지로 알려진 JM(Jaworski's culture medium) 액체배지에서 배양하여 사용하였다(Thompson 등, 1988).
데이터처리
- 실험결과에 대한 통계처리는 SPSS 통계 package(SPSS Inc., Release 7.5)를 이용하였으며, 분산분석에 이은 Duncan의 다중검정(P<0.01)으로 평균치간의 차이에 대한 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- 엽록소형광 O-J-I-P 곡선은 Plant Efficiency Analyzer(PEA; Hansatech Instrument Ltd., UK)를 이용하여 Strasser와 Strasser(1995)의 방법에 따라 측정하였으며, 3회 반복하였다. 즉, 수은의 농도를 달리하여 배양중인 시료를 시간별로 일정량씩 취하여 15분간 광을 차단하여 암적응시킨 후 1,500 µmole/m2/sec의 광량을 5초간 조사하여 Fo, Fm, Fv/Fm 등의 기본 형광변수와 O-J-I-P 곡선을 유도하였다.
- 수은의 농도와 배양 시간에 따른 Chlorella의 반응을 신속하게 스크리닝하기 위해서 엽록소 형광이미지를 분석하였다. 형광이미지 분석은 Nedbal 등(2000)의 방법에 따라 Imaging Fluorometer (FluorCam 700MF, Photon System Instruments, Czech)를 이용하여 수행하였다. 즉, 수은의 농도(0, 50, 100, 200, 400µM)를 달리하여 24시간 동안 배양하면서 배양 시간에 따라 일정량의 시료를 취하여 15분간 광을 차단하여 암적응시킨 후 1,500 µmole/m2/sec의 saturation light와 100 µmole/m2/sec의 actinic light를 조사하고 quenching analysis에 의해 유도하였다.
성능/효과
- (c)), 100 µM 이하의 수은 처리구에서는 4시간까지는 대조구와 차이를 보이지 않았으나, 이후에는 다소 증가하였다.
- 200 µM 이상의 수은에서 0.05 ms 이후부터 점차적으로 낮아져 전자전달이 억제되었음을 확인할 수 있으며, Fig. 2에서 살펴본 바와 같이 Fv/Fm 값이 급격하게 감소하여 수은에 의한 영향을 받고 있음을 알 수 있다.
- 6), 수은 농도가 증가할수록 RC/CS(하얀색 원)가 크게 감소하여 활성 상태의 반응중심이 감소하고 불활성 상태의 반응중심은 증가하고 있음을 알 수 있다. ABS/CS와 TRo/CS는 수은 농도가 증가할수록 점차 줄어들었으며 엽면적당 흡수되는 빛에너지 양과 광계Ⅱ에서 포획되는 에너지가 모두 감소하고 있음을 알 수 있다. 특히 400 µM 수은 처리구에서 TRo/CS는 크게 감소하였다.
- 3). Chlorella의 O-J-I-P 곡선을 살펴보면, 수은 농도가 증가할수록 J, I, P값이 크게 감소하고 있으며, 특히 P-단계에서 형광 세기가 크게 감소하였다(Fig. 3(a)).
- 2(a)). Fm 값도 역시 수은의 농도가 증가할수록 그리고 배양 시간이 길어질수록 큰 폭으로 낮아졌으며(Fig. 2(b)), Fv/Fm 값의 변화 패턴과 유사하였다.
- 그리고 400 μM 수은에서는 1시간 이후에 전체적으로 파란색을 띠고, 6시간 이후에는 Fv/Fm 이미지가 나타나지 않았다. Fm 이미지는 수은 농도가 증가할수록 그리고 배양 시간이 길어질수록 방출되는 형광이 큰 폭으로 적어져 황적색 이미지에서 녹색 이미지로의 변화를 감지할 수 있었으며(Fig. 1(b)), 이러한 변화는 Fv/Fm 이미지의 변화 패턴과 유사하였다.
- Fv/Fm 이미지는 수은 농도의 증가 또는 배양 시간이 길어질수록 크게 변화하였으나, 200 µM 이상의 고농도에서는 처리 후 2시간 이내에 형광이미지의 변화를 확인할 수 있었다.
- O-J-I-P 분석을 통해 산출된 형광변수들 중에 Fo, Fm, Fv/Fo는 수은 농도가 증가할수록 점차적으로 감소하였고, N과 Sm은 증가하였다(Fig. 3(b)).
- 광계Ⅱ 활성을 나타내는 변수들 중 ΦPO, ΨO와 ΦEO도 수은 농도가 증가할수록 크게 감소하였다(Fig. 4).
- 2). 광계Ⅱ의 광화학적 효율, 즉 Fv/Fm의 변화로 살펴보면 수은의 농도가 높거나 배양 시간이 길어질수록 크게 감소하였다(Fig. 2A). 즉, 50 µM과 100 µM의 수은 처리구에서는 2시간까지는 Fv/Fm의 변화가 거의 없었다.
- Carotenoid는 엽록소와 더불어 광수확 색소계를 구성하는 색소로서 이들 색소 함량이 감소하는 것은 수은이 색소의 합성 반응계를 심하게 저해하거나 또는 틸라코이드 막에 상해를 가함으로써 초래되는 색소 분해 때문으로 보인다. 광합성에 미치는 수은의 영향은 광합성 색소들의 함량에 기인하는데, 본 연구에서도 대조구와 비교하여 수은 처리구에서의 엽록소 a와 b, 그리고 carotenoid의 함량이 높은 농도의 수은에서 현저히 감소하였다.
- 그 결과, Fv/Fm 이미지를 보면 200 μM 이상의 수은에서는 30분 이후에 적색 이미지에서 노란색 또는 녹색 이미지로의 변화가 감지되어 Fv/Fm 값이 감소하고 있음을 알 수 있었다(Fig.
- 그리고 200 µM 이상의 농도에서는 2시간이 경과하였을 때 60% 이하로 낮아져 아주 짧은 시간 이내에 큰 폭으로 감소하였음을 확인할 수 있다.
- 그리고 엽록소 a/b는 200 µM 이하의 수은에서는 대조구와 큰 차이가 없으나 그 이상의 농도에서 크게 감소하고 있음을 확인할 수 있다.
- 그리고, O-J-I-P 분석으로부터 산출된 형광변수들 중에 Fm, Fv/Fo, RC/CS, TRo/CS, ETo/CS, ΦPO, ΨO와 ΦEO는 수은 농도가 증가할수록 점차적으로 감소하였고, N, Sm, ABS/RC, DIo/RC, DIo/CS는 증가하였다.
- 이처럼 수은에 노출된 Chlorella의 Fo 값은 수은의 농도가 증가할수록 감소하는데 이는 수은이 식물체에 독성으로 작용하여 반응중심의 손상을 야기한 결과로 생각해 볼 수 있다. 그리고, 수은에 노출된 Chlorella의Fm 값은 농도가 증가할수록 큰 폭으로 감소하는 것으로 나타나, 수은이 스트레스로 작용을 하고 있음을 알 수 있다. 이러한 Fm의 감소는 cyanobacteria인 Spirulina platensis에서도 나타나며(Lu 등, 2000), 분리한 시금치 잎의 틸라코이드 막에서도 수은 농도가 증가함에 따라 그 값이 크게 감소하였다고 보고되었다(Boucher와 Carpentier, 1999).
- 대조구에 비해 200 µM과 400 µM 수은 처리구에서 각각 2.3배, 1.9배 증가하였다.
- 먼저, RC/CS은 수은 농도가 증가할수록 점차적으로 감소하였으며, 400 µM의 수은 처리구에서는 대조구에 비해 21.8%로 크게 감소하였다(Fig.
- Fv/Fm 이미지는 수은 농도의 증가 또는 배양 시간이 길어질수록 크게 변화하였으나, 200 µM 이상의 고농도에서는 처리 후 2시간 이내에 형광이미지의 변화를 확인할 수 있었다. 수은 농도를 달리하여 4시간 동안 처리하였을 때 O-J-I-P 곡선의 패턴은 수은의 농도가 증가할수록 J, I, P값이 큰 폭으로 감소하였다. 그리고, O-J-I-P 분석으로부터 산출된 형광변수들 중에 Fm, Fv/Fo, RC/CS, TRo/CS, ETo/CS, ΦPO, ΨO와 ΦEO는 수은 농도가 증가할수록 점차적으로 감소하였고, N, Sm, ABS/RC, DIo/RC, DIo/CS는 증가하였다.
- 본 연구는 수은이 수서생태계에 미치는 영향을 평가하기 위하여 담수산 녹조류인 Chlorella를 대상으로 수은의 농도와 배양 시간을 달리하여 엽록소형광 이미지 분석과 O-J-I-P 분석을 실시하였다. 엽록소 a와 b, carotenoid 함량은 높은 농도의 수은에서는 농도가 증가함에 따라 현저히 감소하였으나 낮은 농도에서는 변화가 거의 없었다. Fv/Fm 이미지는 수은 농도의 증가 또는 배양 시간이 길어질수록 크게 변화하였으나, 200 µM 이상의 고농도에서는 처리 후 2시간 이내에 형광이미지의 변화를 확인할 수 있었다.
- 엽록소 a와 b의 함량은 대조구와 비교하여 수은에 노출되었을 때 수은의 농도가 높을 때에는 현저히 감소하였으며, 특히 400 µM의 수은에서 엽록소 a와 b의 함량이 각각 61.1%와 74.0%로 크게 감소하였다.
- 광억제는 Fv/Fm의 감소보다 ΨO의 감소와 DIo/RC의 증가에 의해 확인할 수 있으며(Force 등, 2003), 본 연구에서도 수은에 노출된 Chlorella에서 ΨO의 감소와 DIo/RC의 증가를 동반하고 있어 광억제를 받고 있음을 확인할 수 있다. 엽면적 당 에너지 흐름의 변화를 의미하는 형광변수들 중 TRo/CS와 ETo/CS는 수은 농도가 증가할수록 점차 감소하였으며, DIo/CS는 증가하는 양상을 보였다(Fig. 5(c)).
- 즉, 50 µM과 100 µM의 수은 처리구에서는 2시간까지는 Fv/Fm의 변화가 거의 없었다. 이후 점차 낮아져 처리 후 6시간이 경과하였을 때에는 대조구에 비해서 각각 87.6%와 67.1%로 낮아졌다. 그리고 200 µM 이상의 농도에서는 2시간이 경과하였을 때 60% 이하로 낮아져 아주 짧은 시간 이내에 큰 폭으로 감소하였음을 확인할 수 있다.
- 이는 Table 2에서 살펴본 바와 같이 고농도의 수은에서 엽록소 a의 급격한 감소로도 추측해 볼 수 있다. 활성상태의 반응중심 당 에너지 흐름의 변화를 의미하는 변수들 중 ABS/RC와 DIo/RC는 수은 농도가 증가할수록 점차적으로 증가하였으며, TRo/RC와 ETo/RC는 조금 감소하였다(Fig. 5(b)).
후속연구
- 이러한 결과를 토대로 Chlorella는 낮은 농도의 수은에서도 4시간 이내의 짧은 시간 동안에 민감하게 반응하고 있어 수서생태계의 환경지표 식물로 활용할 수 있으며, 스트레스 하에서 뚜렷하게 증가하거나 감소하는 형광변수들(Fm, ΦPO, ΨO, RC/CS 등)을 수은의 영향을 조기에 정량적으로 진단하는데 활용할 수 있을 것으로 보인다.
- 이상의 결과를 토대로 Chlorella는 수은에 민감하게 반응하여 수서생태계의 환경지표 생물로 활용이 가능할 뿐만 아니라, 황백화 현상 등 가시적인 징후가 나타나기 전에 수은 독성을 조기에 진단하는 데 형광이미지 분석이나 O-J-I-P 분석이 유용하게 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
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