최근 연구에서 활성 산소 및 비만에 대한 유전자 발현이 비만과 노화를 촉진시키는 원인으로 주목 받고 있으며, 이를 통해 노화와 비만의 억제 체계를 규명하려는 다양한 방법들이 연구되고 있다. 본 연구에서는 우리나라 전국 각지의 산야지에 자생하며 농가에서 재배하기도 하는 국화과에 속하는 식물인 참취(Aster scaber Thunb.) 메탄올 추출물의 항산화력과 3T3-L1 전구지방세포의 지방세포형성과정에 미치는 영향을 확인하였다. 참취 메탄올 추출물에 존재하는 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량은 각각 $57.07{\pm}2.17$, $54.62{\pm}2.24{\mu}g/mg$으로 나타났다. 시료의 DPPH, ABTS radical 소거 활성을 측정한 결과 $RC_{50}$값이 각각 $22.24{\pm}0.40$, $53.19{\pm}1.61{\mu}g/mL$로 우수한 항산화 효과를 나타냈다. 참취의 메탄올 추출물이 3T3-L1 전구지방세포에서 분화유도 물질(IBMX, DEXA, Insulin)과 함께 처리했을 때 지방구의 형성을 농도 의존적으로 감소시켰다. 또한 이들은 지방세포의 증식 및 분화되는 과정에서 발현되는 adipogenic transcription factor 및 관련 유전자의 단백질 발현과 mRNA 발현을 유의적으로 감소시키는 것을 확인하였다. 이상의 결과로 참취 메탄올 추출물을 이용하여 항비만에 우수한 효능을 가지는 기능성 식품 소재로서의 개발이 가능할 것으로 생각된다.
최근 연구에서 활성 산소 및 비만에 대한 유전자 발현이 비만과 노화를 촉진시키는 원인으로 주목 받고 있으며, 이를 통해 노화와 비만의 억제 체계를 규명하려는 다양한 방법들이 연구되고 있다. 본 연구에서는 우리나라 전국 각지의 산야지에 자생하며 농가에서 재배하기도 하는 국화과에 속하는 식물인 참취(Aster scaber Thunb.) 메탄올 추출물의 항산화력과 3T3-L1 전구지방세포의 지방세포형성과정에 미치는 영향을 확인하였다. 참취 메탄올 추출물에 존재하는 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량은 각각 $57.07{\pm}2.17$, $54.62{\pm}2.24{\mu}g/mg$으로 나타났다. 시료의 DPPH, ABTS radical 소거 활성을 측정한 결과 $RC_{50}$값이 각각 $22.24{\pm}0.40$, $53.19{\pm}1.61{\mu}g/mL$로 우수한 항산화 효과를 나타냈다. 참취의 메탄올 추출물이 3T3-L1 전구지방세포에서 분화유도 물질(IBMX, DEXA, Insulin)과 함께 처리했을 때 지방구의 형성을 농도 의존적으로 감소시켰다. 또한 이들은 지방세포의 증식 및 분화되는 과정에서 발현되는 adipogenic transcription factor 및 관련 유전자의 단백질 발현과 mRNA 발현을 유의적으로 감소시키는 것을 확인하였다. 이상의 결과로 참취 메탄올 추출물을 이용하여 항비만에 우수한 효능을 가지는 기능성 식품 소재로서의 개발이 가능할 것으로 생각된다.
Clinical and preclinical trials of involving drugs with anti-obesity effects have focused on screening for herbal medicines suspected to have anti-obesity activities. In this study, an extract of Aster scaver Thunb., which was prepared in 80% methanol (ASE), was assessed for its total phenol content...
Clinical and preclinical trials of involving drugs with anti-obesity effects have focused on screening for herbal medicines suspected to have anti-obesity activities. In this study, an extract of Aster scaver Thunb., which was prepared in 80% methanol (ASE), was assessed for its total phenol content, total flavonoid content, antioxidant activity ability to scavenge the ${\alpha}-{\alpha}$-diphenyl-${\beta}$-picrylhydrazyl, 2,2'-azino-bis-[3-ethylbenzthiazoline]-6-sulfonic acid radical, and anti-adipogenic effects. The anti-adipogenic effect of ASE on the differentiation of 3T3-L1 pre-adipocytes to adipocytes was investigated by assaying the suppression of adipocyte differentiation and lipid accumulation by using western blot analysis and the Oil Red-O assay, respectively. The staining results showed that ASE significantly inhibited 3T3-L1. Western blot analysis results showed that ASE decreased the levels of peroxisome proliferator-activated receptor-${\gamma}$, CCAAT/enhancer-binding protein ${\alpha}$, and sterol regulatory element-binding protein 1c. These results demonstrate that ASE directly inhibits the differentiation of preadipocytes, and might be an important adjunct in the therapeutic efforts to reduce adipogenesis.
Clinical and preclinical trials of involving drugs with anti-obesity effects have focused on screening for herbal medicines suspected to have anti-obesity activities. In this study, an extract of Aster scaver Thunb., which was prepared in 80% methanol (ASE), was assessed for its total phenol content, total flavonoid content, antioxidant activity ability to scavenge the ${\alpha}-{\alpha}$-diphenyl-${\beta}$-picrylhydrazyl, 2,2'-azino-bis-[3-ethylbenzthiazoline]-6-sulfonic acid radical, and anti-adipogenic effects. The anti-adipogenic effect of ASE on the differentiation of 3T3-L1 pre-adipocytes to adipocytes was investigated by assaying the suppression of adipocyte differentiation and lipid accumulation by using western blot analysis and the Oil Red-O assay, respectively. The staining results showed that ASE significantly inhibited 3T3-L1. Western blot analysis results showed that ASE decreased the levels of peroxisome proliferator-activated receptor-${\gamma}$, CCAAT/enhancer-binding protein ${\alpha}$, and sterol regulatory element-binding protein 1c. These results demonstrate that ASE directly inhibits the differentiation of preadipocytes, and might be an important adjunct in the therapeutic efforts to reduce adipogenesis.
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문제 정의
따라서 참취 추출물이 adipogenic transcription factor의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 단백질 수준에서 확인하였다. Preadipocyte에서 분화를 유도와 동시에 참취 추출물을 0, 10, 50, 100 μg/mL 농도로 처리하고 FBS와 insulin 배지로 갈아 줄 때마다 시료를 같이 처리하여 분화 종료 후 단백질 발현을 조사한 결과는 Fig.
최근 연구에서 활성 산소 및 비만에 대한 유전자 발현이 비만과 노화를 촉진시키는 원인으로 주목 받고 있으며, 이를 통해 노화와 비만의 억제 체계를 규명하려는 다양한 방법들이 연구되고 있다. 본 연구에서는 우리나라 전국 각지의 산야지에 자생하며 농가에서 재배하기도 하는 국화과에 속하는 식물인 참취(Aster scaber Thunb.) 메탄올 추출물의 항산화력과 3T3-L1 전구지방세포의 지방세포형성과정에 미치는 영향을 확인하였다. 참취 메탄올 추출물에 존재하는 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량은 각각 57.
이상의 결과로부터 경상북도 문경시에서 재배된 참취는 지역별, 품종별로 DPPH, ABTS radical을 제거하는 능력이 현저히 높은 것을 확인 할 수 있었다. 이는 플라보노이드 함량에서의 차이와 유사한 경향을 나타냈고, 참취의 뛰어난 항산화 효과와 더불어 비만 세포 분화에도 영향을 줄 수 있을지 확인해 보았다.
제안 방법
α-α-Diphenyl-β-picrylhydrazyl (DPPH, Sigma Chemical Co.) radical에 대한 각 시료의 환원력을 측정하기 위해 99% 메탄올에 각 시료를 녹여 농도별로 희석한 희석액 800 μL와 메탄올에 녹인 0.15 mM DPPH 200 μL을 가하여 실온에 30분 방치한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다(19).
Ferric reducing/antioxidant power (FRAP) assay는 Benizie와 Strain 방법(18)을 96 well plate에 맞게 수정하여 실시하였다. 반응액은 300mM acetate buffer (pH 3.
, Daejeon, Korea)들을 이용하여 Real-time PCR (Takara, Ohtsu, Japan)방법으로 증폭하였다. Real-time PCR의 반응은 2.5 U Taq polymerase, 2 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP를 첨가하여 각각의 primer에 맞는 조건으로 실시하였다. Real-time PCR은 초기변성 95℃ 30초, 변성은 95℃ 5초, annealing은 60℃ 15초, 신장반응은 72℃ 10초로 하여 40 cycle을 진행했다.
3 mL을 가하여 실온에 40분 방치한 뒤 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 추출물의 흡광도를 표준물질로 사용한 quercetin (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo, USA) 검량선과 비교하여 총 플라보노이드의 함량을 구하였다.
3T3-L1 전구지방세포를 9일 동안 분화시킨 후 배지를 제거하고 phosphate buffered saline (PBS)로 세척하고 10% formaldehyde 용액으로 세포를 고정시켰다. 다시 PBS로 세척 후, Oil red O 용액을 첨가하여 30분간 실온에서 염색하고, Oil red O 용액을 제거한 후 증류수로 세척하여 건조시킨 다음 위상차 현미경을 이용하여 관찰하였다. 또한, 흡광도 측정을 위하여 100% isopropyl alcohol로 염색된 지방구를 용출시켜 spectrophotometer (Spectra MAX M2, Molecular Device, Sunnyvale, California, USA)를 이용하여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다.
Lipid droplet이 축적된 부분은 대부분이 중성지방이기 때문에 염색이 가능하다. 따라서 3T3-L1 지방전구세포가 지방세포로의 분화과정에 나타나는 lipid droplet 생성에 참취 추출물이 어떠한 영향을 미치는지를 확인하기 위하여 각각의 시료를 적정 농도로 처리하여 분화를 유도한 후 Oil Red O 염색 전후로 구분 하여 lipid droplet 생성 정도를 위상차 현미경으로 관찰하였다. 그 결과, 참취 추출물을 처리하지 않고 분화를 유도하였을 경우, 세포질 내 lipid droplet의 형성이 활발하게 유발되는 것으로 관찰되었고, 참취 추출물을 10, 50, 100 μg/mL로 처리하였을 때 농도 의존적으로 지방구 형성이 억제되는 것을 관찰할 수 있었다.
따라서 본 연구에서는 참취 추출물의 항산화 활성을 검정하였고, 지방전구세포인 3T3-L1 세포에서 insulin, dexamethasone 및 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) 등의 분화 유도인자를 혼합 처리를 통해 인위적으로 지방세포의 분화를 유도한 후 adipogenesis 과정에 미치는 참취 추출물의 영향을 조사하였고, 이때 C/EBPα, PPARγ 등과 같은 adipogenic transcription factor들의 발현에 어떠한 변화가 유발되었는지를 조사하였다.
다시 PBS로 세척 후, Oil red O 용액을 첨가하여 30분간 실온에서 염색하고, Oil red O 용액을 제거한 후 증류수로 세척하여 건조시킨 다음 위상차 현미경을 이용하여 관찰하였다. 또한, 흡광도 측정을 위하여 100% isopropyl alcohol로 염색된 지방구를 용출시켜 spectrophotometer (Spectra MAX M2, Molecular Device, Sunnyvale, California, USA)를 이용하여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다.
배양 및 분화 배지는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium high glucose (DMEM)에 10% calf serum와 antibiotics를 첨가하여 5% CO2, 37℃ 인큐베이터에서 배양하여 세포가 confluent 상태가 되면 trypsin/EDTA를 처리하여 세포를 원심분리하여 세포를 모아서 3×105 cells/well의 밀도로 6 well에 분주한 후 100% confluency 상태에서 48시간 방치 후 DMEM에 10% FBS와 23mg/mL IBMX (Sigma Chemical Co.), 5mg/mL insulin (Sigma Chemical Co.), 1mM dexamethasone (Sigma Chemical Co.) 이 첨가된 배지(MDI)를 처리 하여 분화를 48시간 동안 유도하고 그 후 2일 마다 10% FBS DMEM 배지에 5mg/mL의 insulin이 첨가된 배지를 교체해주었다.
침전물에 75% ethanol을 첨가하여 제거한 후 diethyl pyrocarbonate (DEPC) 처리된 증류수를 첨가하여 65℃ 수조에서 10분간 반응시켜 침전물을 녹였다. 분리된 RNA는 UV/visible spectrophotometer (Biospec-1601, Shimadzu Biotech, Kyoto, Japan)를 이용하여 정량하였다. 분리된 total RNA 2 μg, RNA PCR kit을 혼합하여 42℃에서 90분간 반응시킨 후 70℃에서 10분간 가열하여 반응을 종결시켰다.
Real-time PCR은 초기변성 95℃ 30초, 변성은 95℃ 5초, annealing은 60℃ 15초, 신장반응은 72℃ 10초로 하여 40 cycle을 진행했다. 용해 곡선은 55℃로 시작하여 95℃를 종말점으로 0.5℃씩 상승시키며 80번을 반응하여 원하는 형광 값을 검출하였다.
계속하여 2차 항체를 2시간 반응시키고 다시 TST로 3회 세척하였다. 증류수로 세척하고 membrane에 ECL detection kit (WSE-7120S, ATTO Co. Tokyo, Japan)의 발색시약 I과 II를 1:1로 섞은 후에 혼합액을 도포하고, X-ray film (CP-G Plus, Agfa Healthcare Ltd, New Orleans, LA, USA)에 노출하여 현상한 후 film상의 band 농도를 관찰하였다.
참취 추출물 및 분획물의 지방세포 분화억제 활성을 검토하기 위하여 Oil red O staining을 시행하였다. Oil red O staining은 중성지방을 염색하는 방법으로 지방 세포 내 중성지방 축적 정도를 시각화할 수 있다.
참취 추출물의 지방세포 분화억제에 미치는 영향을 알아보기 위해 우선 세포독성 평가를 실시하였다. 3T3-L1 전구지방세포에 참취 추출물을 10, 50, 100 μg/mL의 농도로 처리한 결과, 세포 생존율은 95% 이상으로 나타나 실험 농도에서는 세포독성이 전혀 나타나지 않았다(data not shown).
3T3-L1 전구지방세포에 참취 추출물을 10, 50, 100 μg/mL의 농도로 처리한 결과, 세포 생존율은 95% 이상으로 나타나 실험 농도에서는 세포독성이 전혀 나타나지 않았다(data not shown). 참취 추출물이 3T3-L1 전구지방세포의 지방구 형성에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 전지방세포를 분화 유도 후 lipid droplet만 특이적으로 염색하는 Oil red O 염색시약을 이용하여 염색한 후 200배 배율의 현미경으로 lipid droplet를 관찰하였다(Fig. 2). Lipid droplet는 phospholipid monolayer에 의해 둘러싸인 중성지방으로 precursor fibroblast에서부터 지방세포로의 분화과정에서 나타나며, PPARγ와 같은 중요한 adipogenic transcription factor들에 의해 조절되는 것으로 알려져 있다(32).
희석된 용액 180 μL에 sample 20 μL를 가하여 정확히 1분 동안 방치한 후 흡광도를 측정하였다.
대상 데이터
실험에 사용된 3T3-L1 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 분양 받아 사용하였다. 배양 및 분화 배지는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium high glucose (DMEM)에 10% calf serum와 antibiotics를 첨가하여 5% CO2, 37℃ 인큐베이터에서 배양하여 세포가 confluent 상태가 되면 trypsin/EDTA를 처리하여 세포를 원심분리하여 세포를 모아서 3×105 cells/well의 밀도로 6 well에 분주한 후 100% confluency 상태에서 48시간 방치 후 DMEM에 10% FBS와 23mg/mL IBMX (Sigma Chemical Co.
실험에 사용된 참취는 문경농가에서 재배하여 건조시킨 상태의 것을 제공받아 사용하였다. 먼저 시료 무게의 10배량의 (w/v)의 80% methanol로 24시간 동안 정치 배양하여 총 3회 추출하였다.
데이터처리
실험결과는 SPSSTM (ver. 12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 통계프로그램을 이용하여 각 실험군의 평균±표준편차로 표시하였고, 일원배치분산분석으로 비교하였으며 Duncan’s multiple range test에 의해 각 실험군 간에 유의성을 p<0.05 수준에서 검정하였다.
이론/모형
Total RNA를 역전사 시켜 생성된 cDNA는 C/EBP (TTGAAGCACAATCGATCCATCC/GCACACTGCCATTGCACAAG), FAS (AGCACTGCCTTCGGTTCAGTC/AAGAGCTGTGGAGG CCACTTG)의 primer (Bioneer Co., Daejeon, Korea)들을 이용하여 Real-time PCR (Takara, Ohtsu, Japan)방법으로 증폭하였다. Real-time PCR의 반응은 2.
참취 추출물 및 분획물의 지방세포 분화과정에서 발현하는 인자인 PPAR-γ, C/EBP-α 단백질발현에 미치는 영향을 조사하기 위하여 Western blot을 실시하였다.
총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법(16)을 응용하여 측정하였다. 각 시료 추출물 1 mg을 증류수 1 mL에 녹이고, 10배 희석한 희석액 2 mL에 2배 희석한 Folin 시약 2 mL을 첨가하고 3분간 방치한 후 10% Na2CO3 2 mL을 넣고 1시간 반응시킨 후 UV/Visible spectrophotometer (UVIKON 922, Kontron Instrument, Zürich, Switzerland)를 사용하여 700 nm에서 흡광도를 측정하여 tannic acid를 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다.
총 플라보노이드 함량은 Moren 등(17)의 방법에 의해 측정하였다. 각 시료 추출물 0.
성능/효과
3T3-L1 전구지방세포에 참취 추출물을 10, 50, 100 μg/mL의 농도로 처리한 결과, 세포 생존율은 95% 이상으로 나타나 실험 농도에서는 세포독성이 전혀 나타나지 않았다(data not shown).
그 결과, 참취 추출물을 처리하지 않고 분화를 유도하였을 경우, 세포질 내 lipid droplet의 형성이 활발하게 유발되는 것으로 관찰되었고, 참취 추출물을 10, 50, 100 μg/mL로 처리하였을 때 농도 의존적으로 지방구 형성이 억제되는 것을 관찰할 수 있었다.
참취의 메탄올 추출물이 3T3-L1 전구지방세포에서 분화유도 물질(IBMX, DEXA, Insulin)과 함께 처리했을 때 지방구의 형성을 농도 의존적으로 감소시켰다. 또한 이들은 지방세포의 증식 및 분화되는 과정에서 발현되는 adipogenic transcription factor 및 관련 유전자의 단백질 발현과 mRNA 발현을 유의적으로 감소시키는 것을 확인하였다. 이상의 결과로 참취 메탄올 추출물을 이용하여 항비만에 우수한 효능을 가지는 기능성 식품 소재로서의 개발이 가능할 것으로 생각된다.
또한 Woo 등(26)의 연구에 따르면 수수의 항산화 성분이 지역별로 차이가 있는 것으로 보고하였다. 본 실험에 이용한 참취는 경상북도 문경시 농가에서 재배된 시료로 강원도 지역에서 재배된 참취에 비해 플라보노이드 함량이 더 높은 것으로 확인되었다. 지역별 시료의 플라보노이드 함량 차이는 지방세포의 분화 억제능에도 영향을 미칠 것으로 생각되며, 특히 플라보노이드 함량이 높은 문경 참취의 분화 억제능이 더 높을 것으로 생각된다.
본 실험에서는, 분화를 유도한 control에서 C/EBPα, FAS의 mRNA 발현이 증가되는 것을 확인하였고, 참취 추출물을 10, 50, 100 μg/mL의 농도로 처리하였을 때 그 발현이 감소됨을 확인하였다.
시료를 처리하지 않은 분화 유도군에서는 PPARγ 및 C/EBPα의 발현이 현저하게 증가하는 것으로 나타났으며, 참취 추출물의 처리에 의해 PPARγ와 C/EBPα, SREBP-1c의 단백질 발현이 감소함을 확인하였다.
시료의 DPPH, ABTS radical 소거 활성을 측정한 결과 RC50값이 각각 22.24±0.40, 53.19±1.61 μg/mL로 우수한 항산화 효과를 나타냈다.
이상의 결과로부터 경상북도 문경시에서 재배된 참취는 지역별, 품종별로 DPPH, ABTS radical을 제거하는 능력이 현저히 높은 것을 확인 할 수 있었다. 이는 플라보노이드 함량에서의 차이와 유사한 경향을 나타냈고, 참취의 뛰어난 항산화 효과와 더불어 비만 세포 분화에도 영향을 줄 수 있을지 확인해 보았다.
이상의 결과를 살펴볼 때 참취 추출물은 3T3-L1 지방전구세포에서 adipogenic transcription factor인 PPARγ와 C/EBPα 및 SREBP-1c의 발현을 억제함으로써 lipid droplet의 생성을 감소시켜 지방세포로의 분화를 억제시킨 것으로 추정된다.
이상의 결과에서 참취 추출물은 3T3-L1 지방전구세포에서 adipogenic transcription factor인 C/EBPα와 지방 합성에 관여하는 FAS의 발현을 억제함으로써 lipid droplet 및 triglyceride 생성을 감소시켜 지방세포로의 분화를 억제시킬 수 있는 것으로 생각된다.
그 결과, 참취 추출물을 처리하지 않고 분화를 유도하였을 경우, 세포질 내 lipid droplet의 형성이 활발하게 유발되는 것으로 관찰되었고, 참취 추출물을 10, 50, 100 μg/mL로 처리하였을 때 농도 의존적으로 지방구 형성이 억제되는 것을 관찰할 수 있었다. 이와 같은 실험 결과로 참취 추출물의 처리가 lipid droplet의 생성을 저해시켜 지방 축적을 억제하는 효과가 있음을 확인 하였다.
참취 메탄올 추출물에 존재하는 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량은 각각 57.07±2.17, 54.62±2.24 μg/mg으로 나타났다.
Kim 등(27)의 보고에 따르면 플라보노이드를 주성분으로 함유한 와송의 항고지혈증, 체중감소 효과, 1일 음식 섭취량 감소, 1일 체중 증가량 감소 등 체중 증가와 관련된 비만인자에 매우 직접적인 효과를 나타내었다고 보고하였다. 따라서 추후 참취의 플라보노이드 성분 규명을 통해 비만 억제 효과를 가지는 참취의 상품화를 위한 기초자료로 활용이 가능할 것으로 보인다.
따라서 향후 참취의 플라보노이드 성분의 분리 · 정제를 통해 지방세포의 분화억제에 영향을 미치는 성분을 규명함과 동시에 동물실험 등을 통해 이의 항비만 활성을 확인하고자 한다.
또한 국화과 식물인 톱풀, 좀개미취, 미국쑥부쟁이, 각시취, 울릉미역취, 수리취 보다 더 낮은 농도의 RC50값을 나타냈다. 이러한 결과는 참취가 다른 국화과 식물 중에서도 우수한 항산화 효과를 나타내어 고부가가치의 기능성 식품으로의 사용이 가능하리라 생각된다. 또한 참취의 우수한 항산화 효과는 비만으로 인한 인슐린 저항성을 개선시키고 비만인에서 증가된 활성산소에 의한 여러 합병증의 유발을 예방할 수 있음을 생각 할 수 있다(31).
또한 이들은 지방세포의 증식 및 분화되는 과정에서 발현되는 adipogenic transcription factor 및 관련 유전자의 단백질 발현과 mRNA 발현을 유의적으로 감소시키는 것을 확인하였다. 이상의 결과로 참취 메탄올 추출물을 이용하여 항비만에 우수한 효능을 가지는 기능성 식품 소재로서의 개발이 가능할 것으로 생각된다.
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