구강구취균 4종을 국내산 프로폴리스를 이용하여 프로폴리스의 농도, 열처리, pH의 변화를 통한 항균효과를 조사하였다. P. gingivalis KCTC 5352가 다소 프로폴리스에 저항적인 모습을 보였으나 그 외의 구강구취균에는 강한 항균활성을 나타내었다. 액체배지를 이용하여 프로폴리스의 농도를 조절하여 구강구치균의 민감도를 조사한 결과, 프로폴리스의 농도가 진할 수록 더 빠른 시간에 큰 활성을 보였으며 일반적으로 $0.22mg/{\mu}L$ 농도의 프로폴리스를 첨가하였을 경우 4-6시간 안에 대부분의 균이 사멸하였다. TEM을 통해 프로폴리스가 균의 세포에 어떤 영향을 미치는가 살펴보았으며 프로폴리스를 첨가한 균의 세포막이 얇아지면서 붕괴되고 안의 내부물질이 유출되면서 세포가 분해됨을 확인하였다. $0.56mg/{\mu}L$ 농도의 프로폴리스를 사용하여 열처리 후와 pH 조절 후의 프로폴리스의 항균활성을 시험한 결과 열에 안정하지 않고, pH가 높아질수록 활성이 약해지는 것으로 나타났다.
구강구취균 4종을 국내산 프로폴리스를 이용하여 프로폴리스의 농도, 열처리, pH의 변화를 통한 항균효과를 조사하였다. P. gingivalis KCTC 5352가 다소 프로폴리스에 저항적인 모습을 보였으나 그 외의 구강구취균에는 강한 항균활성을 나타내었다. 액체배지를 이용하여 프로폴리스의 농도를 조절하여 구강구치균의 민감도를 조사한 결과, 프로폴리스의 농도가 진할 수록 더 빠른 시간에 큰 활성을 보였으며 일반적으로 $0.22mg/{\mu}L$ 농도의 프로폴리스를 첨가하였을 경우 4-6시간 안에 대부분의 균이 사멸하였다. TEM을 통해 프로폴리스가 균의 세포에 어떤 영향을 미치는가 살펴보았으며 프로폴리스를 첨가한 균의 세포막이 얇아지면서 붕괴되고 안의 내부물질이 유출되면서 세포가 분해됨을 확인하였다. $0.56mg/{\mu}L$ 농도의 프로폴리스를 사용하여 열처리 후와 pH 조절 후의 프로폴리스의 항균활성을 시험한 결과 열에 안정하지 않고, pH가 높아질수록 활성이 약해지는 것으로 나타났다.
Propolis is a resinous mixture found in the tree buds, sap flows, and other botanical sources, which is used by honey bees in the construction of their hives. Antimicrobial effects of propolis were evaluated against Streptococcus mutans KCTC 3065, S. sobrinus KCTC 3308, S. sobrinus KCTC 5134, and Po...
Propolis is a resinous mixture found in the tree buds, sap flows, and other botanical sources, which is used by honey bees in the construction of their hives. Antimicrobial effects of propolis were evaluated against Streptococcus mutans KCTC 3065, S. sobrinus KCTC 3308, S. sobrinus KCTC 5134, and Porphyromonas gingivalis KCTC 5352 by an agar diffusion assay. Sensitivity of these microorganisms to propolis was evaluated in broth containing different concentrations of propolis at $37^{\circ}C$, followed by observation using transmission electron microscopy (TEM). Propolis inhibited all oral microorganisms tested at the minimum inhibitory concentration (MIC) of $0.14mg/{\mu}L$ in the agar diffusion assay. Treatment with 0.06 and $0.22mg/{\mu}L$ of propolis had a bactericidal effect in a concentration- and treatment time-dependent manner against the tested microorganisms. TEM of propolis-treated S. mutans KCTC 3065 and P. gingivalis KCTC 5352 revealed structural damage of the cell membrane. The activity of propolis was affected by heat and pH treatment. The results indicate that propolis shows antibacterial activity against oral microorganisms and that it has potential for future applications in the food industry.
Propolis is a resinous mixture found in the tree buds, sap flows, and other botanical sources, which is used by honey bees in the construction of their hives. Antimicrobial effects of propolis were evaluated against Streptococcus mutans KCTC 3065, S. sobrinus KCTC 3308, S. sobrinus KCTC 5134, and Porphyromonas gingivalis KCTC 5352 by an agar diffusion assay. Sensitivity of these microorganisms to propolis was evaluated in broth containing different concentrations of propolis at $37^{\circ}C$, followed by observation using transmission electron microscopy (TEM). Propolis inhibited all oral microorganisms tested at the minimum inhibitory concentration (MIC) of $0.14mg/{\mu}L$ in the agar diffusion assay. Treatment with 0.06 and $0.22mg/{\mu}L$ of propolis had a bactericidal effect in a concentration- and treatment time-dependent manner against the tested microorganisms. TEM of propolis-treated S. mutans KCTC 3065 and P. gingivalis KCTC 5352 revealed structural damage of the cell membrane. The activity of propolis was affected by heat and pH treatment. The results indicate that propolis shows antibacterial activity against oral microorganisms and that it has potential for future applications in the food industry.
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문제 정의
이에 본 연구에서는 천연물질인 프로폴리스를 사용하여 구강구취균에 대한 항균능력을 알아보고, 구강구취균의 세포에 미치는 영향을 전자현미경을 통해 알아보고자 한다. 또한 프로폴리스를 열 처리하거나 pH를 조절함으로써 가공 조건에서의 안정성을 조사하고자 한다.
mutans에 대해 억제효과가 크다고 보고하였다(20). 이에 본 연구에서는 천연물질인 프로폴리스를 사용하여 구강구취균에 대한 항균능력을 알아보고, 구강구취균의 세포에 미치는 영향을 전자현미경을 통해 알아보고자 한다. 또한 프로폴리스를 열 처리하거나 pH를 조절함으로써 가공 조건에서의 안정성을 조사하고자 한다.
제안 방법
Agar diffusion assay를 통해 4개의 구강구취균이 프로폴리스에 대한 균의 감수성을 확인한 후 18시간 배양한 S. mutans (KCTC 3065), S. sobrinus (KCTC 3308, KCTC 5134), P. gingivalis (KCTC 5352)를 균 배양액의 농도가 105 CFU/mL가 되도록 TSB에 희석하여 접종하였다. 희석된 균 배양액 900 µL에 각 농도가 다른 프로폴리스(0.
Propylene oxide와 Spurr’s resin을 1:1, 0:1, 0:1 비율로 맞춘 후 각각 2시간, 12시간, 2시간 동안 shaker (Sunkay, Japan)를 이용하여 반응시켰다.
S. mutans KCTC 3065에 프로폴리스 0.56 mg/µL을 세시간 처리한 균을 실험 군으로, 처리하지 않은 균을 대조 군으로 잡고, P. gingivalis KCTC 5352는 프로폴리스 2.2 mg/µL을 세시간 처리한 균을 실험 군으로 정한 후 처리하지 않은 균을 대조 군으로 하여 transmission electron microscopy (TEM, LIBRA 120, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)를 통해서 프로폴리스의 구강구취균세포에 대한 영향을 알아보았다.
각 균이 분주된 0.75% soft TSA에 멸균시킨 유리 실린더를 올린 후 희석한 각 농도의 프로폴리스를 10 µL씩 주입하였다.
구강구취균 4종을 국내산 프로폴리스를 이용하여 프로폴리스의 농도, 열처리, pH의 변화를 통한 항균효과를 조사하였다. P.
프로폴리스의 각 균에 대한 항균활성은 배양 후 생성되는 집락(colony)의 수를 통해 확인하였다. 균은 TSA에 도말하여 균의 생육을 확인하였다. 모든 실험은 3번 반복하였으며 평균값을 이용하였으며 실험 방법은 Kim과 Chung (21)을 참고하여 진행하였다.
반응 후 새로운 resin으로 교체한 표본은 70℃에서 24시간 동안 건조(polymerization) 한 후 TEM을 이용하여 관찰하였다.
프로폴리스의 구강구취균에 대한 항균력은 agar diffusion assay를 이용하여 Table 1에 나타내었다. 배양 후 프로폴리스 처리에 따라 유리 실린더 주변에 나타나는 inhibition zone의 반경을 통해 프로폴리스의 항균력을 살펴보았다. S.
5% uranyl acetate를 이용하여 4℃에서 하룻밤(18시간) 보관하였다. 이후 10분 간격으로 실온에서 에탄올 30, 50, 70, 80, 90, 100, 100, 100%를 이용하여 탈수과정을 가졌다. 100% propylene oxide를 15분 간격으로 2번 반복하여 transition과정을 가졌다.
접종한 프로폴리스의 농도가 진할수록 나타나는 zone의 직경이 넓은 것으로 보아 구강구취균에 대한 프로폴리스의 항균력이 농도 의존적임을 추측해볼 수 있었다. 최소저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC)는 균에 대한 저해가 나타나는 가장 최소의 농도로 프로폴리스 처리 후 유리 실린더 주변에 나타나는 zone 형성 정도로 판단하였다. 실험 결과 S.
프로폴리스 농도는 sensitive test 결과를 토대로 하여 P. gingivalis KCTC 5352는 2.2 mg/µL, S. mutans KCTC 3065는 0.56 mg/µL의 농도로 처리하였다.
프로폴리스의 pH 변화에 따른 구강구취균에 대한 항균력을 조사하기 위해 105 CFU/mL로 조절하여 만든 soft TSA에 pH를 각 4, 6, 8 그리고 10으로 조정한 프로폴리스 0.56 mg/µL을 각각 10µL씩 분주하여 실온에서 4시간 흡수 시킨 후 37℃에서 18시간 배양하였으며 모든 실험은 3번 반복하였다.
대조 군으로는 멸균한 증류수를 100 µL 처리하여 사용하였다. 프로폴리스의 각 균에 대한 항균활성은 배양 후 생성되는 집락(colony)의 수를 통해 확인하였다. 균은 TSA에 도말하여 균의 생육을 확인하였다.
프로폴리스의 구강구취균 세포에 대한 영향을 알아보기 위하여, 프로폴리스를 처리한 P. gingivalis KCTC 5352와 S. mutans KCTC 3065을 TEM을 통하여 관찰하였으며 결과는 각각 Fig. 3과 Fig. 4와 같다. 프로폴리스 농도는 sensitive test 결과를 토대로 하여 P.
프로폴리스의 열 안정성을 조사하기 위하여 프로폴리스 0.56 mg/µL을 각각 40, 60, 80 그리고 100℃에서 10분 동안 가열처리하였다.
프로폴리스의 열과 pH에 대한 안정성을 시험하기 위하여, 열처리한 프로폴리스를 구강구취균에 대하여 agar diffusion assay를 하였다. 열처리 전에는 각각의 구강구취균에 대해 항균력을 보였던 0.
대상 데이터
균주는 stock culture 상태로 −80℃에서 저장 보관하였으며 실험에 사용하기 위해서 각각의 구강구취균은 tryptic soy broth (TSB, Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) 배지를 이용하였다.
본 실험에서 사용된 구강구취균은 S. mutans (KCTC 3065), S. sobrinus (KCTC 3308, KCTC 5134), P. gingivalis (KCTC 5352)를 사용하였으며 한국생명공학연구원 생명자원센터(Daejeon, Korea)에서 분양 받아 사용하였다. 균주는 stock culture 상태로 −80℃에서 저장 보관하였으며 실험에 사용하기 위해서 각각의 구강구취균은 tryptic soy broth (TSB, Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) 배지를 이용하였다.
본 실험에서 사용된 프로폴리스는 Withealth Propolis Co. (Kyungnam, Korea)에서 제공받은 국산 프로폴리스로 실험에 사용되기 전까지는 냉장온도(4℃)에서 보관하였다.
균은 TSA에 도말하여 균의 생육을 확인하였다. 모든 실험은 3번 반복하였으며 평균값을 이용하였으며 실험 방법은 Kim과 Chung (21)을 참고하여 진행하였다.
성능/효과
0.56 mg/µL 농도의 프로폴리스를 사용하여 열처리 후와 pH 조절 후의 프로폴리스의 항균활성을 시험한 결과 열에 안정하지 않고, pH가 높아질수록 활성이 약해지는 것으로 나타났다.
4종의 구강구취균에 배양액에 대한 프로폴리스의 항균 효과를 살펴본 결과 S. mutans KCTC 3065를 제외한 실험 균들은 프로폴리스 0.22 mg/µL의 농도에서 6시간 이내에 99.9% 이상이 사멸하는 모습을 볼 수 있었다.
구강구취균 4종을 국내산 프로폴리스를 이용하여 프로폴리스의 농도, 열처리, pH의 변화를 통한 항균효과를 조사하였다. P. gingivalis KCTC 5352가 다소 프로폴리스에 저항적인 모습을 보였으나 그 외의 구강구취균에는 강한 항균활성을 나타내었다. 액체배지를 이용하여 프로폴리스의 농도를 조절하여 구강구치균의 민감도를 조사한 결과, 프로폴리스의 농도가 진할 수록 더 빠른 시간에 큰 활성을 보였으며 일반적으로 0.
배양 후 프로폴리스 처리에 따라 유리 실린더 주변에 나타나는 inhibition zone의 반경을 통해 프로폴리스의 항균력을 살펴보았다. S. mutans와 S. sobrinus 그리고 P. gingivalis에 대해 프로폴리스가 항균력을 갖는 것을 확인 할 수 있었다. 특히 S.
Sensitive test를 통해 P. gingivalis KCTC 5352을 2.2 mg/µL에 세시간 처리 하였을 때 완전 사멸이 일어나지 않음을 확인하였으며 TEM사진에서 역시 붕괴되지 않은 세포들을 볼 수 있다.
또한, 붕괴의 정도가 더 크고 중간 TEM 사진의 경우 세포의 형태를 알아볼 수 없을 만큼 그 경계가 흐려져 있음을 확인 할 수 있었다. TEM 사진을 종합한 결과 프로폴리스를 처리 할 경우 세포벽의 경계가 흐려지고 붕괴되면서 세포 내부의 물질들이 밖으로 유실되고 세포가 붕괴되는 작용으로 프로폴리스가 S. mutans와 P. gingivalis에 대해 항균작용을 나타내는 것으로 사료된다.
22 mg/µL 농도의 프로폴리스를 첨가하였을 경우 4-6시간 안에 대부분의 균이 사멸하였다. TEM을 통해 프로폴리스가 균의 세포에 어떤 영향을 미치는가 살펴보았으며 프로폴리스를 첨가한 균의 세포막이 얇아지면서 붕괴되고 안의 내부물질이 유출되면서 세포가 분해됨을 확인하였다. 0.
mutans KCTC 3065에 대해선 항균활성을 보이지 않았다. 구강구취균들에 대해서는 40, 100℃에서 열처리한 프로폴리스에 대해서는 거의 대부분의 균이 활성을 보이지 않았으며 80℃에서 열처리 하였을 때 가장 활성이 두드러지게 나타남을 볼 수 있었다. 하지만 그 활성 역시 매우 약하였다.
gingivalis는 뚜렷한 내막과 외막이 발견되며 세포질 내 밀도가 높았으며 피톤치드를 첨가하였을 때 세포질 내용물이 사라진 모습을 보고하였다. 또한 농도가 증가함에 따라 내막과 외막 두개의 막만 존재하는 세포의 수가 증가하는 것을 발견하였다. 본 실험에서 프로폴리스를 첨가하여 배양한 후의 P.
9% 이상이 사멸하는 모습을 볼 수 있었다. 또한 프로폴리스의 농도가 높아질수록 짧은 시간에 급격한 균의 사멸을 나타냄을 확인할 수 있었다(Fig. 2).
3b)와 마찬가지로 세포 내의 물질이 빠져 나오는 것을 볼 수 있다. 또한, 붕괴의 정도가 더 크고 중간 TEM 사진의 경우 세포의 형태를 알아볼 수 없을 만큼 그 경계가 흐려져 있음을 확인 할 수 있었다. TEM 사진을 종합한 결과 프로폴리스를 처리 할 경우 세포벽의 경계가 흐려지고 붕괴되면서 세포 내부의 물질들이 밖으로 유실되고 세포가 붕괴되는 작용으로 프로폴리스가 S.
또한 농도가 증가함에 따라 내막과 외막 두개의 막만 존재하는 세포의 수가 증가하는 것을 발견하였다. 본 실험에서 프로폴리스를 첨가하여 배양한 후의 P. gingivalis의 경우 세포질 내용물 뿐만 아니라 내, 외막의 붕괴까지 관찰할 수 있었다.
비교적 0.22 mg/µL 농도의 프로폴리스 처리균은 사멸속도는 느리나 처리 4시간 이후엔 비교적 큰 살균효과를 보였으나 0.06, 0.01 mg/µL 농도의 프로폴리스 처리 균의 경우 정균 효과를 보였다.
Chung 등(27)은 멸균 생리 식염수에 50%(w/v) 마늘 착즙액과 100℃에서 30분간 열처리한 마늘 착즙액을 그람 음성균 5종과 그람 양성균 10종의 식중독균과 젖산균에 접종하여 항균력 조사를 하였다. 생마늘의 경우 식중독균과 젖산균의 생육에 대해 강하게 항균력을 나타내었으나 열처리를 한 마늘의 경우 생마늘의 항균력과 비교하였을 때 비교적 약한 항균력을 보였다. Park 등(28)은 돌산갓 추출물을 열처리하여 agar diffusion assay를 이용하여 돌산갓 의 추출물이 4가지 균에 생육억제환의 크기가 비슷하였으며 열에 매우 안정하다는 결과를 보고하였으며, 오미자의 에탄올 추출물도 60-120℃에서 10℃ 간격으로 1시간 씩 처리한 결과 오미자 추출물의 색의 변화는 나타났으나 항균력의 변화는 열처리 전과 비슷하여 열에 매우 안정하다고 보고하였다(29).
실험 결과 S. sobrinus KCTC 5134에 대한 프로폴리스의 최소저해농도는 0.14 mg/µL이며 S. mutans KCTC 3065, S. sobrinus KCTC 3308, P. gingivalis KCTC 5352에 대한 최소저해농도는 0.28 mg/µL이었다.
열 처리한 후의 프로폴리스는 각 구강구취균에 대해 열처리 이전보다는 활성이 떨어지는 것으로 나타났다. 열 처리 이전의 프로폴리스는 P. gingivalis KCTC 5352에 가장 약한 활성을 가지고 S. sobrinus KCTC 5134에 가장 강한 활성을 보였으나 열 처리 후에는 S. sobrinus KCTC 5134에 대한 활성이 가장 약해졌음을 볼 수 있었으며 S. mutans KCTC 3065에 대해선 항균활성을 보이지 않았다. 구강구취균들에 대해서는 40, 100℃에서 열처리한 프로폴리스에 대해서는 거의 대부분의 균이 활성을 보이지 않았으며 80℃에서 열처리 하였을 때 가장 활성이 두드러지게 나타남을 볼 수 있었다.
1에 나타내었다. 접종한 프로폴리스의 농도가 진할수록 나타나는 zone의 직경이 넓은 것으로 보아 구강구취균에 대한 프로폴리스의 항균력이 농도 의존적임을 추측해볼 수 있었다. 최소저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC)는 균에 대한 저해가 나타나는 가장 최소의 농도로 프로폴리스 처리 후 유리 실린더 주변에 나타나는 zone 형성 정도로 판단하였다.
gingivalis에 대해 프로폴리스가 항균력을 갖는 것을 확인 할 수 있었다. 특히 S. sobrinus KCTC 5134에 대한 항균력이 가장 뚜렷했으며 S. mutans KCTC 3065, S. sobrinus KCTC 3308에서도 프로폴리스가 항균성을 나타냄을 볼 수 있었으나 P. gingivalis KCTC 5352의 경우 실린더 주변에 zone이 뚜렷하게 나타나지 않고 실린더의 프로폴리스를 접종 부위만 항균작용이 나타남을 미루어보아 P. gingivalis가 프로폴리스에 대해 저항성이 큰 것으로 나타났다. S.
프로폴리스의 pH에 대한 효과는 Table 3에 나타내었다. 프로폴리스의 활성이 pH 조절 전에 비해 줄어듦을 확인하였으며 특히 약산성인 pH 6에서의 프로폴리스가 비교적 가장 항균력이 있었으며, pH가 높아질수록 프로폴리스의 항균력이 감소하는 것으로 나타났다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
프로폴리스의 일반 성분 중에 어떤 것이 가장 많이 함유되어 있고, 어떤 것이 가장 적게 함유되어 있는가?
프로폴리스의 생산은 벌들에 의해 채집되기 때문에 채집 조건에 따라 다르며 프로폴리스의 조성 또한 산지에 따라 차이가 있으나, 일반적으로 수지 50-55%, 밀랍 30%, 정유 8-10%, 회분 5%, 각종 유기성분, 미네랄 등의 성분으로 이루어져있으며, 구성성분은 약 150-180여 개의 휘발성 물질과 페놀계 화합물로 알려져 있다. 일반 성분 중에는 조지방이 가장 많이 함유되어 있으며 조섬유가 가장 적게 함유되어 있다(1). 프로폴리스 내에는 각종 유기물과 플라보노이드가 다량 함유되어 있으며 성분 중 플라보노이드는 강력한 항균효과를 가지는 것으로 보고되고 있다(2).
프로폴리스는 어떤 물질인가?
프로폴리스(propolis)는 우리나라에서 1995년 식품공전에 등재된 천연물질로 벌집에서 얻어지는 지용성 복합체이며, 식물이 꽃봉오리와 생장점을 보호하기 위해 분비하는 왁스와 수지물질을 모아 벌 자신의 침샘 분비물과 혼합하여 만든 수지성, 점착성, 고무상의 물질이다. 꿀벌은 프로폴리스를 벌집 출입구에 발라 외부로부터 균의 유입을 막기 위해 사용하며, 주로 벌통 내의 표면 틈새에 발라 빗물과 냉기를 막았으며 벌집 전체 구조를 강화하기 위해 사용한다.
프로폴리스의 조성은 일반적으로 무엇으로 구성되어 있는가?
꿀벌은 프로폴리스를 벌집 출입구에 발라 외부로부터 균의 유입을 막기 위해 사용하며, 주로 벌통 내의 표면 틈새에 발라 빗물과 냉기를 막았으며 벌집 전체 구조를 강화하기 위해 사용한다. 프로폴리스의 생산은 벌들에 의해 채집되기 때문에 채집 조건에 따라 다르며 프로폴리스의 조성 또한 산지에 따라 차이가 있으나, 일반적으로 수지 50-55%, 밀랍 30%, 정유 8-10%, 회분 5%, 각종 유기성분, 미네랄 등의 성분으로 이루어져있으며, 구성성분은 약 150-180여 개의 휘발성 물질과 페놀계 화합물로 알려져 있다. 일반 성분 중에는 조지방이 가장 많이 함유되어 있으며 조섬유가 가장 적게 함유되어 있다(1).
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