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문제 정의
- 본 연구에서는 한약제제의 품질관리에 기초 자료를 제공하고자 한의학에서 구토, 만성위염 및 궤양 등의 위장관련 질환에 널리 사용되는 한약처방 중 하나인 理中湯을 선정하였다. 본 처방의 구성 약재 중 人蔘의 ginsenoside Rb1과 ginsenoside Rg1, 甘草의 liquiritin과 glycyrrhizin 및 乾薑의 6-gingerol 등 5종의 성분을 대상으로 초고성능 액체크로마토그래피 질량분석기 (ultra-performance liquid chromatography- electrospray ionization-mass spectrometer; UPLC-ESI-MS)를 이용하여 정량분석을 실시하였다.
제안 방법
- Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 5종 성분의 분리를 위해 pump, digasser, column oven 및 autosampler로 구성된 Waters의 UPLC (Milford, MA, USA)를 사용하였다. 질량분석기는 electrospray ionization (ESI) source가 장착된 LC-MS/MS (Waters, Milford, MA, USA)를 사용하였으며, 데이터 처리는 Waters MassLynx software (version 4.
- ABTS 라디칼을 이용한 항산화능 측정은 ABTS+· cation decolorization assay방법12)을 96 well plate에 맞게 수정하여 실시하였다.
- Gginsenoside Rb1, ginsenoside Rg1, liquiritin, glycyrrhizin 및 6-gingerol 등 5종의 표준품에 대한 검량선은 50, 100, 500 및 1000 ng/mL의 농도로 희석하여 피크 면적과 농도에 대해서 작성하였다. 작성된 검량선은 상관계수 (r2)를 구하여 직선성을 판단하였다.
- 5kg의 추출물을 얻었다. LC-MS/MS 정량분석을 위하여 추출물 10mg을 정확히 측정한 후 물을 넣어 10mL로 맞춘 후 15분간 초음파 추출하였다. 그 후 0.
- LC-MS/MS에서 정량분석을 위한 ginsenoside Rg1의 MRM 조건은 m/z 799.2 (precursor ion) → 637 (product ion), ginsenoside Rb1은 m/z 1107.5 (precursor ion) → 179 (product ion), liquiritin은 m/z 417 (precursor ion) →255 (product ion), glycyrrhizin은 m/z 821.2 (precursor ion) → 351 (production) 및 6-gingerol은 m/z 295 (precursor ion) → 177 (product ion)로 설정한 후 정량을 실시하였다.
- 理中湯 내 주요성분인 ginsenoside Rb1, ginsenoside Rg1, liquiritin, glycyrrhizin 및 6-gingerol을 정량분석을 위해 Waters사의 UPLC와 질량분석기를 사용하여 Table 2와 같은 조건으로 분석을 하였다. 또한 성분의 LC-MS/MS 정량 분석을 위하여 각 성분의 precuusor ion, product ion, cone voltage 및 collision energy 등에 대한 최적의 조건은 Table 3과 같이 설정하여 multiple reaction monitoring (MRM) 모드를 적용하여 정량을 실시하였다.
- 理中湯을 구성하는 人蔘, 乾薑, 白朮 및 甘草의 4가지 구성 생약 중 人蔘의 ginsenoside Rb1과 ginsenoside Rg1, 乾薑의 6-gingerol 및 甘草의 liquiritin과 glycyrrhizin 등 5종의 성분에 대하여 LC-MS/MS를 이용한 함량분석과 본 처방의 항산화 활성을 평가하였다.
- 理中湯을 설정된 LC-MS/MS 분석법으로 5종 성분에 대한 함량을 분석하였다. LC-MS/MS에서 정량분석을 위한 ginsenoside Rg1의 MRM 조건은 m/z 799.
- 理中湯의 구성 약재 중 인삼의 주요성분인 ginsenoside Rg1과 ginsenoside Rb1, 감초의 liquiritin과 glycyrrhizin 및 건강의 6-gingerol 등 5종의 성분을 LC-MS/MS를 이용하여 동시 정량을 실시하였다 (Fig. 1). 역상 UPLC 조건에 의한 ESI 방법의 양이온 모드와 음이온 모드에서 5종의 성분을 분리를 위해 0.
- 理中湯의 항산화 활성을 평가하고자 추출물을 농도별로 조제한 후 ABTS와 DPPH 라디칼 소거활성을 측정하였다. ABTS 라디칼의 소거활성을 비교한 결과 Table 6과 같이 추출물의 농도가 증가함에 따라 ABTS 라디칼 소거활성이 증가하는 경향을 보였으며, RC50 값은 119.
- 15 mM의 DPPH 용액과 시료를 혼합하여 실온에서 30분간 반응시킨 후, 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 처방 추출물의 항산화능은 시료를 녹인 용매인 DMSO를 대조군으로 하여 대조군에 대한 라디칼 소거능을 백분율로 나타내었다. 활성비교를 위하여 vitamin C를 사용하였다.
- 본 처방의 구성 약재 중 人蔘의 ginsenoside Rb1과 ginsenoside Rg1, 甘草의 liquiritin과 glycyrrhizin 및 乾薑의 6-gingerol 등 5종의 성분을 대상으로 초고성능 액체크로마토그래피 질량분석기 (ultra-performance liquid chromatography- electrospray ionization-mass spectrometer; UPLC-ESI-MS)를 이용하여 정량분석을 실시하였다. 또한 理中湯의 ABTS 와 DPPH 라디칼 제거를 통한 항산화 활성을 평가하였다.
- 본 연구에서는 한약제제의 품질관리에 기초 자료를 제공하고자 한의학에서 구토, 만성위염 및 궤양 등의 위장관련 질환에 널리 사용되는 한약처방 중 하나인 理中湯을 선정하였다. 본 처방의 구성 약재 중 人蔘의 ginsenoside Rb1과 ginsenoside Rg1, 甘草의 liquiritin과 glycyrrhizin 및 乾薑의 6-gingerol 등 5종의 성분을 대상으로 초고성능 액체크로마토그래피 질량분석기 (ultra-performance liquid chromatography- electrospray ionization-mass spectrometer; UPLC-ESI-MS)를 이용하여 정량분석을 실시하였다. 또한 理中湯의 ABTS 와 DPPH 라디칼 제거를 통한 항산화 활성을 평가하였다.
- 1). 역상 UPLC 조건에 의한 ESI 방법의 양이온 모드와 음이온 모드에서 5종의 성분을 분리를 위해 0.1% (v/v) 개미산이 함유된 물과 아세토나이트릴의 이동상을 이용하여 Table 2 와 3의 조건을 이용하여 검출하였다. MS 분석 결과 ginsenoside Rg1, ginsenoside Rb1, liquiritin 및 glycyrrhizin은 m/z 799.
- 5종 성분의 분리를 위해 pump, digasser, column oven 및 autosampler로 구성된 Waters의 UPLC (Milford, MA, USA)를 사용하였다. 질량분석기는 electrospray ionization (ESI) source가 장착된 LC-MS/MS (Waters, Milford, MA, USA)를 사용하였으며, 데이터 처리는 Waters MassLynx software (version 4.1, Milford, MA, USA)를 사용하였다.
대상 데이터
- 0% 이상이었다. LC-MS/MS 분석을 위한 메탄올, 아세토나이트릴 및 물은 J.T. Baker (Phillipsburg, NJ, USA)에서 구입하였으며, 개미산, 2,2＇-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS), phosphate buffer saline (PBS), 2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 및 dimethyl sulfoxide (DMSO) 는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 5종 성분의 분리를 위해 pump, digasser, column oven 및 autosampler로 구성된 Waters의 UPLC (Milford, MA, USA)를 사용하였다.
- 理中湯을 구성하는 한약재의 기원은 이제현 교수 (Dongguk University, Gyeongju, Korea)와 서영배 교수 (Daejeon University, Daejeon, Korea)의 감별을 받은 후 사용하였으며, 각각의 구성 한약재들의 표본 (2008- KE19-1 ∼ 2008-KE19 -4)은 한국한의학연구원 한약기초연구그룹에 보관하였다.
- 본 실험에 사용된 理中湯의 구성 한약재인 人蔘(Ginseng Radix Alba), 乾薑(Zingiberis Rhizoma), 甘草 (Glycyrrhizae Radix et Rhizoma), 및 白朮 (Atractylodis Rhizoma Alba)은 (주)옴니허브 (Yeongcheon, Korea)와 (주)HMAX (Jecheon, Korea)에서 규격품을 구입하였다. 理中湯을 구성하는 한약재의 기원은 이제현 교수 (Dongguk University, Gyeongju, Korea)와 서영배 교수 (Daejeon University, Daejeon, Korea)의 감별을 받은 후 사용하였으며, 각각의 구성 한약재들의 표본 (2008- KE19-1 ∼ 2008-KE19 -4)은 한국한의학연구원 한약기초연구그룹에 보관하였다.
- 표준물질인 ginsenoside Rb1, ginsenoside Rg1, glycyrrhizin 및 6-gingerol은 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japan)로부터 구입하였으며, liquiritin은 (주)천연물화학 (Da ejeon, Korea)에서 구입하였다. 이들 표준물질의 순도는 모두 98.
- 각 시료의 라디칼 소거활성은 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도를 1/2로 환원시키는데 필요한 시료의 농도인 RC50값으로 나타내었다. 이때 활성비교를 위하여 vitamin C를 사용하였다.
이론/모형
- 理中湯 내 주요성분인 ginsenoside Rb1, ginsenoside Rg1, liquiritin, glycyrrhizin 및 6-gingerol을 정량분석을 위해 Waters사의 UPLC와 질량분석기를 사용하여 Table 2와 같은 조건으로 분석을 하였다. 또한 성분의 LC-MS/MS 정량 분석을 위하여 각 성분의 precuusor ion, product ion, cone voltage 및 collision energy 등에 대한 최적의 조건은 Table 3과 같이 설정하여 multiple reaction monitoring (MRM) 모드를 적용하여 정량을 실시하였다.
성능/효과
- ABTS 라디칼의 소거활성을 비교한 결과 Table 6과 같이 추출물의 농도가 증가함에 따라 ABTS 라디칼 소거활성이 증가하는 경향을 보였으며, RC50 값은 119.02 μg/mL로 관찰되었다.
- 04 μg/mL로 관찰되었다. DPPH 라디칼의 소거활성을 측정한 결과, Fig. 4와 같이 추출물의 농도가 증가함에 따라 ABTS 라디칼 소거활성과 유사하게 농도의존적인 경향이었다. 理中湯 추출물 25, 50, 100, 200, 400 μg/mL 농도에서 각각 11.
- LC-MS/MS 정량분석을 위한 MRM 조건은 ginsenoside Rg1 m/z 799.2/637, ginsenoside Rb1 m/z 1107.5/179, liquiritin m/z 417/255, glycyrrhizin m/z 821.2/351 및 6-gingerol m/z 295/177으로 분석을 실시한 결과 甘草의 주요 성분이 다른 성분에 비해 많이 함유되어 있음을 확인하였다. 또한 理中湯의 ABTS와 DPPH 라디칼 제거를 통한 항산화 활성은 용량이 높을수록 높은 활성을 나타내었다.
- LC-MS/MS를 이용하여 농도에 따른 ESI 방법의 MRM 모드에서 liquiritin, ginsenoside Rb1, ginsenoside Rg1, glycyrrhizin 및 6-gingerol 등 5종의 성분에 대한 검량선 작성 결과 상관 계수 (r2) 값이 0.9995, 0.9961, 0.9992, 0.9982 및 0.9997의 양호한 직선성을 각각 나타내었다 (Table 4).
- 1% (v/v) 개미산이 함유된 물과 아세토나이트릴의 이동상을 이용하여 Table 2 와 3의 조건을 이용하여 검출하였다. MS 분석 결과 ginsenoside Rg1, ginsenoside Rb1, liquiritin 및 glycyrrhizin은 m/z 799.2, m/z 1107.5, m/z 418 및 m/z 821.2에서 각각의 [M-H]- 형태의 분자이온 피크를 확인하였으며, 6-gingerol은 m/z 295 [M-H]+ 형태의 분자이온 피크를 확인하였다 (Fig. 2). 확립된 理中湯의 LC-MS/MS MRM 모드 결과 5종의 성분인 liquiritin, ginsenoside Rg1, ginsenoside Rb1, glycyrrhizin 및 6-gingerol은 1.
- 理中湯 추출물 25, 50, 100, 200, 400 μg/mL 농도에서 각각 11.4, 14.5, 19.8, 29.6 and 49.2%의 라디칼 소거활성을 보였으며, 양성대조군으로 사용한 vitamin C는 5, 10, 20 μg/mL 농도에서 각각 28.3, 61.1, 90.6%의 라디칼 소거활성을 보였다 (Fig. 4.).
- 2/351 및 6-gingerol m/z 295/177으로 분석을 실시한 결과 甘草의 주요 성분이 다른 성분에 비해 많이 함유되어 있음을 확인하였다. 또한 理中湯의 ABTS와 DPPH 라디칼 제거를 통한 항산화 활성은 용량이 높을수록 높은 활성을 나타내었다.
- 2 (precursor ion) → 351 (production) 및 6-gingerol은 m/z 295 (precursor ion) → 177 (product ion)로 설정한 후 정량을 실시하였다. 함량 분석 결과 理中湯 추출 물 중 인삼의 ginsenoside Rg1과 ginsenoside Rb1의 함량이 0.07 mg/g 및 0.11 mg/g으로 각각 나탔으며, 감초의 liquiritin과 glycyrrhizin 이 0.35 mg/g과 0.84 mg/g으로 각각 나타났다. 또한 건강의 6- gingerol이 0.
- 2). 확립된 理中湯의 LC-MS/MS MRM 모드 결과 5종의 성분인 liquiritin, ginsenoside Rg1, ginsenoside Rb1, glycyrrhizin 및 6-gingerol은 1.55분, 1.90분, 2.50분, 2.95분 및 3.57분에서 각각 검출되었다 (Fig. 3).
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