[논문]Probiotics를 양식넙치에 투여시 Streptococcus iniae에 대한 면역반응 및 병저항성

장익수; 김동휘; 허문수

doi:10.7845/kjm.2013.3033

Probiotics를 양식넙치에 투여시 Streptococcus iniae에 대한 면역반응 및 병저항성
Dietary Administration of Probiotics, Bacillus sp. IS-2, Enhance the Innate Immune Response and Disease Resistance of Paralichthys olivaceus against Streptococcus iniae 원문보기

Korean journal of microbiology = 미생물학회지, v.49 no.2, 2013년, pp.172 - 178

장익수 (제주대학교 해양과학대학 수산생명의학과 및 해양과 환경연구소) , 김동휘 (제주대학교 해양과학대학 수산생명의학과 및 해양과 환경연구소) , 허문수 (제주대학교 해양과학대학 수산생명의학과 및 해양과 환경연구소)

초록
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본 연구는 양식 넙치 Paralichthys olivaceus 사료 내 생균제 첨가가 넙치의 성장, 면역반응 및 병저항성에 미치는 영향을 평가하였다. 실험사료는 넙치용 배합사료(조단백질 52%, 조지방 11%, 조섬유 3%, 조회분 14%, 인 2.7%, 칼슘 1.5%, Suhyup Co., Korea)에 Bacillus sp. IS-2를 첨가하여 $10^3$, $10^5$, $10^7$ CFU/kg의 실험사료를 제작하였다. 2주간의 예비사육 후, 평균무게 $210{\pm}13g$인 실험어를 1,000 L 원형수조에 실험구 당 70마리씩 무작위로 배치하여 실험사료를 1일 2회 어체 중의 2%씩 12주 동안 공급하였다. 성장도 조사 결과 모든 실험구에서는 일반사료를 투여한 대조구에 비해 높은 성장률을 나타내었으며 $10^5$ CFU/kg 실험구에서는 대조구에 비해 약 13% 정도 높은 성장률을 나타내었다. 혈액분석 결과에는 glucose를 제외한 GOT, GPT, 단백질, 총콜레스테롤 등에서 실험구간 유의적인 차이를 나타내지 않아 생균제로 인한 간독성이나 어체 내 문제가 발생하지 않은 것으로 사료된다. Glucose인 경우 실험 종료 시점에서 증가되는 변화를 확인 할 수 있었는데 이는 수온, 수질에 의한 일시적인 현상이라 사료된다. Respiratory burst activity (NBT assay)에 있어서는 실험사료를 공급한 실험구가 대조구에 비해 높은 값을 확인할 수 있었으며 특히 $10^5$ CFU/kg 실험구와 $10^7$ CFU/kg 실험구에서 유의적으로 높은 값을 확인하였다. 혈청의 lysozyme 및 백혈구 활성에 있어서도 실험사료를 투여한 실험구에서 대조구에 비해 높은 활성을 확인 하였다. 공격실험 결과, Streptococcus inae를 접종한지 5일째부터 폐사가 시작되어 7일째 일반사료를 투여한 대조구에서는 100% 폐사율을 보인 반면, $10^3$ CFU/kg 실험구에서는 73%의 폐사율을 $10^5$ CFU/kg 실험구에서는 53%의 폐사율을 나타냈으며, $10^7$ CFU/kg 실험구에서는 45%의 폐사율을 보여 대조구에 비해 많게는 55% 이상의 높은 생존율을 나타내었다. 사료 내 첨가한 Bacillus sp. IS-2의 장내 생존 확인을 위해 실험이 종료 된 후 모든 실험구와 대조구 실험어의 장을 분리하여 배양 된 균체를 DNA를 분리 한 후에 제작 된 ditection primer를 이용한 PCR 결과 일반사료를 투여한 대조구를 제외한 모든 실험구에서 1,465 bp의 PCR product를 확인 할 수 있었다. 상기 결과를 토대로 양식넙치 사료 내 Bacillus sp. IS-2의 첨가는 양식넙치의 성장 및 면역증강, S. iniae에 대한 병정항성에 좋은 효과를 나타내어 사료첨가제로써의 이용 가능성이 클 것이라 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

The strains were added to the feed in the concentration of $10^3$, $10^5$, and $10^7$ CFU/kg and 2% of fishes were given the feed twice a day (8 AM and 5 PM) for 12 weeks. In result of the nonspecific immune response study to examine Respiratory burst activity, Lysozyme activity and Phagocytosis activity every two weeks until the end of the study, all test samples showed greater activities than control samples and improved immune activity with Bacillus sp. IS-2. The mortality test performed by artificial infection using Streptococcus iniae, a pathogenic bacterium, after the completion of this study also showed over 55% greater survival rate in all test samples. In result of performing PCR using the universal primer to verify that the probiotic stays in the intestines of the fishes, all test samples showed PCR product of 1,465 bp. Based on the above findings, it was concluded that Bacillus sp. IS-2 in the feed improved farmed flatfish's immune system and resistance against diseases as the probiotics. Also, the physiological indicators discovered by this study would be useful for identifying the mechanisms of probiotics.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구에서는 양식 생산성을 높이고 양식 환경 개선에 도움이 되며, 양식 넙치의 면역증강 효과가 있는 probiotics 균주 개발을 하기 위해 넓은 항균 스펙트럼을 갖고 있으면서 pH 내성 및 열안정성, 내염성을 갖고 있는 Bacillus sp. IS-2 균주를 선발하였으며, 이를 이용하여 각기 다른 농도로 사료에 첨가하여 양식 현장에 사용하였을 때 나타나는 양식넙치의 면역 반응, 병 저항성을 조사하여 차후 probiotics를 이용한 사료 첨가제 개발을 위한 기초자료로써 이용하고자 한다.
본 연구는 양식 넙치(Paralichthysolivaceus) 사료 내 생균제 첨가가 넙치의 성장, 면역반응 및 병저항성에 미치는 영향을 평가하였다. 실험사료는 넙치용 배합사료(조단백질 52%, 조지방 11%, 조섬유 3%, 조회분 14%, 인 2.
본 연구는 양식 넙치(Paralichthysolivaceus) 사료 내 생균제 첨가가 넙치의 성장, 면역반응 및 병저항성에 미치는 영향을 평가하였다. 실험사료는 넙치용 배합사료(조단백질 52%, 조지방 11%, 조섬유 3%, 조회분 14%, 인 2.

제안 방법

2주간의 예비사육 후, 평균무게 210±13 g인 실험어를 1,000 L 원형수조에 실험구 당 70마리씩 무작위로 배치하여 실험사료를 1일 2회 어체 중의 2%씩 12주 동안 공급 하였다.
Hitopaque 1.119 (11191-100 ml, Sigma, USA)와 분리된 혈액 샘플을 1:1로섞어 400 g, 30 min, 15℃의 조건으로 원심분리 해준 다음 분리 층을 파스퇴르 피펫을 이용하여 Mononuclear cell (MNC)의 세포를 분리하여 1×HBSS (Hank's Balanced Salt Solution, MNC 의 3배)로 3회 수세 후, cell counting을 통해 계수 한 다음, Congo red 염색약으로 염색된 yeast cell을 20:1의 비율로 상온 에서 1시간 반응을 하여 phagocytosis를 유도한다.
일반사료에 Bacillus sp. IS-2를 첨가하여 투여할 시 넙치의 항병력에 미치는 영향을 조사하기 위하여 양식장에 발병 빈도가 가장 높은 그람 양성 세균인 Streptococcus iniae를 이용하여 공격실험을 실시하였다. Streptococcus iniae (KCTC 3657)는 생명자원센터(Korean Collectionfor Type Culture, KCTC)에서 분양 받아 Brain Heart Infusion Agar (BHIA, Difco Co.
IS-2를 첨가한 사료를 급이한 넙치와 Bacillus sp. IS-2를 첨가하지 않은 일반 사료를 급이한 넙치는 사육 8주 동안 비례적으로 성장하였다. 하지만 마지막 12주 성장 실험 후 최종 어체의 평균 무게를 측정한 결과 10⁵CFU/kg 첨가사료를 급이한 실험구에서 대조구에 비해 약 13% 정도 높은 성장률을 나타냈다.
IS-2의 장 내 생존을 확인 하기 위해 실험이 종료 된 후, 각각의 실험구의 실험어에서 장을 분리하여 MRS agar (Man Rogosa and Sharpe agar, Difco Co.) 배지에 16시간 동안 배양 후, 7,000×g 15 min, 4℃의 조건으로 원심분리하여 균체를 수집하였다.
공격실험은 사료투여 후 12주 후에 실시하 였으며 대조구를 비롯하여 실험구에서 무작위로 30마리씩 선정 하여 1 ml 주사기를 이용하여 각 마리당 200 µl씩 복강주사 후 20일 동안 누적 폐사율을 조사하였다.
IS-2를 각각 첨가하여 10³, 10⁵, 10⁷CFU/kg의 실험 사료를 제작하였다. 대조구는 probiotics를 첨가하지 않은 일반 사료를 투여하였으며, 사료 투여는 1일 2회(오전 8시, 오후 5시) 넙치 체중의 2%씩 공급하였으며, 실험 사육은 총 12주 동안 수행하였다.
25이였다. 사료는 1일 2회(오전 8시, 오후 5시) 넙치 체중의 2%씩 공급하였으며, 실험 사육은 총 12주 동안 수행하였다.
실험 시작 전에 사용한 넙치는 실험 환경에 적응시키기 위해 약 2주일 동안 기초사료를 공급하여 순치시켰으며, 실험 시작 전 넙치의 평균 무게는 210±13g이었다. 사육 수조는 1,000 L 원형수조를 사용하였고, 각 수조당 70마리씩 수용하였으며, 사육수량은 1일 3회 환수, 충분한 산소 공급을 위하여 통기 하였다. 실험 기간 중의 수온, 용존산소 (dissolved oxygen, DO), pH, 염분을 매일 YSI (YSI-556MPS, YSI Environmental, USA)를 이용해 측정하였다.
) 배지에 16시간 동안 배양 후, 7,000×g 15 min, 4℃의 조건으로 원심분리하여 균체를 수집하였다. 수집된 균체를 Genomic DNA Extraction kit (Bioneer, Korea)를 사용하여 Chromosomal DNA를 분리한 후, Universal primer를 이용하여 PCR을 수행하였다. 합성된 oligonucleotides의 각각의 primer는 7F (5′-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3′), 1492R (5′-GGA TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)로 사용하였다.
식세포의 활성산소 측정은 병원체 침입 등에 의해 자극된 전신 식세포의 활성산소(O 2- )와 같은 산소라티칼(ROS)을 측정하는 시험으로 잘 알려진 NBT 환원법으로 식세포 활성을 측정하 였다. Bacillus sp.
사육 수조는 1,000 L 원형수조를 사용하였고, 각 수조당 70마리씩 수용하였으며, 사육수량은 1일 3회 환수, 충분한 산소 공급을 위하여 통기 하였다. 실험 기간 중의 수온, 용존산소 (dissolved oxygen, DO), pH, 염분을 매일 YSI (YSI-556MPS, YSI Environmental, USA)를 이용해 측정하였다. 실험 기간 중사육 온도는 11.
실험어의 어체 측정은 실험 시작 후 4주마다 측정을 하였으며, 측정 24시간 전에 절식시킨 후, 각 실험구에서 무작위로 12마리를 선발하여 실험어 전체 무게를 측정하여 증중량을 구하였고, 실험어의 전장은 각각의 개체의 전장을 확인한 후 평균을 측정하였다. 혈액분석 측정을 위한 채혈 방법으로는 채혈 24시간 전부터 절식을 시킨 후, 마취제를 사용하지 않고 각 실험구에서 무작위로 10마리를 선발한 후, 1 ml 주사기를 사용하여 넙치의 미부정맥에서 1 ml 채혈하였다.
어류 식세포 작용을 알아보기 위하여 Respiratory burst activity를 분석하였다(Anderson and Siwicki, 1994). 실험어의 미부에서 채취한 전혈을 1.
합성된 oligonucleotides의 각각의 primer는 7F (5′-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3′), 1492R (5′-GGA TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)로 사용하였다. 증폭된 PCR product는 Ethidium bromide (Sigma-Aldrich)가 첨가된 상태에서 전기영동하여 1% agarose (Promega Co., USA) gel에서 확인하였다.
실험어의 어체 측정은 실험 시작 후 4주마다 측정을 하였으며, 측정 24시간 전에 절식시킨 후, 각 실험구에서 무작위로 12마리를 선발하여 실험어 전체 무게를 측정하여 증중량을 구하였고, 실험어의 전장은 각각의 개체의 전장을 확인한 후 평균을 측정하였다. 혈액분석 측정을 위한 채혈 방법으로는 채혈 24시간 전부터 절식을 시킨 후, 마취제를 사용하지 않고 각 실험구에서 무작위로 10마리를 선발한 후, 1 ml 주사기를 사용하여 넙치의 미부정맥에서 1 ml 채혈하였다. 채취된 혈액은 4℃에서 2시간 보관 후에 4℃ 원심분리기를 이용하여 1,200×g, 10 min에서 혈청을 분리하였다.
분리된 혈청은 간수치 측정을 위해 실험에 사용하였으며, 남은 시료의 경우 -60℃에서 따로 보관하였다. 혈청 중의 성분에 대해서는 9가지 항목을 조사하였는데, Glutamic pyruvic transaminase (GPT), Glutamic oxalacetic transaminase (GOT), Total protein, Lactate Dehydrogenase (LDH), Glucose 그리고 Triglyceride (TG)의 성분 조사는 자동 혈액 분석 장치(Ch100 Plus, DaeKwang Meditech, Korea)를 이용하여 측정하였다.

대상 데이터

, Korea) 대량 배양된 분리균주 Bacillus sp. IS-2를 각각 첨가하여 10³, 10⁵, 10⁷CFU/kg의 실험 사료를 제작하였다. 대조구는 probiotics를 첨가하지 않은 일반 사료를 투여하였으며, 사료 투여는 1일 2회(오전 8시, 오후 5시) 넙치 체중의 2%씩 공급하였으며, 실험 사육은 총 12주 동안 수행하였다.
, Korea)에 Bacillus sp. IS-2를 첨가하여 10³, 10⁵, 10⁷CFU/kg의실험사료를 제작하였다. 2주간의 예비사육 후, 평균무게 210±13 g인 실험어를 1,000 L 원형수조에 실험구 당 70마리씩 무작위로 배치하여 실험사료를 1일 2회 어체 중의 2%씩 12주 동안 공급 하였다.
, Korea)에 Bacillus sp. IS-2를 첨가하여 10³, 10⁵, 10⁷CFU/kg의실험사료를 제작하였다. 2주간의 예비사육 후, 평균무게 210±13 g인 실험어를 1,000 L 원형수조에 실험구 당 70마리씩 무작위로 배치하여 실험사료를 1일 2회 어체 중의 2%씩 12주 동안 공급 하였다.
Streptococcus iniae (KCTC 3657)는 생명자원센터(Korean Collectionfor Type Culture, KCTC)에서 분양 받아 Brain Heart Infusion Agar (BHIA, Difco Co., USA)를사용하여 3반복 접종하여 37℃ 배양하였으며, 3×105CFU/ml의농도가 되도록 0.85% 멸균 생리식염수에 현탁 한 후, 공격 실험 용으로 사용하였다.
본 실험은 제주도 함덕리에 위치한 해양과환경연구소에서 수행하였고, 실험어로 사용된 넙치는 제주도 위미리에 위치한 (주) 금강수산에서 분양을 받았다. 실험 시작 전에 사용한 넙치는 실험 환경에 적응시키기 위해 약 2주일 동안 기초사료를 공급하여 순치시켰으며, 실험 시작 전 넙치의 평균 무게는 210±13g이었다.
합성된 oligonucleotides의 각각의 primer는 7F (5′-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3′), 1492R (5′-GGA TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)로 사용하였다.

데이터처리

결과 값은 평균값±표준편차(mean±SD)로 나타내었고 백분율 값은 arscine 변형값으로 계산하여 통계분석하였다.
해양연구소에서 사육한 넙치의 성장 및 분석 결과의 통계처 리는 SPSS (SPSS INC., Version 12.0) program을 이용하여 독립 검정을 실시하여 t-test (P<0.05)로 평균간의 유의성을 검정하 였다.

이론/모형

넙치의 라이소자임 측정을 위하여 Kumari와 Sahoo에 따라 분석하였다(Kurami and Sahoo, 2005). 라이소자임활성을 측정하기 위해 각각의 실험구미부에서 채혈한 혈액의 혈청 50 µl와 0.
실험어에서 채취한 혈액에서 분리된 백혈구를 이용하여 Seeley 의 방법에 따라 실시하였다(Seeley et al., 1990). Hitopaque 1.

성능/효과

5에 나타내었다. 10⁵CFU/kg의 농도로 조정된 S. iniae를 모든 실험이 종료된 시기에 접종하여 20일 동안 누적 폐사율을 확인 하였는데 5일째부터 모든 실험구와 대조구에서 폐사가 시작되어 10³CFU/kg 실험구에서는 73%의 폐사율을 10⁵CFU/kg 실험구에서는 53%의 폐사율을 나타냈으며, 10⁷CFU/kg 실험구에서는 45%의 폐사율을 보여 대조구에 비해 많게는 55% 이상의 높은 생존율을 나타내었다. White shrimp의 사료내 B.
본 실험 결과 Bacillus sp. IS-2 생균제를 첨가한 사료를 투여한 실험구가 대조구에 비해 더 높은 라이소자임 활성이 있는 것으로 나타났다(Fig. 3). 실험이 종료된 시점에서는 10⁵CFU/kg의 실험구에서 가장 높은 활성을 나타내었다.
본 실험의 결과를 통해 Bacillus sp. IS-2의 사료 내 첨가는 양식넙치의 성장 및 비특이적 면역반응을 증가시켜 S. iniae에 대한 질병저항성을 향상시켜 사료첨가제로 사용이 가능함을 보여 주었다. 또한 각기 다른 농도를 통하여 실험을 실시한 결과 10⁵CFU/kg 이상의 농도로 첨가하여 공급할 경우 양식넙치의 면역 반응과 질병저항성에 가장 좋은 효과를 나타낼 수 있음을 확인 하였다.
사료 내 첨가한 Bacillus sp. IS-2의 장내 생존 확인을 위해 실험이 종료 된 후 모든 실험구와 대조구 실험어의 장을 분리하여 배양 된 균체를 DNA를 분리 한 후에 제작 된 ditection primer를 이용한 PCR 결과 일반사료를 투여한 대조구를 제외한 모든 실험구에서 1,465 bp의 PCR product를 확인 할 수 있었다.
사료 내 첨가한 Bacillus sp. IS-2의 장내 생존 확인을 위해 실험이 종료된 후 모든 실험구와 대조구 실험어의 장을 분리하여 배양된 균체의 DNA를 분리 한 후에 제작된 Universal primer를 이용한 PCR 결과 일반사료를 투여한 대조구를 제외한 모든 실험구에서 1,465 bp의 PCR product를 확인 할 수 있었다.
Glucose의 경우 실험 종료 시점에서 증가되는 변화를 확인 할 수 있었는데 이는 수온, 수질에 의한 일시적인 현상이라 사료된다. Respiratory burst activity (NBT assay)에 있어서는 실험사료를 공급한 실험구가 대조구에 비해 높은 값을 확인할수 있었으며 특히 10⁵CFU/kg 실험구와 10⁷CFU/kg 실험구에서 유의적으로 높은 값을 확인하였다. 혈청의 라이소자임 및 백혈구 활성에 있어서도 실험사료를 투여한 실험구에서 대조구에 비해 높은 활성을 확인하였다.
Glucose의 경우 실험 종료 시점에서 증가되는 변화를 확인 할 수 있었는데 이는 수온, 수질에 의한 일시적인 현상이라 사료된다. Respiratory burst activity (NBT assay)에 있어서는 실험사료를 공급한 실험구가 대조구에 비해 높은 값을 확인할수 있었으며 특히 10⁵CFU/kg 실험구와 10⁷CFU/kg 실험구에서 유의적으로 높은 값을 확인하였다. 혈청의 라이소자임 및 백혈구 활성에 있어서도 실험사료를 투여한 실험구에서 대조구에 비해 높은 활성을 확인하였다.
일반사료를 투여한 대조구를 제외한 모든 실험구에서 1,465 bp의 PCR product를 확인할 수 있었다. Saccharomyses cerevisiae P13을 Grouper에 투여 후 본 연구와 같은 방법으로 장내 부착 균주를 확인해 본 결과 본 연구결과와 비슷한 결과를 확인 할 수 있었으며(Chiu et al., 2010), 이는 사료를 통해 섭취된 실험 균주가 위와 같은 소화기관을 통하여 무사히 장내에 도달하였음을 확인 할 수 있는 결과라 사료된다.
본 실험의 실험구와 대조구의 혈액학적 분석결과를 Table 1에 나타내었다. 간 독성을 나타내는 지표인 GPT 및 GOT, 단백질, 총콜레스터롤 함량은 실험구간에서 유의적인 차이를 나타 내지 않았으며, 이는 체내의 장내에 머무는 생균제에 의한 독성이나 어체 내 문제가 발생하지 않는 것으로 사료된다. 그러나 glucose의 경우 실험이 종료된 시점에서 증가되는 변화를 확인할 수 있었는데 이는 수질악화 및 수온의 변화와 같은 일시적인 스트레스 반응 때문이라 생각되어지며 이러한 glucose의 증가경향은 Pagrus major, Striped bass, Chinook salmon 등을 이용한 수온변화 연구를 통하여 보고되었다(Wardle, 1972).
혈청의 라이소자임 및 백혈구 활성에 있어서도 실험사료를 투여한 실험구에서 대조구에 비해 높은 활성을 확인하였다. 공격실험 결과, S. iniae를 접종한지 5일째부터 폐사가 시작되어 7일째 일반사료를 투여한 대조구에 서는 100% 폐사율을 보인 반면, 10³CFU/kg 실험구에서는 73%의 폐사율을 10⁵CFU/kg 실험구에서는 53%의 폐사율을 나타냈 으며, 10⁷CFU/kg 실험구에서는 45%의 폐사율을 보여 대조구에 비해 많게는 55% 이상의 높은 생존율을 나타내었다. 사료 내 첨가한 Bacillus sp.
혈청의 lysozyme 및 백혈구 활성에 있어서도 실험사료를 투여한 실험구에서 대조구에 비해 높은 활성을 확인 하였다. 공격실험 결과, Streptococcus inae를 접종한지 5일째부터 폐사가 시작되어 7일째 일반사료를 투여한 대조구에서는 100% 폐사율을 보인 반면, 10³CFU/kg 실험구에 서는 73%의 폐사율을 10⁵CFU/kg 실험구에서는 53%의 폐사율을 나타냈으며, 10⁷CFU/kg 실험구에서는 45%의 폐사율을 보여 대조구에 비해 많게는 55% 이상의 높은 생존율을 나타내었다. 사료 내 첨가한 Bacillus sp.
iniae에 대한 질병저항성을 향상시켜 사료첨가제로 사용이 가능함을 보여 주었다. 또한 각기 다른 농도를 통하여 실험을 실시한 결과 10⁵CFU/kg 이상의 농도로 첨가하여 공급할 경우 양식넙치의 면역 반응과 질병저항성에 가장 좋은 효과를 나타낼 수 있음을 확인 하였다. 앞으로 probiotics를 통한 양식어류의 생존능력과 면역 능력 향상 메커니즘에 대한 깊은 연구가 필요할 것으로 사료되며 이를 통해 고품질 배합사료 개발 및 양식생산성 향상에 크게 기여할 것으로 사료된다.
2주간의 예비사육 후, 평균무게 210±13 g인 실험어를 1,000 L 원형수조에 실험구 당 70마리씩 무작위로 배치하여 실험사료를 1일 2회 어체 중의 2%씩 12주 동안 공급 하였다. 성장도 조사 결과 모든 실험구에서는 일반사료를 투여한 대조구에 비해 높은 성장률을 나타내었으며 10⁵CFU/kg 실험구에서는 대조구에 비해 약 13% 정도 높은 성장률을 나타내었다. 혈액분석 결과에는 glucose를 제외한 GOT, GPT, 단백질, 총 콜레스테롤 등에서 실험구간 유의적인 차이를 나타내지 않고 생균제로 인한 간독성이나 어체 내 문제가 발생하지 않은 것으로 사료된다.
2주간의 예비사육 후, 평균무게 210±13 g인 실험어를 1,000 L 원형수조에 실험구 당 70마리씩 무작위로 배치하여 실험사료를 1일 2회 어체 중의 2%씩 12주 동안 공급 하였다. 성장도 조사 결과 모든 실험구에서는 일반사료를 투여한 대조구에 비해 높은 성장률을 나타내었으며 10⁵CFU/kg 실험구에서는 대조구에 비해 약 13% 정도 높은 성장률을 나타내었다. 혈액분석 결과에는 glucose를 제외한 GOT, GPT, 단백질, 총 콜레스테롤 등에서 실험구간 유의적인 차이를 나타내지 않고 생균제로 인한 간독성이나 어체 내 문제가 발생하지 않은 것으로 사료된다.
식세포 활성 측정 결과 실험 사료를 투여 한 이후 모든 실험구 에서는 대조구에 비해 높은 활성을 유지되었으며(Fig. 4) 특히 10⁵CFU/kg 그룹에서는 8주차 때부터 다른 농도의 실험구에 비해 비교적 높은 활성을 확인 할 수 있었다. 이와 같은 결과는 이상의 비특이적 면역 반응 실험 결과로부터 probiotics를 사료 내 첨가하여 투여하는 것이 어류의 질병저항성에 중요한 역할을 하는 식세포 활성이 증가되는 것으로 확인 되었으며, 10⁵CFU/kg 이상의 농도로 첨가하는 것이 식세포 활성 증강에 있어서 높은 활성을 나타내는 것을 확인하였다.
2에 나타내었다. 실험이 시작된 후부터 모든 실험구에서는 대조구보다 높은 값을 나타내었으며, 4주가 지나기 시작한 후부터는 10⁵CFU/kg 실험구와 10⁷CFU/kg에서 유의적으로 높은 값을 나타내었다. 이러한 결과는 대하, 무지개 송어, 터봇 및 유럽산 뱀장어에게 Bacullus sp.
3). 실험이 종료된 시점에서는 10⁵CFU/kg의 실험구에서 가장 높은 활성을 나타내었다. 이와 같은 결과는 Bacillus subtilis와 S.
4) 특히 10⁵CFU/kg 그룹에서는 8주차 때부터 다른 농도의 실험구에 비해 비교적 높은 활성을 확인 할 수 있었다. 이와 같은 결과는 이상의 비특이적 면역 반응 실험 결과로부터 probiotics를 사료 내 첨가하여 투여하는 것이 어류의 질병저항성에 중요한 역할을 하는 식세포 활성이 증가되는 것으로 확인 되었으며, 10⁵CFU/kg 이상의 농도로 첨가하는 것이 식세포 활성 증강에 있어서 높은 활성을 나타내는 것을 확인하였다.
6에 나타내었다. 일반사료를 투여한 대조구를 제외한 모든 실험구에서 1,465 bp의 PCR product를 확인할 수 있었다. Saccharomyses cerevisiae P13을 Grouper에 투여 후 본 연구와 같은 방법으로 장내 부착 균주를 확인해 본 결과 본 연구결과와 비슷한 결과를 확인 할 수 있었으며(Chiu et al.
IS-2를 첨가하지 않은 일반 사료를 급이한 넙치는 사육 8주 동안 비례적으로 성장하였다. 하지만 마지막 12주 성장 실험 후 최종 어체의 평균 무게를 측정한 결과 10⁵CFU/kg 첨가사료를 급이한 실험구에서 대조구에 비해 약 13% 정도 높은 성장률을 나타냈다. 이와 같은 결과는 Bacillus sp.
성장도 조사 결과 모든 실험구에서는 일반사료를 투여한 대조구에 비해 높은 성장률을 나타내었으며 10⁵CFU/kg 실험구에서는 대조구에 비해 약 13% 정도 높은 성장률을 나타내었다. 혈액분석 결과에는 glucose를 제외한 GOT, GPT, 단백질, 총 콜레스테롤 등에서 실험구간 유의적인 차이를 나타내지 않고 생균제로 인한 간독성이나 어체 내 문제가 발생하지 않은 것으로 사료된다. Glucose의 경우 실험 종료 시점에서 증가되는 변화를 확인 할 수 있었는데 이는 수온, 수질에 의한 일시적인 현상이라 사료된다.
성장도 조사 결과 모든 실험구에서는 일반사료를 투여한 대조구에 비해 높은 성장률을 나타내었으며 10⁵CFU/kg 실험구 에서는 대조구에 비해 약 13% 정도 높은 성장률을 나타내었다. 혈액분석 결과에는 glucose를 제외한 GOT, GPT, 단백질, 총콜 레스테롤 등에서 실험구간 유의적인 차이를 나타내지 않아 생균 제로 인한 간독성이나 어체 내 문제가 발생하지 않은 것으로 사료된다. Glucose인 경우 실험 종료 시점에서 증가되는 변화를 확인 할 수 있었는데 이는 수온, 수질에 의한 일시적인 현상이라 사료된다.
Respiratory burst activity (NBT assay)에 있어서는 실험사료를 공급한 실험구가 대조구에 비해 높은 값을 확인할 수 있었으며 특히 10⁵CFU/kg 실험구와 10⁷CFU/kg 실험구에서 유의적으로 높은 값을 확인하였다. 혈청의 lysozyme 및 백혈구 활성에 있어서도 실험사료를 투여한 실험구에서 대조구에 비해 높은 활성을 확인 하였다. 공격실험 결과, Streptococcus inae를 접종한지 5일째부터 폐사가 시작되어 7일째 일반사료를 투여한 대조구에서는 100% 폐사율을 보인 반면, 10³CFU/kg 실험구에 서는 73%의 폐사율을 10⁵CFU/kg 실험구에서는 53%의 폐사율을 나타냈으며, 10⁷CFU/kg 실험구에서는 45%의 폐사율을 보여 대조구에 비해 많게는 55% 이상의 높은 생존율을 나타내었다.
Respiratory burst activity (NBT assay)에 있어서는 실험사료를 공급한 실험구가 대조구에 비해 높은 값을 확인할수 있었으며 특히 10⁵CFU/kg 실험구와 10⁷CFU/kg 실험구에서 유의적으로 높은 값을 확인하였다. 혈청의 라이소자임 및 백혈구 활성에 있어서도 실험사료를 투여한 실험구에서 대조구에 비해 높은 활성을 확인하였다. 공격실험 결과, S.

후속연구

또한 각기 다른 농도를 통하여 실험을 실시한 결과 10⁵CFU/kg 이상의 농도로 첨가하여 공급할 경우 양식넙치의 면역 반응과 질병저항성에 가장 좋은 효과를 나타낼 수 있음을 확인 하였다. 앞으로 probiotics를 통한 양식어류의 생존능력과 면역 능력 향상 메커니즘에 대한 깊은 연구가 필요할 것으로 사료되며 이를 통해 고품질 배합사료 개발 및 양식생산성 향상에 크게 기여할 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	양식 어류의 질병예방 및 치료를 위한 가장 일반적인 방법은?	제주 양식넙치의 경우 폐사현황을 보면 2007년 3,869톤(생산량 2만825톤), 2008년 4,519톤(생산량 2만4천184톤), 2009년 4,427톤(생산량 2만6천 24톤), 2010년 5,601(생산량 2만2천139톤)으로 해마다 증가하고 있으며, 폐사로 인한 피해액은 2007년 320억원, 2008년 294억원, 2009년 376억원, 2010년 513억원으로 조사되었다(Statistics Korea, 2011). 양식 어류의 질병예방 및 치료를 위한 가장 일반적인 방법에는 항생제 투여 등의 화학적인 방법과 백신요법이 있는데 항생제 요법인 경우 오남용에 따른 내성균의 출현(Smith et al., 1994)과 체내잔류(Karunasagar et al.
	2007년~2010년의 제주 양식넙치의 폐사 현황은?	그러나 양식 어류의 생산량을 높이기 위한 양식장의 밀식과 열악한 사육수 등은 양식 어류의 항병력을 약화시켜 어류질병이 빈번히 나타나 경제적 손실이 높아지고 있다(Ministry for Food, Agriculture, Forestry and Fisheries, 2003). 제주 양식넙치의 경우 폐사현황을 보면 2007년 3,869톤(생산량 2만825톤), 2008년 4,519톤(생산량 2만4천184톤), 2009년 4,427톤(생산량 2만6천 24톤), 2010년 5,601(생산량 2만2천139톤)으로 해마다 증가하고 있으며, 폐사로 인한 피해액은 2007년 320억원, 2008년 294억원, 2009년 376억원, 2010년 513억원으로 조사되었다(Statistics Korea, 2011). 양식 어류의 질병예방 및 치료를 위한 가장 일반적인 방법에는 항생제 투여 등의 화학적인 방법과 백신요법이 있는데 항생제 요법인 경우 오남용에 따른 내성균의 출현(Smith et al.
	양식 어류의 질병예방 및 치료방법 중 하나인 백신요법의 한계점은?	, 1994) 등 사회적, 생태적으로 심각한 문제를 유발하고 있어 그 사용이 규제되고 있는 실정이다. 백신요법의 경우 양식어류는 군집을 대상으로 투여하고 주로 면역력이 약한 자치어를 대상으로 하기 때문에 백신투여가 매우 번거롭고 많은 인력이 필요한 실정이다. 또한 세균성 질병의 복합적인 감염에 따른 효과적인 백신의 개발이 없어 어병 예방과 치료를 위한 대책으로서는 한계에 와 있다고 할 수 있다. 따라서 기존의 문제점에 대한 대책으로 천연 자원인 미생물 자원을 이용한 probiotics를 양어 사료에 첨가한 친환경적인 요법에 관심과 연구가 최근 많아지고 있다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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