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문제 정의
- tannophilus ATCC 32691와 동일한 효모임을 확인할 수 있었다. 그래서, 본 연구에서는 이 효모를 이용하여 glycerol로 부터 ethanol을 생산하는 연구를 수행하였다.
제안 방법
- 6가지의 효모를 사용하여 glycerol로부터 ethanol을 생산할 수 있는 효모를 선별하였다. Fig.
- Fig. 3의 결과에서 얻은 최적 surface aeration 조건을 바탕으로 glycerol을 중간에 첨가하는 fed-batch 배양을 실시하여 보았다. Fig.
- 3의 결과에서 얻은 최적 surface aeration 조건을 바탕으로 glycerol을 중간에 첨가하는 fed-batch 배양을 실시하여 보았다. Fig. 5와 같이 약 20 g/l의 glycerol이 들어 있는 배지를 이용하여 배양을 시작한 후, 3회에 걸쳐 glycerol이 들어있는 배지를 첨가하였다. 배양 시작 후, 90시간에 이르러 ethanol이 최고 5.
- Shaking flask cultures for selecting a yeast capable of ethanol production from glycerol. Measurements of glycerol and ethanol were performed three times using the same sample, and the average and standard deviation were calculated.
- P. tannophilus ATCC 32691의 Table 2 결과를 바탕으로 surface aeration을 이용하여 미량의 공기를 공급할 수 있는 발효조(Fig. 1)에서 glycerol로부터 ethanol을 생산하는 최적조건을 탐색하였다(Fig. 3). 본 연구에서는 surface aeration rate을 500 ml/min으로 고정하고, 발효조의 agitation speed를 200에서 400 rpm까지 변화시키면서 약 20 g/l의 glycerol로 부터 ethanol 생산을 관찰하였다.
- P. tannophilus ATCC 32691의 seed culture를 300 ml 삼각 flask에 80 ml의 YPD 배지를 사용하여 shaking incubator에서 기른 후(30℃, 150 rpm), 800 ml YPG 배지가 들어있는 2.5 l-jar fermentor (Korea Fermentor)에 접종하였다. 이때, 공기는 Fig.
- 먼저 Maleszka 등[13]의 보고에 효모 Candida가 배양 중에 일시적으로 ethanol을 생산 한다는 연구 결과를 소개하였기에, 이를 바탕으로 Candida와 유사한 생리적 특성을 지니고 있고, xy-lose와 같은 5탄당을 이용 할 수 있는 효모를 국내기탁기관에서 수집하였고(Table1), 본 연구팀의 선행연구에 사용하였던 xylose 이용 효모도 포함시켰다[11, 19, 20]. Table 1과 같은 6가지 효모 중에서 glycerol로 부터 ethanol을 생산할 수 있는 효모를 선별하고, 이를 이용하여 glycerol로 부터 ethanol을 발효조에서 생산하는 방법을 조사하였다. 이때, 적은양의 공기를 공급하기 위하여 surface aeration 방법을 사용하였고, surface aeration 방법은 xylose와 같은 5탄당 탄소원을 효모가 이용할 때, 본 연구팀에서 사용한 미량 공기 공급방법으로 사용한 방법이다[11, 19, 20].
- 3). 본 연구에서는 surface aeration rate을 500 ml/min으로 고정하고, 발효조의 agitation speed를 200에서 400 rpm까지 변화시키면서 약 20 g/l의 glycerol로 부터 ethanol 생산을 관찰하였다. Fig.
- tannophilus ATCC 32691를 이용하여 glycerol로 부터 ethanol을 생산할 수 있었다. 이 때 미량의 공기공급이 중요하다는 것을 확인하였고, 이를 위하여 surface-aerated fermentor를 사용하여 YPG 배지의 glycerol로 부터 ethanol을 생산하는 조건을 조사하였다. 최적 ethanol 생산 조건은 880 ml의 배양액에 500 ml/min의 공기를 surface aeration 방법으로 공급하면서, 300 rpm의 agitation speed로 운전할 경우였으며, 이 조건을 이용하여 fed-batch 배양을 실시한 결과 배양시작 후, 90시간에 이르러 ethanol이 최고 5.
- tannophilus를 이용하여 ethanol을 생산 할 경우에 공기의 공급이 매우 중요하기 때문에, 먼저 공기의 공급이 ethanol 생산에 어떠한 영향을 미치는지에 대하여 확인하기 위하여, shaking incubator에서 glycerol이 약 20 g/l 포함된 배지를 사용하여 ethanol 생산 실험을 실시하였다(Table 2). 이때 효모 P. tannophilus ATCC 32691를 사용하였으며, 4개 flask culture의 shaking speed를 50, 100, 150, 200 rpm까지 변화시키면서 세포성장, glycerol 소비, ethanol 생산을 관찰하였다. Shaking speed를 50, 100, 150 rpm까지 증가시켰을 때, 세포성장은 shaking speed 증가에 따라서 더 증가하였고, glycerol의 소비도 더 잘 일어났으며, 48시간 지난 후의 최종 ethanol의 생산도 shaking speed 증가에 따라서 1.
- 5 l-jar fermentor (Korea Fermentor)에 접종하였다. 이때, 공기는 Fig. 1과 같은 surface aeration 방법을 이용하여 공급하였고, 배양온도는 30℃, pH는 20% 인산과 암모니아수를 이용하여 5.0으로 조절하였다. 기본적으로 500 ml/min의 공기를 surface aeration 방법으로 공급하였고, agitation speed는 200-400 rpm 범위에서 변화를 주었다.
- 이미 언급하였듯이 효모 P. tannophilus를 이용하여 ethanol을 생산 할 경우에 공기의 공급이 매우 중요하기 때문에, 먼저 공기의 공급이 ethanol 생산에 어떠한 영향을 미치는지에 대하여 확인하기 위하여, shaking incubator에서 glycerol이 약 20 g/l 포함된 배지를 사용하여 ethanol 생산 실험을 실시하였다(Table 2). 이때 효모 P.
- 이때, 적은양의 공기를 공급하기 위하여 surface aeration 방법을 사용하였고, surface aeration 방법은 xylose와 같은 5탄당 탄소원을 효모가 이용할 때, 본 연구팀에서 사용한 미량 공기 공급방법으로 사용한 방법이다[11, 19, 20]. 최종적으로 glycerol이 포함된 배지를 이용하여 fed-batch 배양을 실시하여, surface aeration 방법을 통한 공기 공급으로 ethanol 생산이 가능한지를 확인하였다.
- 한편, 본 연구에 사용할 glycerol로 부터 ethanol을 생성하는 효모를 선별하기 위하여, 몇 가지 효모를 수집하였다. 먼저 Maleszka 등[13]의 보고에 효모 Candida가 배양 중에 일시적으로 ethanol을 생산 한다는 연구 결과를 소개하였기에, 이를 바탕으로 Candida와 유사한 생리적 특성을 지니고 있고, xy-lose와 같은 5탄당을 이용 할 수 있는 효모를 국내기탁기관에서 수집하였고(Table1), 본 연구팀의 선행연구에 사용하였던 xylose 이용 효모도 포함시켰다[11, 19, 20].
대상 데이터
- Table 1과 같이 국내 기탁기관(한국생명공학연구원 미생물자원센터, 한국미생물보존센터)에서 구할 수 있는 효모를 본 실험에 사용하였다. Glycerol은 Bio Basic Canada Inc. (Markham, ON, Canada)에서 yeast extract와 peptone은 Becton Dickinson (Sparks, MD, USA)에서 구입하였으며, glycerol 분석용 시약인 sodium periodate, ammonium acetate는 Junsei Chemical Co. (Tokyo, Japan)와 Samchun Chemical Co. (Seoul, Republic of Korea)에서, acetic acid와 acetyl acetone은 Daejung Chemical Co. (Gyeonggi-Do, Republic of Korea)에서 구입하여 사용하였다.
- Seed culture는 300 ml 삼각 flask에 50 ml의 YPD (1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose) 배지를 준비한 후, shaking incubator에서 실시하였다. Glycerol이 들어간 배지를 사용하는 본 배양은 300 ml 삼각 flask에 20 ml의 YPG (1% yeast extract, 2% peptone, 2% glycerol) 배지에 실시하였는데, 10%의 seed culture를 접종하여 shaking incubator에서 배양을 시작하였다. 배양할 때, 온도는 30℃로 조절하였다.
- P. tannophilus ATCC 32691를 이용하여 glycerol로 부터 ethanol을 생산할 수 있었다. 이 때 미량의 공기공급이 중요하다는 것을 확인하였고, 이를 위하여 surface-aerated fermentor를 사용하여 YPG 배지의 glycerol로 부터 ethanol을 생산하는 조건을 조사하였다.
- Table 1과 같이 국내 기탁기관(한국생명공학연구원 미생물자원센터, 한국미생물보존센터)에서 구할 수 있는 효모를 본 실험에 사용하였다. Glycerol은 Bio Basic Canada Inc.
이론/모형
- 그리고 ethanol은 gas chromatography를 이용하여 정량분석 하였고, 자세한 조건은 선행연구에 설명하였다[20]. 산소전달계수(oxygen transfer coefficient, kLa)는 unsteady-state method를 이용하여 측정하였다[17].
- 효모의 성장은 spectrophotometer를 이용하여 optical density를 600 nm (OD600)에서 측정하여 모니터링 하였고, glycerol은 chemical assay 방법을 이용하여 정량하였다[4]. 그리고 ethanol은 gas chromatography를 이용하여 정량분석 하였고, 자세한 조건은 선행연구에 설명하였다[20].
성능/효과
- 6가지의 효모를 사용하여 glycerol로부터 ethanol을 생산할 수 있는 효모를 선별하였다. Fig. 2와 같이 6가지 효모에 대하여 glycerol이 약 20 g/l 포함된 배지에서 ethanol 생산을 확인한 결과 P. tannophilus ATCC 32691에서 glycerol을 소비하면서 가장 많은 양의 ethanol인 약 3.5 g/l를 생산 할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 반면에 다른 효모에서는 Maleszka 등[13]의 보고와 같이 아주 적은 양의 ethanol이 일시적으로 생산되는 것을 볼 수 있었다.
- tannophilus ATCC 32691를 사용하였으며, 4개 flask culture의 shaking speed를 50, 100, 150, 200 rpm까지 변화시키면서 세포성장, glycerol 소비, ethanol 생산을 관찰하였다. Shaking speed를 50, 100, 150 rpm까지 증가시켰을 때, 세포성장은 shaking speed 증가에 따라서 더 증가하였고, glycerol의 소비도 더 잘 일어났으며, 48시간 지난 후의 최종 ethanol의 생산도 shaking speed 증가에 따라서 1.16, 2.81, 3.47 g/l로 증가함을 관찰할 수 있었다. 그러나 200 rpm으로 shaking speed를 증가시켜 배양하였을 경우에는 세포성장은 50, 100, 150 rpm에 비하여, 보다 더 증가하였고, glycerol 소비도 더 촉진 되었음에도 불구하고, ethanol의 생산은 1.
- 166 이었다. 그러나, 두 번째 glycerol이 들어 있는 배지 첨가 후 부터는 세포성장, glycerol 소비, ethanol 생산이 감소되는 현상이 관찰되었고, 결국에는 glycerol만 천천히 소비되고, 세포성장과 ethanol 생산은 거의 중지되었다. 이러한 fed-batch 배양을 통하여 완전하지 않았지만, ethanol 생산을 좀 더 연장하여 생산 할 수 있는 가능성을 확인하였다.
- tannophilus CBS 4044의 glycerol로 부터 ethanol 생산을 보고하였다. 그런데, 국내기탁기관의 자료로부터 P. tannophilus NRRL Y-2640과 P. tannophilus CBS 4044를 확인하여 본 결과 이 두 효모는 Fig. 2에서 가장 ethanol을 많이 생산하는 효모인 P. tannophilus ATCC 32691와 동일한 효모임을 확인할 수 있었다. 그래서, 본 연구에서는 이 효모를 이용하여 glycerol로 부터 ethanol을 생산하는 연구를 수행하였다.
- 3C). 이 결과로 보아서 surface aeration을 이용하여 발효조에서 glycerol로부터 ethanol을 생산할 경우에 공기를 500 ml/min으로 공급하면서 agitation speed를 300 rpm으로 조절하는 조건에서 가장 많은 양의 ethanol이 생산될 수 있음을 확인할 수 있었다.
- 그러나, 두 번째 glycerol이 들어 있는 배지 첨가 후 부터는 세포성장, glycerol 소비, ethanol 생산이 감소되는 현상이 관찰되었고, 결국에는 glycerol만 천천히 소비되고, 세포성장과 ethanol 생산은 거의 중지되었다. 이러한 fed-batch 배양을 통하여 완전하지 않았지만, ethanol 생산을 좀 더 연장하여 생산 할 수 있는 가능성을 확인하였다. Ethanol 생산을 위하여 YPG 배지를 사용하였기 때문에 배지에 대한 재설계를 통하여 fed-batch 배양 후반부의 문제점을 해결할 수 있을 것으로 생각되어진다.
- 55 g/l로 급격히 감소하였다. 이러한 결과에서 우리는 P. tannophilus ATCC 32691를 이용하여 glycerol로부터 ethanol을 생산할 경우에 공기의 공급이 매우 중요한 요소이며, 적절한 양의 공기 공급 조건을 선택하여야만 glycerol로부터 보다 효율적으로 ethanol을 생산할 수 있다는 결론을 내릴 수 있었다.
- 4에서의 수율값 변화를 분석하여 보면, agitation speed가 400 rpm에서 ethanol 생산이 감소하는 현상(Ye/g의 감소)은 Ye/x 값의 상대적으로 감소가 원인인 것으로 추론되며, agitation speed가 낮은 조건인 200 rpm에서 Ye/g의 감소는 Yx/g 값 감소로부터 기인된다고 생각되어진다. 종합하면, 300 rpm에서 ethanol이 많이 생산된 것(상대적으로 가장 큰 Ye/g값=약 0.15)은 상대적으로 Ye/x와 Yx/g 값이 200, 250, 400 rpm에서 보다 크게 감소하지 않았기 때문인 것으로 생각되어진다.
후속연구
- 그러나, 본 연구에서는 YPG 배지를 사용하였고, Liu 등[12]은 yeast nitrogen base w/o amino acids가 포함된 defined medium을 사용하였으며, 또한 공기공급 방법도 본 연구와 상이하기 때문에 Ye/g 값을 직접 비교하기는 어렵다고 생각된다. 그래서 본 연구에서 사용한 배지를 기반으로 ethanol 생산 수율값(Ye/g) 증가를 위한 후속 연구가 추가로 필요하다고 생각되어진다. 한편, 본 연구를 통하여 얻은 ethanol 생산을 위한 최적조건에서의 산소전달계수 값은 대량생산을 위한 scale-up 지표로 사용될 수 있을 것으로 생각된다.
- 그래서 본 연구에서 사용한 배지를 기반으로 ethanol 생산 수율값(Ye/g) 증가를 위한 후속 연구가 추가로 필요하다고 생각되어진다. 한편, 본 연구를 통하여 얻은 ethanol 생산을 위한 최적조건에서의 산소전달계수 값은 대량생산을 위한 scale-up 지표로 사용될 수 있을 것으로 생각된다.
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