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문제 정의
- 따라서 오레가노 추출물은 인간 모우듀 세포의 증식을 억제하지 않는 것을 알 수 있었다. 많은 전의 연구에서 식물 추출물들의 세포증식 및 세포독성에 대한 영향을 보고하였다. 만형자 추출물을 0.
- 본 연구에서는 오레가노 추출물을 인간 모유두 세포에 처리하여 세포증식 효과가 있는지 검증하고, 항산화 효능을 평가하였으며, 또한 C57BL/6 마우스에 처리하여 모발성장 촉진효과가 있는지 연구하였으며, 마우스 피부에서의 IFG-1의 발현 증가 유무를 분석하였다. 오레가노 추출물을 인간 모우듀 세포에 0.
제안 방법
- C57BL/6 마우스를 통한 모발 성장 촉진효과 실험 − 오레가노 추출물을 이용하여 모발 생장 효과를 실험하였다.
- Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) − 마우스 피부조직에서 IGF-1의 발현량을 측정하기 위해서 totla RNA는 trizol (Invitrogen, Grand Island, NY, USA)을 사용하면서 마우스의 피부조직으로부터 분리 하였다.
- 따라서 이러한 오레가노 에탄올 추출물을 이용하여 in vivo 실험으로써 C57BL/6 마우스에 3주 동안 도포하여 모발성장 촉진 효과를 관찰하였다. 동시에 양성대조군으로 미녹시딜을 사용하여 그 효능을 비교하였다. 또한 오레가노 에탄올 추출물의 insulin-like growth factor-1 (IGF-1)의 발현량에 대한 영향을 reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) 분석을 통해 관찰하였다.
- 5배 이상의 세포 증식률을 나타내는 것을 확인하였다. 따라서 이러한 오레가노 에탄올 추출물을 이용하여 in vivo 실험으로써 C57BL/6 마우스에 3주 동안 도포하여 모발성장 촉진 효과를 관찰하였다. 동시에 양성대조군으로 미녹시딜을 사용하여 그 효능을 비교하였다.
- 동시에 양성대조군으로 미녹시딜을 사용하여 그 효능을 비교하였다. 또한 오레가노 에탄올 추출물의 insulin-like growth factor-1 (IGF-1)의 발현량에 대한 영향을 reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) 분석을 통해 관찰하였다.
- C57BL/6 마우스를 통한 모발 성장 촉진효과 실험 − 오레가노 추출물을 이용하여 모발 생장 효과를 실험하였다. 발모 촉진 효능을 평가하기 위해, 마우스의 등쪽 피부 색이 pink color를 보이는 휴지기 체모의 6주령을 사용하여 animal clipper (Panasonic ER1431p, Japan)를 이용하여 마우스 등판의 털을 깎아내고, 제모크림 비트(veet, Reckitt Benckiser, France)로 나머지 털 제거하였다. 상처 부위가 치유될 때까지 3일 안정화 후 3주 동안 붓을 사용하여 100 µL (5 mg/ mL) 의 시료를 도포하였으며, 양성 대조군으로는 minoxidile을 동량 사용하였다.
- 상처 부위가 치유될 때까지 3일 안정화 후 3주 동안 붓을 사용하여 100 µL (5 mg/ mL) 의 시료를 도포하였으며, 양성 대조군으로는 minoxidile을 동량 사용하였다.
- 실험 시작부터 종료까지 3주 동안 털이 자란 상태를 육안 적으로 관찰하기 위해 실험기간 동안 주 1회 에테르로 가볍게 마취한 후 디지털 카메라로 사진 촬영하였다. 평가방법은 Hyung et al.
- 동물 사육실은 온도 23±3℃ 상대습도 50±10%, 12시간씩 밤낮을 유지하였다. 실험동물은 clean rack에서 사육하였고 실험동물용 사료를 자유로이 급여하고 cage는 매 3일마다 교체하였다. 총 20 마리를 실험하였으며, 총 4개 군으로 나누어서 사육하였다.
- 상처 부위가 치유될 때까지 3일 안정화 후 3주 동안 붓을 사용하여 100 µL (5 mg/ mL) 의 시료를 도포하였으며, 양성 대조군으로는 minoxidile을 동량 사용하였다. 양성 대조군과 실험군의 시료 도포양은 임상에서의 minoxidile사용량을 기준으로 마우스에서 예비 실험을 통해 농도를 설정하였다.
- 오레가노 추출물의 세포증식 효과 − 오레가노 추출물의 인간 모유두 세포에 대한 세포증식 효과를 SRB assay로 염색하여 측정하였다.
- 0×10-4M, ethanol)를 가하고 10초간 혼합한 후, 실온에서 30분간 반응하고 517 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 음성대조군은 시료대신 에탄올을 동량 첨가하여 실험하였고, 양성대조군으로는 합성항산화제인 butylated hydroxyanisole (BHA)을 이용하여 동일한 방법으로 실시하였으며, DPPH radical을 50% 소거시키는 시료의 농도를 IC50으로 하였다.
- 원심분리기 15,000 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리 후 그 상등액을 isopropyl alcohol 500 µL 첨가한 다음 15,000 rpm, 4℃, 15분간 원심분리 후상층액은 제거하고 70% 에탄올 1 mL을 첨가하여 RNA pellet을 세척하고 15,000 rpm, 4℃, 2분간 원심분리하여 나온 상층액은 제거하고 남은 RNA pellet을 실온에서 건조 후 diethylpyrocarbonate (DEPC)로 희석하여 260 nm에서 OD값을 측정하여 RNA를 정량하였다. 정제된 RNA는 diethylpyrocarbonate로 처리된 물에 용해시킨 후 agaroseformaldehyde electrophoresis에 의해 그것의 순도를 확인하였다. cDNA는 RNA가 없는 DNA 1 µg은 oligodT 18 mer (bioneer, Daejeon, South Korea), RNAse OUT (Invitrogen, Grand Island, NY, USA), omniscript RT kit (Qiagene, Hilden, Germany), primer와 함께 37에서 60분간 반응시켰다.
대상 데이터
- Tissue culture plates는 Falcon (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)에서 구입하여 사용하였다. Mesenchymal stem cell (MSC) medium은 ScienCell사(Science cell, Carlsbad, USA) 제품을 사용하였다. Sulforhodamine B (SRB)와 dimethyl sulfoxide (DMEM), minoxidil, 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH), butylated hydroxyanisole (BHA)는 Sigma-Aldrich (St.
- Mesenchymal stem cell (MSC) medium은 ScienCell사(Science cell, Carlsbad, USA) 제품을 사용하였다. Sulforhodamine B (SRB)와 dimethyl sulfoxide (DMEM), minoxidil, 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH), butylated hydroxyanisole (BHA)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)에서 구입하여 사용하였다. Trizol은 Invitrogen사(USA)의 제품을 사용하였고, cDNA synthesis 및 PCR kit와 GAPDH, IGF-1의 primer는 BioNEER사(Korea)의 제품을 사용하였다.
- 시약 및 기기 − Antibiotic-antimycotic solution, fetal bovine serum (FBS), trypsin-EDTA는 Gibco BRL (Grand Island, NY)에서 구입하여 사용하였다. Tissue culture plates는 Falcon (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)에서 구입하여 사용하였다. Mesenchymal stem cell (MSC) medium은 ScienCell사(Science cell, Carlsbad, USA) 제품을 사용하였다.
- Louis, MO)에서 구입하여 사용하였다. Trizol은 Invitrogen사(USA)의 제품을 사용하였고, cDNA synthesis 및 PCR kit와 GAPDH, IGF-1의 primer는 BioNEER사(Korea)의 제품을 사용하였다. 실험기기는 homogenizer (IKA, T25 basic, Malaysia), PCR machine (Bio-RAD, MycyclerTM thermal cycler, USA), mini centrifuge (Hitachi, MIKRO 200R, Germany), microscope (Carl Zeiss, Axiovert 200, Germany)를 사용하였다.
- 세포주 및 세포배양 − 인간 모유두 세포[Human hair dermal papilla cell, (HHDPC)]는 (주)영사이언스로부터 구입하여 사용하였으며, 5% FBS, 1% 항생제(antibiotics)를 함유하는 MSC 배지, 37℃, 5% CO2의 배양기에서 배양하였으며, 3일 간격으로 계대배양 하였다.
- 시약 및 기기 − Antibiotic-antimycotic solution, fetal bovine serum (FBS), trypsin-EDTA는 Gibco BRL (Grand Island, NY)에서 구입하여 사용하였다.
- Trizol은 Invitrogen사(USA)의 제품을 사용하였고, cDNA synthesis 및 PCR kit와 GAPDH, IGF-1의 primer는 BioNEER사(Korea)의 제품을 사용하였다. 실험기기는 homogenizer (IKA, T25 basic, Malaysia), PCR machine (Bio-RAD, MycyclerTM thermal cycler, USA), mini centrifuge (Hitachi, MIKRO 200R, Germany), microscope (Carl Zeiss, Axiovert 200, Germany)를 사용하였다.
- 실험동물 − 생후 6주 된 수컷 C57BL/6 마우스를 (주)중앙실험동물로 부터 구입하여 1주간 동물 사육실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
- 오레가노 추출물 제조 − 상수허브랜드(Sangsoo Herb Land, Chungbuk, Korea)로부터 구입한 오레가노 100 g을 600 mL의 에탄올과 혼합하여 실온에서 2일간 정치시킨 후 여과자(Whatman No. 2)로 여과하여 회전 농축기로 40℃에서 농축하였다.
- 실험동물은 clean rack에서 사육하였고 실험동물용 사료를 자유로이 급여하고 cage는 매 3일마다 교체하였다. 총 20 마리를 실험하였으며, 총 4개 군으로 나누어서 사육하였다.
- 털의 제모시 실험동물은 염산케타민(Yuhan, Seoul, Korea)과 rompun (BayerKorea, Seoul, Korea) 혼합액을 복강주사 하여 마취시켰으며 제모 과정 동안의 마취 상태 유지를 위하여 isoflurane (hanapharm, Seoul, Korea)을 이용하여 흡입 마취하였다. Depilation시약은 rosin-wax 혼합물을 사용하였고, 흡입마취기는 anesthesia machine V70100 (Surgivet, USA)을 사용하였다.
데이터처리
- 통계값은 유의 수준 p<0.05 에서 ANOVA분석을 사용하였다.
이론/모형
- 평가방법은 Hyung et al. (2007)에 의해 보고된 방법에 의해 평가하였으며, 방법은 각 군의 모발성장 효과는 scoring system에 의해 각 각의 동물을 육안적으로 판정하여 평균치를 산정하였으며 판정기준은 발모정도에 따라 0-19% (−), 20-39% (±), 40-59% (+), 60-79% (++), 80-100% (+++)로 평가하였다.
- 항산화 효과 측정 − 항산화 효과는 전의 보고된 방법인 DPPH에 의해 평가하였다.
성능/효과
- hirtum)는 상떡잎식물과 (Lamiaceae)에 속하는 아로마 식물로써 아시아, 유럽, 북아프리카 등에서 자란다.5) 전통 의약으로써 오레가노는 호흡기 질환, 통증, 류마티스 관절염 등에 널리 상용되어졌다.5) 전의 연구에서 오레가노 에센셜 오일은 식품 보존로써 사용되어 졌다고 보고하였다.
- IGF-1 발현에 대한 영향 − 마우스 피부조직에서 IGF-1의 발현에 대한 오레가노 추출물의 영향을 RT-PCR을 통해 분석한 결과 음성대조군은 정상군에 비해 유의적인 차이를 나타내지 않았다(Fig. 2).
- 그 결과, 양성 대조군인 10 µM minoxidil의 처리시에는 세포독성을 나타내지 않았다(Fig. 1).
- 1 µg/mL, 1 µg/mL의 농도로 처리시 100% 이상의 세포증식을 나타내었으며 오레가노 추출물 10 µg/mL 농도로 처리시에는 약 110%의 세포증식을 나타내었다. 따라서 오레가노 추출물은 인간 모우듀 세포의 증식을 억제하지 않는 것을 알 수 있었다. 많은 전의 연구에서 식물 추출물들의 세포증식 및 세포독성에 대한 영향을 보고하였다.
- 오레가노 추출물 100 µL (5 mg/mL)을 C57BL/6 마우스에 3주 동안 도포한 후 모발성장 촉진효과를 관찰한 결과 minoxidil에 비해 더 높은 모발성장 촉진효과를 나타내었다. 또한 모낭상피세포 및 모발 성장에 관여하는 IFG-1의 발현량에 대한 오레가노 추출물의 영향을 살펴 본 결과 오레가노 추출물은 양성 대조군에 비해 유의적으로 IFG-1의 발현량을 증가시켰다(p<0.05). 따라서 본 연구결과를 통해 오레가노 추출물은 모발성장 촉진제로써의 이용 가능성이 있을 것으로 사료된다.
- 또한 실험군인 오레가노 추출물 처리군의 경우 양성대조군에 비해서 유의적으로 IFG-1의 발현이 증가함을 알 수 있었다(p<0.05, Fig. 2).
- 또한 오레가노 추출물을 0.001 µg/mL, 0.01 µg/mL, 0.1 µg/mL, 1 µg/mL, 10 µg/mL 농도로 처리한 후 24시간 배양한 결과 0.001 µg/mL, 0.01 µg/mL, 0.1 µg/mL, 1 µg/mL의 농도로 처리시 100% 이상의 세포증식을 나타내었으며 오레가노 추출물 10 µg/mL 농도로 처리시에는 약 110%의 세포증식을 나타내었다.
- 본 연구에서는 예비실험을 통하여, 인간 모유듀 세포에 대하여 다양한 종류의 한약재 추출물을 추출하여 세포 증식률을 살펴본 결과, 오레가노 에탄올 추출물이 다른 한약재 추출물에 비하여 평균 1.5배 이상의 세포 증식률을 나타내는 것을 확인하였다. 따라서 이러한 오레가노 에탄올 추출물을 이용하여 in vivo 실험으로써 C57BL/6 마우스에 3주 동안 도포하여 모발성장 촉진 효과를 관찰하였다.
- 1 µg/mL, 1 µg/ mL, 10 µg/mL 농도로 처리한 후 24시간 배양한 결과 세포독성을 나타내지 않으면서 세포 성장을 하였고, 31 µg/mL의 IC50을 가지면서 항산화효과를 나타내었다. 오레가노 추출물 100 µL (5 mg/mL)을 C57BL/6 마우스에 3주 동안 도포한 후 모발성장 촉진효과를 관찰한 결과 minoxidil에 비해 더 높은 모발성장 촉진효과를 나타내었다. 또한 모낭상피세포 및 모발 성장에 관여하는 IFG-1의 발현량에 대한 오레가노 추출물의 영향을 살펴 본 결과 오레가노 추출물은 양성 대조군에 비해 유의적으로 IFG-1의 발현량을 증가시켰다(p<0.
- 오레가노 추출물의 항산화 효과 − 오레가노 에탄올 추출물의 항산화능을 DPPH방법에 의해 측정한 결과 31 µg/mL의 IC50과 함께 항산화능을 나타내었고, 양성대조군인 BHA는 56 µg/mL의 IC50을 나타내었다(Table I).
- 3에 나타내었다. 정상군과 음성대조군에서 모발성장이 3주 후에 약하게 관찰되었고, 양성대조군인 미녹시딜 처리군에서는 60%의 모발성장이 관찰되었다. 그러나 실험군인 오레가노 추출물 처리군에서는 90% 이상의 정상적인 모발성장이 관찰되었다(Table II and Fig.
후속연구
- 05). 따라서 본 연구결과를 통해 오레가노 추출물은 모발성장 촉진제로써의 이용 가능성이 있을 것으로 사료된다.
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