산업공단지역의 폐수에서 분리한 유기용매 내성 Pseudomonas sp. BCNU 154 리파아제의 최적조건은 $37^{\circ}C$, pH8로 조사되었다. BCNU 154의 crude 리파아제는 toluene에서 2시간 반응시 효소활성 약 6.01 U/ml (117.53%)로 가장 안정한 것으로 나타났다. 한편 $Ca^{2+}$, $Mg^{2+}$, $NH_4{^+}$, $Na^+$ 이온 및 triton X-100은 효소를 활성화시킨 반면에 $Ba^{2+}$, $Hg^{2+}$ 및 $Zn^{2+}$ 이온은 효소활성을 억제하였다. Pseudomonas sp. BCNU 154 리파아제는 상용 고정화 효소인 Novozym 435와 비교해서도 안정한 활성을 보였다. 그러므로 유기용매 내성 리파아제는 별도의 고정화 처리없이도 화학산업공정에서 가능성 있는 whole cell 생물촉매로서 유용할 것으로 판단된다.
산업공단지역의 폐수에서 분리한 유기용매 내성 Pseudomonas sp. BCNU 154 리파아제의 최적조건은 $37^{\circ}C$, pH8로 조사되었다. BCNU 154의 crude 리파아제는 toluene에서 2시간 반응시 효소활성 약 6.01 U/ml (117.53%)로 가장 안정한 것으로 나타났다. 한편 $Ca^{2+}$, $Mg^{2+}$, $NH_4{^+}$, $Na^+$ 이온 및 triton X-100은 효소를 활성화시킨 반면에 $Ba^{2+}$, $Hg^{2+}$ 및 $Zn^{2+}$ 이온은 효소활성을 억제하였다. Pseudomonas sp. BCNU 154 리파아제는 상용 고정화 효소인 Novozym 435와 비교해서도 안정한 활성을 보였다. 그러므로 유기용매 내성 리파아제는 별도의 고정화 처리없이도 화학산업공정에서 가능성 있는 whole cell 생물촉매로서 유용할 것으로 판단된다.
An organic solvent-tolerant lipase of Pseudomonas sp. BCNU 154 that was isolated from wastewater in the industrial complex region had optimal activity at $37^{\circ}C$ and pH 8. This crude extracellular lipase from BCNU 154 exhibited maximum stability in toluene, retaining about 6.01 U/ml...
An organic solvent-tolerant lipase of Pseudomonas sp. BCNU 154 that was isolated from wastewater in the industrial complex region had optimal activity at $37^{\circ}C$ and pH 8. This crude extracellular lipase from BCNU 154 exhibited maximum stability in toluene, retaining about 6.01 U/ml (117.53%) activity for 2 h. $Ca^{2+}$, $Mg^{2+}$, $NH_4{^+}$, and $Na^+$ ions and triton X-100 activated the enzymes, whereas $Ba^{2+}$, $Hg^{2+}$, and $Zn^{2+}$ ions inhibited their activity. Pseudomonas sp. BCNU 154 lipase revealed stable activity comparable to that of the commercial immobilized Novozym 435. Thus, this organic solvent-tolerant lipase could have potential as a whole cell biocatalyst in industrial chemical processes without the use of immobilization.
An organic solvent-tolerant lipase of Pseudomonas sp. BCNU 154 that was isolated from wastewater in the industrial complex region had optimal activity at $37^{\circ}C$ and pH 8. This crude extracellular lipase from BCNU 154 exhibited maximum stability in toluene, retaining about 6.01 U/ml (117.53%) activity for 2 h. $Ca^{2+}$, $Mg^{2+}$, $NH_4{^+}$, and $Na^+$ ions and triton X-100 activated the enzymes, whereas $Ba^{2+}$, $Hg^{2+}$, and $Zn^{2+}$ ions inhibited their activity. Pseudomonas sp. BCNU 154 lipase revealed stable activity comparable to that of the commercial immobilized Novozym 435. Thus, this organic solvent-tolerant lipase could have potential as a whole cell biocatalyst in industrial chemical processes without the use of immobilization.
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문제 정의
본 연구에서는 리파아제를 생산하는 유기용매 내성 Pseudomonas sp. BCNU 154 균주의 조효소액으로 온도, 유기용매 및 금속이온 등 여러가지 환경요인 하에서 효소의 안정성을 검토함으로써 산업공정에서 보다 경제적이면서 효율적인 whole cell 리파아제로서의 이용 가능성에 대해 조사하여 보고하고자 한다.
Novozym 435는 Candida antarctica에서 유래된 고정화 리파아제(CalB)로 macrioirous resin (Lewatit VP OC 1600)에 흡착되어 있으며, 바이오디젤 합성반응 등 산업적으로 많이 사용되는 효소로[8], BCNU 154 균주의 조효소액과 다양한 조건에서 상호 비교 검토함으로써 고정화하지 않고도 산업적으로 이용될 수 있는지에 대한 가능성을 조사하기 위해 본 실험에서 양성 대조군으로 사용하였다.
제안 방법
pH에 대한 안정성을 조사하기 위해 0.1 M sodium acetate (pH 4-5), 0.1 M potassium phosphate (pH 6-7), 그리고 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8-10)을 조제하여 다양한 pH 범위에서 30분간 반응시킨 후 410 nm에서 효소의 잔존 활성을 측정하였고, 온도에 대한 안정성 조사는 30-70℃의 다양한 온도 조건에서 0.1 M Tris-HCl (pH 8)을 사용하여 30분간 효소반응을 실시 하였다.
pNPP 에서 1분 동안 1 μmol의 p-nitrophenol (pNP)을 생산하는데 관여하는 효소의 양을 1 unit로 하여 효소활성을 계산하였다[9].
유기용매에 대한 효소의 안정성은 조효소액 3 ml에 25% (v/v) 농도의 benzene, toluene, xylene 및 n-hexane 등 9종의 유기용매 1 ml을 첨가하여 37℃에서 150 rpm으로 2시간 반응 시킨 후 잔존 효소활성을 확인함으로써 조사하였다[13]. 또한 다양한 금속이온 등의 효소활성에 미치는 영향을 조사하기 위해 조효소액에 1 mM의 각종 인자를 첨가하고 37℃에서 1시간 반응시킨 뒤 기질을 첨가하고 5분간 반응시킨 후 잔존 효소활성을 측정하였다[7].
n-Hexane에 내성을 가진 균주 배양액 1 ml은 100 ml의 신선한 LB broth에 재접종하였고 10% toluene을 첨가하여 27℃와 37℃에서 각각 배양한 뒤, 유기용매 내성세균을 순수분리하였다. 분리된 균주는 LB agar 배지에 획선도말한 뒤 toluene을 overlay하여 37℃에서 3일 배양하였고, 최종적으로 toluene에 내성이 뛰어난 균주를 선별하였다. 선별균주의 생리생화학적 특성과 16S 리보좀 RNA에 기초한 유연관계는 상법에 준하여 조사하였다.
울산과 안산공단 지역에서 채취한 폐수 및 토양 시료 1 g을 100 ml의 nutrient broth (NB)와 Luria-Bertani (LB) broth 배지에 접종 후 10% (v/v) n-hexane을 첨가하여 27℃에서 7일간 농화배양을 실시하였다. n-Hexane에 내성을 가진 균주 배양액 1 ml은 100 ml의 신선한 LB broth에 재접종하였고 10% toluene을 첨가하여 27℃와 37℃에서 각각 배양한 뒤, 유기용매 내성세균을 순수분리하였다.
유기용매에 대한 효소의 안정성은 조효소액 3 ml에 25% (v/v) 농도의 benzene, toluene, xylene 및 n-hexane 등 9종의 유기용매 1 ml을 첨가하여 37℃에서 150 rpm으로 2시간 반응 시킨 후 잔존 효소활성을 확인함으로써 조사하였다[13]. 또한 다양한 금속이온 등의 효소활성에 미치는 영향을 조사하기 위해 조효소액에 1 mM의 각종 인자를 첨가하고 37℃에서 1시간 반응시킨 뒤 기질을 첨가하고 5분간 반응시킨 후 잔존 효소활성을 측정하였다[7].
이론/모형
분리된 균주는 LB agar 배지에 획선도말한 뒤 toluene을 overlay하여 37℃에서 3일 배양하였고, 최종적으로 toluene에 내성이 뛰어난 균주를 선별하였다. 선별균주의 생리생화학적 특성과 16S 리보좀 RNA에 기초한 유연관계는 상법에 준하여 조사하였다.
성능/효과
Pseudomonas sp. BCNU 154는 유기용매에 대한 내성이 뛰어난 균주로 toluene을 첨가한 LB agar 배지에서 toluene 분해산물로 추정되는 노란색(unpublished data) 물질을 생성하며잘 증식함이 확인되었다. 이 균주는 생리생화학적 성질과 16S 리보좀 염기서열을 기초로 한 계통관계에서 Pseudomonas putida 근연종임이 확인되었으며(Fig.
고농도(25%)의 다양한 유기용매에 대한 효소 안정성은 toluene, dodecane, xylene, 및 ethylbenzene과 같은 water-immiscible 용매를 첨가했을 때 용매를 넣지 않은 대조군에 비해 각각 117%, 111%, 113% 그리고 106%로 리파아제의 안정성이 증가하였다. 특히 xylene과 cyclohexane 첨가시 Novozym 435는 안정성이 현저히 감소하는 반면에 BCNU 154는 효소 안정성이 오히려 증가하거나 89% 이상으로 유지되어, 다양한 유기용매하에서 효소 안정성이 유지되는 것으로 조사되었다(Fig.
36 U/ml의 효소활성을 보였으며, pH 5-7에서도 상대활성이 80-90% 이상으로 높게 유지되는 것으로 나타났다. 고정화 효소인 Novozym 435는 1 mg/ml 농도일 때 pH 8에서 4.91 U/ml의 활성을 보였으며, 대체로 약염기 조건에서 80-90%의 상대활성이 유지됨이 확인되었다(Fig. 3).
Novozym 435는 Candida antarctica에서 유래된 고정화 리파아제(CalB)로 macrioirous resin (Lewatit VP OC 1600)에 흡착되어 있으며, 바이오디젤 합성반응 등 산업적으로 많이 사용되는 효소로[8], BCNU 154 균주의 조효소액과 다양한 조건에서 상호 비교 검토함으로써 고정화하지 않고도 산업적으로 이용될 수 있는지에 대한 가능성을 조사하기 위해 본 실험에서 양성 대조군으로 사용하였다. 그 결과, pH와 온도 안정성에서 BCNU 154 리파아제는 고정화 효소와 큰 차이가 없음이 확인되었다.
넓은 pH 범위에서 리파아제의 활성을 조사한 결과, pH 8에서 6.36 U/ml의 효소활성을 보였으며, pH 5-7에서도 상대활성이 80-90% 이상으로 높게 유지되는 것으로 나타났다. 고정화 효소인 Novozym 435는 1 mg/ml 농도일 때 pH 8에서 4.
또한 다양한 금속이온, 킬레이트제 및 계면활성제를 첨가하여 효소 안정성을 조사한 결과 Ca2+, Mg2+, NH4+ , Na+ , triton X-100, tween 80 및 tween 100을 첨가했을 때 리파아제 효소 안정성은 101-126%로 증가하였다. 반면에 Cu2+, Ba2+, Hg2+, Zn2+ 및 EDTA는 효소의 안정성을 30% 이상 저해하는 것으로 조사되었다(Table 1).
, triton X-100, tween 80 및 tween 100을 첨가했을 때 리파아제 효소 안정성은 101-126%로 증가하였다. 반면에 Cu2+, Ba2+, Hg2+, Zn2+ 및 EDTA는 효소의 안정성을 30% 이상 저해하는 것으로 조사되었다(Table 1). Pseudomonas sp.
BCNU 154는 유기용매에 대한 내성이 뛰어난 균주로 toluene을 첨가한 LB agar 배지에서 toluene 분해산물로 추정되는 노란색(unpublished data) 물질을 생성하며잘 증식함이 확인되었다. 이 균주는 생리생화학적 성질과 16S 리보좀 염기서열을 기초로 한 계통관계에서 Pseudomonas putida 근연종임이 확인되었으며(Fig. 1), tributyrin이 첨가된 배지에서 콜로니 주변에 투명환을 형성함으로써 리파아제를 생산 함이 확인되었다(Fig. 2).
고농도(25%)의 다양한 유기용매에 대한 효소 안정성은 toluene, dodecane, xylene, 및 ethylbenzene과 같은 water-immiscible 용매를 첨가했을 때 용매를 넣지 않은 대조군에 비해 각각 117%, 111%, 113% 그리고 106%로 리파아제의 안정성이 증가하였다. 특히 xylene과 cyclohexane 첨가시 Novozym 435는 안정성이 현저히 감소하는 반면에 BCNU 154는 효소 안정성이 오히려 증가하거나 89% 이상으로 유지되어, 다양한 유기용매하에서 효소 안정성이 유지되는 것으로 조사되었다(Fig. 5).
후속연구
따라서 Pseudomonas sp. BCNU 154 균주가 생산하는 리파아제는 비교적 넓은 pH 범위, 다양한 유기용매, 금속이온 및 계면활성제에서 효소 안정성을 가진 것으로 확인되었고, 고정화 효소인 Novozym과 비교하여도 효소 안정성에 손색이 없으므로 최적생산조건에 대한 추가적인 실험을 통해 효소안정성을 확보한다면 환경 및 정밀화학 산업분야에 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
다양한 산업공정에서 효소 촉매방법을 보다 효율적으로 이용하기 위해서는 순수 정제된 리파아제를 사용하는 것보다 whole cell 자체를 사용하는 것이 경제적인 측면에서 더 바람직하며[3], 효소 자체의 안정성 및 활성이 유지된다면 추가 고정화 비용을 들이지 않고도 안정성과 반응성을 확보할 수 있어 여러 산업분야에서 광범위하게 이용될 수 있을 것이다. 따라서 Pseudomonas sp.
S5는 30분 처리시 benzene, chloroform, cyclohexane 및 n-hexane 존재하에서 높은 안정성이 나타났으나 2시간 처리시에는 1-pentanol, 1-octanol 및 cyclohexane에서 안정성이 떨어지는 것으로 보고되었다[14]. 이에 비해 BCNU 154가 생산하는 리파아제는 2시간 처리시에도 chloroform과 n-butanol을 제외하고는 대부분 효소 안정성이 증가하거나 유기용매 존재에 크게 영향을 받지 않는 것으로 확인되어 미수계 반응을 요하는 산업공정에 응용될 수 있을 것으로 판단된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
산업적으로 사용되는 리파아제의 단점은?
리파아제는 높은 위치특이성, 기질특이성 및 입체특이성 등 유용한 반응특성을 가지고 있으며[12], 화학적 촉매 공정에서 발생하는 산업폐수및 부산물이 적고, 상대적으로 낮은 온도에서 반응이 일어나 므로 에너지 측면에서도 많은 이점이 있어 산업적으로 광범위 하게 활용되고 있는 추세이다[1, 20]. 그러나 효소의 높은 단가로 제한적으로 사용된다는 점[3], 공정과정에서 안정성과 효소활성이 낮아지는 점 등 효율성이 떨어지는 단점이 있다. 이에 따라 고정화, 생화학적 수식, 화합물의 첨가 및 단백질공학 기법 등으로 효소의 안정성을 증가시켜 사용하고 있으며[2, 10, 11], 특히 고정화 기술이 산업적 공정에 많이 적용되고 있다.
산업적으로 유용한 리파아제의 반응 특성은 무엇입니까?
리파아제는 지질을 분해하여 지방산과 글리세롤을 만드는 지질 가수분해 효소로, 반응조건에 따라 에스테르화합물의 가수분해뿐만 아니라 이들의 합성반응 및 트랜스에스테르화 반응 등 다양한 화학반응을 촉매할 수 있다. 리파아제는 높은 위치특이성, 기질특이성 및 입체특이성 등 유용한 반응특성을 가지고 있으며[12], 화학적 촉매 공정에서 발생하는 산업폐수및 부산물이 적고, 상대적으로 낮은 온도에서 반응이 일어나 므로 에너지 측면에서도 많은 이점이 있어 산업적으로 광범위 하게 활용되고 있는 추세이다[1, 20]. 그러나 효소의 높은 단가로 제한적으로 사용된다는 점[3], 공정과정에서 안정성과 효소활성이 낮아지는 점 등 효율성이 떨어지는 단점이 있다.
리파아제는 어떤 효소입니까?
리파아제는 지질을 분해하여 지방산과 글리세롤을 만드는 지질 가수분해 효소로, 반응조건에 따라 에스테르화합물의 가수분해뿐만 아니라 이들의 합성반응 및 트랜스에스테르화 반응 등 다양한 화학반응을 촉매할 수 있다. 리파아제는 높은 위치특이성, 기질특이성 및 입체특이성 등 유용한 반응특성을 가지고 있으며[12], 화학적 촉매 공정에서 발생하는 산업폐수및 부산물이 적고, 상대적으로 낮은 온도에서 반응이 일어나 므로 에너지 측면에서도 많은 이점이 있어 산업적으로 광범위 하게 활용되고 있는 추세이다[1, 20].
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