라이소자임은 용균 작용, 조직 회복 과정의 촉진 등의 작용을 하며 난백 중에 0.3% 함유되어 있다. 난백에서 라이소자임을 분리하는 방법으로 친화성 크로마토그래피, 이온교환크로마토그래피, 한외여과법 등이 있는데 이 중 이온교환크로마토그래피가 가장 많이 사용된다. 라이소자임을 양이온 젤이 충전된 유리 칼럼에서 분리 정제할 때 최적의 pH와 온도 조건을 찾는 것을 실험 목표로 하고, ASPEN Chromatography 전산 모사의 결과와 비교하였다. 실험에 사용되는 완충용액은 인산완충용액이었고 pH를 5~8로 변화를 주어 상온에서 실험하였고, 가장 분리가 잘 이루어진 pH에서 온도를 $5^{\circ}C$ 간격으로 $25{\sim}40^{\circ}C$로 변화시켜 실험하였다. RP-HPLC (Reversed phase High Performance Liquid Chromatography) 분석을 통해 라이소자임의 체류 시간을 확인하였고, OriginPro 8을 이용해 용출 단계에서 크로마토그램의 면적을 비교하여 라이소자임의 양을 정량분석하였다. 결과를 분석한 결과, pH 5일 때, 온도가 $25^{\circ}C$에서 가장 많은 양의 라이소자임이 분리되었다.
라이소자임은 용균 작용, 조직 회복 과정의 촉진 등의 작용을 하며 난백 중에 0.3% 함유되어 있다. 난백에서 라이소자임을 분리하는 방법으로 친화성 크로마토그래피, 이온교환크로마토그래피, 한외여과법 등이 있는데 이 중 이온교환크로마토그래피가 가장 많이 사용된다. 라이소자임을 양이온 젤이 충전된 유리 칼럼에서 분리 정제할 때 최적의 pH와 온도 조건을 찾는 것을 실험 목표로 하고, ASPEN Chromatography 전산 모사의 결과와 비교하였다. 실험에 사용되는 완충용액은 인산완충용액이었고 pH를 5~8로 변화를 주어 상온에서 실험하였고, 가장 분리가 잘 이루어진 pH에서 온도를 $5^{\circ}C$ 간격으로 $25{\sim}40^{\circ}C$로 변화시켜 실험하였다. RP-HPLC (Reversed phase High Performance Liquid Chromatography) 분석을 통해 라이소자임의 체류 시간을 확인하였고, OriginPro 8을 이용해 용출 단계에서 크로마토그램의 면적을 비교하여 라이소자임의 양을 정량분석하였다. 결과를 분석한 결과, pH 5일 때, 온도가 $25^{\circ}C$에서 가장 많은 양의 라이소자임이 분리되었다.
Lysozyme amounts to 0.3% in egg white and functions as an agent of cell lysis and activator of tissue reconstruction. Ion exchange chromatography is the most useful method of separation among affinity chromatography, ion exchange chromatography, and ultra-filtration. The aim of present study is to f...
Lysozyme amounts to 0.3% in egg white and functions as an agent of cell lysis and activator of tissue reconstruction. Ion exchange chromatography is the most useful method of separation among affinity chromatography, ion exchange chromatography, and ultra-filtration. The aim of present study is to find the optimum pH and temperature for the separation of lysozyme in egg white within cation exchange gel filled glass column. And we compared results of experiments with those of simulations. Phosphate buffer was used, and pH and temperature were varied as 5~7 and $25{\sim}40^{\circ}C$ respectively. RP-HPLC was the tool for the retention time identification and quantitative analysis of lysozyme. OriginPro 8 measured the peak area of lysozyme chromatogram and quantified the eluted lysozyme. Largest amount of lysozyme was separated under the conditions of pH 5 and T $25^{\circ}C$.
Lysozyme amounts to 0.3% in egg white and functions as an agent of cell lysis and activator of tissue reconstruction. Ion exchange chromatography is the most useful method of separation among affinity chromatography, ion exchange chromatography, and ultra-filtration. The aim of present study is to find the optimum pH and temperature for the separation of lysozyme in egg white within cation exchange gel filled glass column. And we compared results of experiments with those of simulations. Phosphate buffer was used, and pH and temperature were varied as 5~7 and $25{\sim}40^{\circ}C$ respectively. RP-HPLC was the tool for the retention time identification and quantitative analysis of lysozyme. OriginPro 8 measured the peak area of lysozyme chromatogram and quantified the eluted lysozyme. Largest amount of lysozyme was separated under the conditions of pH 5 and T $25^{\circ}C$.
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문제 정의
본 연구에서는 이온교환 크로마토그래피를 이용하여 난백에 포함 되어 있는 라이소자임을 분리정제할 때 가장 최적의 조건을 찾는 것을 목표로 실험을 수행하였다. 완충용액의 pH를 5~8로 변화를 주어 최적의 pH를 찾고, 온도를 5℃ 간격 25~40℃로 변화시켜 라이소자임 분리에 미치는 영향을 확인하고, 위의 조건에 맞춰 전산모사를 수행하고, 두 결과를 비교해 보았다.
제안 방법
이 때 사용한 펌프는 SP930D(Younglin, Korea) 2대로 주 펌프에는 100% 증류수, 보조펌프에는 100% Acetonitrile(ACN)을 연결하여 사용하였다. ACN와 DW를 50:50을 비율로 1 ml/min의 유속으로 흘려보내 칼럼을 안정화시킨 후 시료를 주입하였다. 두 용액이 완전히 섞이게 하기 위해 gradient mixer(Gradient mixer, BIORAD, USA) 사용하였다.
완충용액은 실험의 목적에 맞게 pH를 5부터 8까지 변화를 주어 사용하였다. Fraction collector를 통해 분획된 용액 중에서 라이소자임의 농도가 가장 높은 분획을 찾기 위해서 흡광도를 측정하였다.
그 중 가장 흡광도가 높은 분획 시료 20 μl을 RP-HPLC를 이용하여 분석하였다.
라이소자임 정제 실험을 위해 양이온 교환 크로마토그래피의 평형, 시료 주입, 세척, 용리의 순서로 수행하였다. 크로마토그래피 실험 조건은 Table 1과 같고, 이 실험 조건에 따라 유량과 시간을 조절하여 각각 단계별로 용액을 주입하였다.
표준 라이소자임의 체류시간은 2분 10초였다. 시료 주입 후 동일한 체류시간에 단일 피크가 형성이 되면 라이소자임으로 보았다.
온도 변화에 따른 이온교환 크로마토그래피 실험에서 분리한 라이소자임을 RP-HPLC를이용하여 분석하였다. Fig.
본 연구에서는 이온교환 크로마토그래피를 이용하여 난백에 포함 되어 있는 라이소자임을 분리정제할 때 가장 최적의 조건을 찾는 것을 목표로 실험을 수행하였다. 완충용액의 pH를 5~8로 변화를 주어 최적의 pH를 찾고, 온도를 5℃ 간격 25~40℃로 변화시켜 라이소자임 분리에 미치는 영향을 확인하고, 위의 조건에 맞춰 전산모사를 수행하고, 두 결과를 비교해 보았다.
검출기는 UV 검출기 UV-1(Phamarcia, USA)을 사용하였다. 용출 단계에서 용액을 모으기 위하여 fraction collector (Model 2110 Fraction Collector, BIO-RAD, USA)를 사용하였고, UV 검출기에서 흡광도를 측정하여 전기적 신호로 바꾸어주기 위하여 데이터 수집기와 소프트웨어(Autochro 2000, Younglin, Korea)를 사용하였다. 온도를 변화시키기 위해 항온조(Cole-Parmer Polystat, USA)를 사용하였다.
용출 단계에서 나온 용액은 UV 검출기를 지나 fraction collector에 20초 단위로 분획된다. 이 때 UV 검출기에서는 흡광도를 측정하였으며, 측정된 흡광도를 Autochro 2000을 통해 전기적인 신호로 바꾸어 컴퓨터에 저장하였다. 완충용액은 실험의 목적에 맞게 pH를 5부터 8까지 변화를 주어 사용하였다.
수집된 라이소자임을 정량분석하기 위하여 크로마토그램의 면적을 OriginPro 8(OriginLab Corporation, USA) 프로그램으로 구하였다. 이온교환 크로마토그래피 실험에서는 용출 단계인 35~50분 사이의 면적을구하였고, RP-HPLC로 분석한 크로마토그램에서는라이소자임의 피크가 나타나는 2~3분 사이의 면적을 구하였다.
이온교환 크로마토그래피로 난백에서 라이소자임을 분리하는 실험을 Aspen의 cyclic organizer를 [13] 이용하여 전형적인 평형, 샘플주입, 세척, 용리의 4단계를 고려하여 Aspen Chromatography 전산모사를 하였다. 전산모사와 비교한 실험은 pH가 5, 8일 때, 온도가 25, 40 ℃일 때이다.
이온교환 크로마토그래피를 통해 라이소자임을 분리하는 데에 최적의 pH와 온도를 알아보기 위해 분리실험을 비교하기 위해 pH 변화와 온도 변화에 따른 라이소자임의 용출 단계의 피크 면적을 비교하였다. pH를 변화시켜 실험을 한 결과 pH 5에서 분리수율이 좋았고 온도는 가장 낮은 온도인 25 ℃에서 좋은 결과를 보였다.
대상 데이터
실험에 사용된 재료는 계란의 난백을 건조시킨 난백 파우더를 증류수로 희석하여 시료로 사용하였다. 완충 용액은 0.
02 M 인산(Sigma-Aldrich, USA) 용액을 사용하였다. 양이온교환수지는 CM Excellose겔(Bioprogen, Korea)을 사용하였다. RP-HPLC 실험에서는 Acetonitrile(J.
용출 단계에서 용액을 모으기 위하여 fraction collector (Model 2110 Fraction Collector, BIO-RAD, USA)를 사용하였고, UV 검출기에서 흡광도를 측정하여 전기적 신호로 바꾸어주기 위하여 데이터 수집기와 소프트웨어(Autochro 2000, Younglin, Korea)를 사용하였다. 온도를 변화시키기 위해 항온조(Cole-Parmer Polystat, USA)를 사용하였다. Fraction collector로 모은 샘플의 흡광도 측정은 분광광도계(Series1000, Cecil, UK)를 사용하였다.
실험에 사용된 재료는 계란의 난백을 건조시킨 난백 파우더를 증류수로 희석하여 시료로 사용하였다. 완충 용액은 0.02 M 인산나트륨(Sigma-Aldrich, USA) 용액을 pH 5, 6, 7, 8로 각각 제조하여 사용하였다. 용리 용액은 1.
02 M 인산나트륨(Sigma-Aldrich, USA) 용액을 pH 5, 6, 7, 8로 각각 제조하여 사용하였다. 용리 용액은 1.0 M 염화나트륨(Sigma-Aldrich, USA) 용액이 포함된 0.02 M 인산(Sigma-Aldrich, USA) 용액을 사용하였다. 양이온교환수지는 CM Excellose겔(Bioprogen, Korea)을 사용하였다.
그 중 가장 흡광도가 높은 분획 시료 20 μl을 RP-HPLC를 이용하여 분석하였다. 이 때 사용한 펌프는 SP930D(Younglin, Korea) 2대로 주 펌프에는 100% 증류수, 보조펌프에는 100% Acetonitrile(ACN)을 연결하여 사용하였다. ACN와 DW를 50:50을 비율로 1 ml/min의 유속으로 흘려보내 칼럼을 안정화시킨 후 시료를 주입하였다.
칼럼은 C18 칼럼(250×46 mm, Phenomenex, USA)을 사용하였고, 측정을 위해 자외선 검출기(783A, Applied Biosystems, USA), 데이터수집장치(Autochro Data Module, Younglin, Korea), 데이터 수집 소프트웨어(Autochro 2000, Younglin, Korea)를 사용하였다.
칼럼은유리칼럼(15 mm ID×250 mm L, Phamarcia USA)을 사용하였다.
데이터처리
수집된 라이소자임을 정량분석하기 위하여 크로마토그램의 면적을 OriginPro 8(OriginLab Corporation, USA) 프로그램으로 구하였다. 이온교환 크로마토그래피 실험에서는 용출 단계인 35~50분 사이의 면적을구하였고, RP-HPLC로 분석한 크로마토그램에서는라이소자임의 피크가 나타나는 2~3분 사이의 면적을 구하였다.
이론/모형
자주 사용되는 전산모사프로그램에는 MATLAB, C++, Python, COMSOL, ASPEN 등 여러가지 프로그램이 있다[10]. 이번 연구에 사용한 프로그램은 ASPEN Choromatography이며, 이온교환 크로마토그래피에 설정된 등온흡착식은 Mass Action Equilibrium, Yamamoto, Extended Langmuir, Extended Langmuir 2 and Counter-Ion Dependent, Extended Langmuir-Freundlich, User Pr℃edure, User Submodel이 있다. 이번 실험의 전산모사에 사용한 등온흡착식은 Yamamoto이다.
Fraction collector로 모은 샘플의 흡광도 측정은 분광광도계(Series1000, Cecil, UK)를 사용하였다. 전산모사는 Aspen Chromatography(ver.2006, Aspen Tech., USA) 프로그램을 사용하였다.
전산모사와 비교한 실험은 pH가 5, 8일 때, 온도가 25, 40 ℃일 때이다. 전산모사에 사용한 흡착등온식은 Yamamoto 방정식이다. 식 (3)의 IP1, IP2, IP3 매개변수를 변화시켜 전산모사 결과를 얻었다.
성능/효과
5에서 온도의 역수와 용량인자의 로그값이 정비례 하는 것을 볼 수 있 었다. (1)식의 기울기가 음수이므로 엔탈피 변화는 양수이며 이온 교환 젤에 단백질이 흡착할 때 반응은 흡열반응임을 알 수 있었다. 라이소자임의 분리는 25℃에서 잘 이루어지는 것을 알 수 있었다.
2와비슷하게 모든 그래프에서 2분 10초에 단일 피크가 형성된 것으로 보아 순수 라이소자임을얻었다. RP-HPLC 피크의 높이가 이온교환 크로마토그래피 실험에서의 결과와 비슷하였고, 온도가 증가할수록 RP-HPLC 피크가 작아졌다. 따라서 pH 5에서의 라이소자임 분리의 최적 온도는 25 ℃임을 알 수 있었다.
두 그래프의 면적을 비교했을 때, pH 5에서 면적이 가장 넓었고, pH가 올라갈수록 면적이 줄어들었다. pH 7과 pH 8의 면적이 큰 차이가 나지 않아 비슷한 양의 라이소자임이 용출되었음을 알 수 있었다. 따라서 pH가 올라갈수록 용출되는 라이소자임 양이 줄어듬을 알 수 있었다.
이온교환 크로마토그래피를 통해 라이소자임을 분리하는 데에 최적의 pH와 온도를 알아보기 위해 분리실험을 비교하기 위해 pH 변화와 온도 변화에 따른 라이소자임의 용출 단계의 피크 면적을 비교하였다. pH를 변화시켜 실험을 한 결과 pH 5에서 분리수율이 좋았고 온도는 가장 낮은 온도인 25 ℃에서 좋은 결과를 보였다. Fig.
그리고 여러 pH에서 피크 높이도 이온 교환크로마토그래피 실험에서의 결과와 비슷한 것으로 보아 분석이 정량적으로 이루어진 것을 알 수 있다. 그리고 이온교환 크로마토그래피 실험 결과와 RP-HPLC 분석 결과를 비교해 본 결과 라이소자임의 분리에서 최적의 pH는 5임을 알 수 있었다.
4a, 4b에 나타내었다. 두 그래프의 면적을 비교했을 때, pH 5에서 면적이 가장 넓었고, pH가 올라갈수록 면적이 줄어들었다. pH 7과 pH 8의 면적이 큰 차이가 나지 않아 비슷한 양의 라이소자임이 용출되었음을 알 수 있었다.
5이므로 pH가 낮아질수록 양이온화가 더 많이 되어 양이온 교환수지에 많이 흡착된다. 따라서 pH 5에서 라이소자임이 가장 많이 용출되었고, pH 7과 8에서는 큰 차이가 없었다. 이전의 연구에서는 pH가 높을수록 용출시간이 앞당겨졌고, 피크의 높이가 높게 나왔지만, 피크의 폭은 좁게 나왔다[3].
pH 7과 pH 8의 면적이 큰 차이가 나지 않아 비슷한 양의 라이소자임이 용출되었음을 알 수 있었다. 따라서 pH가 올라갈수록 용출되는 라이소자임 양이 줄어듬을 알 수 있었다.
2에 나타내었다. 모든 그래프에서 2분 10초에 단일 피크가 형성된 것으로 보아 순수한 라이소자임임을 알 수 있었다. 그리고 여러 pH에서 피크 높이도 이온 교환크로마토그래피 실험에서의 결과와 비슷한 것으로 보아 분석이 정량적으로 이루어진 것을 알 수 있다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
라이소자임은 무엇인가?
라이소자임은박테리아세포벽의주요구성성분인 mucopolysaccaride의 n-acetylglucosamine과 muramic acid 사이에 연결되어 있는 β결합을 가수분해시키는 효소로서 Fleming에 의해 최초로 발견되었다[1]. 라이소자임은 129개의 아미노산으로 이루어져 있으며, 단량체의 형태에는 네 개의 disulfate 결합이 있다.
계란이 라이소자임 추출 원료로 가장 적합한 이유는?
3%로 가장 높다. 계란 난백은 라이소자임을 함유한 동물이나 식물에 비하여 분리가 용이하며, 추출조작이 비교적 용이하기 때문에 추출원료로 가장 적합한 것으로 알려져 있다[6].
이온교환 크로마토그래피를 통해 라이소자임을 분리할 때에 최적의 pH와 온도는 얼마로 나왔는가?
이온교환 크로마토그래피를 통해 라이소자임을 분리하는 데에 최적의 pH와 온도를 알아보기 위해 분리실험을 비교하기 위해 pH 변화와 온도 변화에 따른 라이소자임의 용출 단계의 피크 면적을 비교하였다. pH를 변화시켜 실험을 한 결과 pH 5에서 분리수율이 좋았고 온도는 가장 낮은 온도인 25 oC에서 좋은 결과를 보였다. Fig.
참고문헌 (13)
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