본 연구는 메밀의 항산화 및 항염증 활성을 측정하기 위해 열수 추출을 한 후 ABTS 및 DPPH 라디칼을 통한 항산화 활성 그리고 RAW264.7 세포에서 MTT, NO생성 억제, 단백질 발현량을 분석하였다. ABTS 라디칼과 DPPH 라디칼 활성 측정 시 추출물 농도 의존적으로 소거 활성을 확인하였고, 세포독성 평가에서는 1.0 mg/mL가 적정 농도임을 확인하였다. 열수 추출물 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 그리고 1.0 mg/mL에서 NO생성 억제효능은 0.5, 1.0 mg/mL에서 50% 이상을 나타내었고(p<0.05), 단백질 발현 분석에서 LPS처리그룹에 비해 열수 추출물 처리군이 약 40% 저해하는 것을 확인하였다.
본 연구는 메밀의 항산화 및 항염증 활성을 측정하기 위해 열수 추출을 한 후 ABTS 및 DPPH 라디칼을 통한 항산화 활성 그리고 RAW264.7 세포에서 MTT, NO생성 억제, 단백질 발현량을 분석하였다. ABTS 라디칼과 DPPH 라디칼 활성 측정 시 추출물 농도 의존적으로 소거 활성을 확인하였고, 세포독성 평가에서는 1.0 mg/mL가 적정 농도임을 확인하였다. 열수 추출물 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 그리고 1.0 mg/mL에서 NO생성 억제효능은 0.5, 1.0 mg/mL에서 50% 이상을 나타내었고(p<0.05), 단백질 발현 분석에서 LPS처리그룹에 비해 열수 추출물 처리군이 약 40% 저해하는 것을 확인하였다.
This study was conducted to investigate the effects of the hot water extract from buckwheat (WEB) in RAW-264.7 macrophage cells against lipopolysaccharide (LPS). In these experiments, we evaluated the anti-inflammatory effects of WEB by measuring MTT assay, nitric oxide (NO), inducible NOS (iNOS) pr...
This study was conducted to investigate the effects of the hot water extract from buckwheat (WEB) in RAW-264.7 macrophage cells against lipopolysaccharide (LPS). In these experiments, we evaluated the anti-inflammatory effects of WEB by measuring MTT assay, nitric oxide (NO), inducible NOS (iNOS) production, and cyclooxygenase-2 (COX-2) expression by Western blotting. The extracts showed a protective effect by increasing cell viability on LPS in RAW264.7 cells. WEB (0.25, 0.5, and 1.0 mg/mL) significantly suppressed LPS-stimulated production of NO. Also, WEB reduced the expression of iNOS and COX-2 proteins. The present results show that WEB has potent anti-inflammatory effects on RAW264.7 cells. In addition, WEB has various antioxidant effects as a result of 2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) and 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) which possess a radical scavenging activity. The total polyphenol and flavonoid contents of the WEB were $13.22{\pm}3.69mg\;GAE/g$ extract and $38.53{\pm}5.20mg\;CE/g$ extract respectively. The present results give the understanding of biological activities of buckwheat and encourage their application for supplements.
This study was conducted to investigate the effects of the hot water extract from buckwheat (WEB) in RAW-264.7 macrophage cells against lipopolysaccharide (LPS). In these experiments, we evaluated the anti-inflammatory effects of WEB by measuring MTT assay, nitric oxide (NO), inducible NOS (iNOS) production, and cyclooxygenase-2 (COX-2) expression by Western blotting. The extracts showed a protective effect by increasing cell viability on LPS in RAW264.7 cells. WEB (0.25, 0.5, and 1.0 mg/mL) significantly suppressed LPS-stimulated production of NO. Also, WEB reduced the expression of iNOS and COX-2 proteins. The present results show that WEB has potent anti-inflammatory effects on RAW264.7 cells. In addition, WEB has various antioxidant effects as a result of 2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) and 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) which possess a radical scavenging activity. The total polyphenol and flavonoid contents of the WEB were $13.22{\pm}3.69mg\;GAE/g$ extract and $38.53{\pm}5.20mg\;CE/g$ extract respectively. The present results give the understanding of biological activities of buckwheat and encourage their application for supplements.
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문제 정의
본 연구는 메밀 추출물이 염증성 질환 세포주에 용이한 작용을 하는 것을 확인하는 것으로 iNOS와 COX-2의 발현억제를 통해 NO의 생성 저해를 유도하는 것을 나타낸다.
이처럼 우수한 영양성분과 조리법 및 효능을 갖는 메밀이지만 아직 메밀 연구가 미흡한 실정으로 본 연구에서는 다양한 효능을 나타내는 메밀 열수 추출물의 항산화 및 항염증 효과를 검증하여, 메밀을 이용한 생리 기능성 바이오 소재 개발 및 조리 연구를 위한 기초자료로 활용하고자 한다.
제안 방법
5회 세척 후 1차 항체(1:1,000)를 1시간 동안 반응시킨 후 다시 2차 항체(1:1,000)를 반응시키고, ECL kit(Amersham Pharmacia, England)를 이용하여 발현량을 측정하였다.
Nitrite의 측정은 Griess reagent system을 이용하여 분석하였다.
RAW264.7 세포를 24-well plates에 5×104 cells/well이 되도록 분주하고, 12시간 배양한 후 추출물을 0, 0.125, 0.25, 0.5 그리고 1.0 mg/mL와 LPS 0.1 μg/mL의 농도로 동시 처리 또는 LPS 단독 처리하여 18시간을 배양하였다.
각 시료 및 표준용액 0.5 mL를 대조액과 시험 용액으로 두 개의 시험관에 취하고, 에탄올 1.5 mL, 10% Aluminum nitrate(Yakuri pure chemicals Co., Ltd., Osaka, Japan) (0.1 mL) 및 1.0 M Pota- ssium acetate (Junsei chemical Co., Ltd.) 0.1 mL, 증류수 2.8 mL를 잘 혼합 후 실온에서 40분간 정치하고, UV/Visible spectrophotometer(UV-2550, Shimadzu)를 사용하여 415 nm에서 흡광도를 측정하여 작성한 검량선으로부터 함량을 구하였다.
2(A)), 이 결과는 천연 소재가 세포주에 특별한 독성이 없다는 것을 의미한다. 또한, 연구를 수행하면서 추출물 처리 농도는 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 그리고 1.0 mg/mL를 선택하였다. Lee HH(2008)은 메밀 추출물을 이용한 보고 연구에서 HaCaT 세포와 melanoma B16F10 세포를 이용하여 세포 독성실험을 수행하였을 때 100 μg/mL 농도 범위에서 독성이 없음을 확인하였다.
메탄올과 증류수의 6 : 4(v/v) 혼합용매에 녹인 0.1 mM DPPH와 각각의 추출물을 2 : 1 비율로 균일하게 혼합한 다음 상온에서 약 1시간 반응 시킨 후, 흡수분광광도계를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
본 연구는 메밀의 항산화 및 항염증 활성을 측정하기 위해 열수 추출을 한 후 ABTS 및 DPPH 라디칼을 통한 항산화 활성 그리고 RAW264.7 세포에서 MTT, NO생성 억제, 단백질 발현량을 분석하였다. ABTS 라디칼과 DPPH 라디칼 활성 측정 시 추출물 농도 의존적으로 소거 활성을 확인하였고, 세포독성 평가에서는 1.
본 연구에서는 생리활성이 우수한 것으로 알려진 메밀 열수 추출물로 마크로파지 세포에 LPS에 대한 염증성 질환 모델을 이용하여 세포생존, NO 생성 억제, 단백질 단계로 iNOS와 COX-2의 발현을 분석하였고, 항산화 활성 측정을 위해 ABTS와 DPPH 라디칼 소거 활성을 확인하였다.
7 마크로파지 세포의 배양은 DMEM 배지에 10% 불활성시킨 FBS를 첨가하고, 항생제를 mL 당 10 μg 넣은 것을 사용하였다. 세포는 10～12번의 계대배양을 통해 세포가 안정된 상태에서 실험을 진행하였고, 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
세포를 24-well plates에 5×104 cells/mL 농도로 1.0 mL씩 분주한 뒤 24시간 동안 배양하고, 각 시료를 최종 농도(0, 0.125, 0.25, 0.5, 1.0 그리고 2.0 mg/mL)가 되도록 세포에 처리하여 24시간 동안 배양하였다.
실험에 사용된 메밀 열수 추출을 위한 용매는 3차 멸균 증류수를 사용하였고, 추출은 건조 분말 메밀 20 g을 3차 증류수 500 mL를 첨가하여 70℃에서 40분 동안 3회 추출하였다. 추출물은 여과지 (No.
원심 분리하여 얻은 단백질은 bradfordassay로 정량하였으며, 20 μL의 단백질을 10%의 SDS-PAGE를 이용하여 전기 영동한 후, PVDF에 70 V에서 2시간 동안 옮기고, TBST로 5회 이상 세척한 후 꺼내서 5% 탈지유로 하룻밤 동안 반응 시켜 항체의 비특이적 결합을 억제시켰다.
지금까지의 결과를 바탕으로 메밀 추출물의 NO생성에 영향을 미치는 iNOS와 COX-2의 세포 내 단백질 발현억제에 관한 활성을 western blot으로 명확하게 분석하였다.
지금까지의 연구를 바탕으로 항산화 활성을 나타내는 메밀 추출물을 이용하여 세포에 처리하여 염증성 cytokine, NO와 같은 매개물질을 세균 내 독소로 알려진 LPS를 처리하였을 때의 억제 효능을 확인하였다(Fig.
추출물 비첨가군으로는 80% 메탄올을 사용하였고, ABTS 라디칼 소거능은 다음과 같은 계산식에 따라 계산하였다(Yaar M․Gilchrest BA 2001; Sep GU et al 2013).
실험에 사용된 메밀 열수 추출을 위한 용매는 3차 멸균 증류수를 사용하였고, 추출은 건조 분말 메밀 20 g을 3차 증류수 500 mL를 첨가하여 70℃에서 40분 동안 3회 추출하였다. 추출물은 여과지 (No. 11, Whatman, Maidstone, England)로 잔재물을 제거한 후 rotary vacuum evaporator(EYELA, Tokyo, Japan)로 농축하고 동결건조하였다. 동결 건조 후 샘플은 —20℃에 보관하여 실험에 사용하였다.
항산화 효과를 측정하기 위하여 1,1-diphenyl2-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼을 이용하여 측정하였다. 메탄올과 증류수의 6 : 4(v/v) 혼합용매에 녹인 0.
RAW264.7 마크로파지 세포의 배양은 DMEM 배지에 10% 불활성시킨 FBS를 첨가하고, 항생제를 mL 당 10 μg 넣은 것을 사용하였다.
그리고 세포실험을 위해 사용된 시약인 Dulbecco’s Modified Eagle Me- dium(DMEM), Fetal Bovine Serum(FBS), Penicillin Streptomycin은 Lonza사(Walkersville, MD, USA)에서 구입하였다.
실험에 사용된 메밀은 국내 강원지역에서 생산된 메밀을 농산물 시장(Busan, Korea)에서 구입하여 음건하고 분쇄기로 파쇄하여 사용하였다(Ha- nil, Seoul, Korea). 염증성 모델인 RAW264.
염증성 모델인 RAW264.7 세포는 활성측정을 위해 사용하였고 한국세포주은행 (Seoul, Korea)에서 분양받았다.
데이터처리
모든 결과는 3회 반복 측정 후 평균±표준편차로 나타내었으며, 유의성 검증은 Window용 SPSS 12.0 version을 이용하여 student t-test one way를 이용하였으며, Duncan’s new multiple range test으로 사후검증하였다.
이론/모형
2,2'-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) 라디칼을 이용한 항산화력 측정은 ABTS cation decolorization assay 방법을 이용하였다.
LPS에 의해 손상된 세포로부터 생성된 nitrite를 측정하기 위하여 Griess 반응을 이용하였다. MA JS 등(2010)의 방법을 응용하여 Griess 시약의 diazo기가 nitrite를 만나면 분홍색으로 변하게 되는 색의 반응을 측정하였다.
단백질 발현량 분석은 Lee SJ 등(2012)의 방법에 준하여 진행하였다. RAW264.
메밀의 열수 추출물을 이용하여 마크로파지 세포인 RAW264.7를 이용하여 세포독성을 측정하고자 MTT assay로 분석하였다. MTT assay는 생존 세포의 미토콘드리아 능력을 이용하는 검사법으로 탈수소 효소 작용에 의하여 노란색의 수용성 기질(MTT tetrazolium)이 청자색을 띄는 비수용성 MTT-formazan 결정체로 환원되는 형태로 본 연구의 1.
세포의 생존율은 3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide(MTT) 환원 방법을 이용하여 측정하였다. 세포를 24-well plates에 5×104 cells/mL 농도로 1.
RAW264.7 세포에 LPS(100 ng/mL) 단독처리군 및 LPS와 항산화 활성이 우수했던 메밀 추출물을 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5 그리고 1.0 mg/mL 농도의 동시처리군의 NO 생성 억제 효과를 확인하였을 때 메밀 추출물에 대하여 농도 의존적으로 NO 생성저해 활성을 확인하였으며, 저농도에서도 유의적인 NO 생성 저해 활성을 나타내었다.
각 추출물의 세포생존, NO생성 및 단백질 발현 분석에서 농도 의존적으로 LPS에 대해 억제 및 저해 효능을 확인하였고, 특히 0.25, 0.5 그리고 1.0 mg/mL에서 유의적인 차이를 확인하였다.
마크로파지 세포에 LPS (100 ng/mL) 단독 처리군과 메밀 추출물 1.0 mg/mL를 같이 처리하였을 때 iNOS 단백질 발현 억제에 크게 관여하는 것을 확인하였고(Fig.
34%의 소거효능을 각각 나타내었다. 비교군으로 사용한 합성 항산화제인 BHT의 값이 91.27%를 확인하였다. 기존의 연구에서는 두 종류의 메밀 유기용매 추출을 통해 ABTS 라디칼 소거효능을 확인하였을 때 5 μL/mL에서 쓴메밀이 91.
열수 추출물 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 그리고 1.0 mg/mL에서 NO생성 억제효능은 0.5, 1.0 mg/mL에서 50% 이상을 나타내었고 (p<0.05), 단백질 발현 분석에서 LPS처리그룹에 비해 열수 추출물 처리군이 약 40% 저해하는 것을 확인하였다.
이러한 결과로부터 메밀 추출물이 iNOS의 발현억제효과(42.3%)와 COX-2의 발현억제효과 (39.6%)가 탁월함을 확인할 수 있었으며, iNOS와COX-2의 발현억제가 NO의 생성억제를 유도함을 확인할 수 있었다.
후속연구
ABTS와 DP- PH 라디칼 소거 활성은 합성 항산화제인 BHT보다 활성이 좋지 않았지만, 천연 항산화제로써의 가능성을 확인하였고, 훌륭한 식품소재로써 기능성 식품 및 각종 질병에 대한 예방의 목적으로 활용이 가능할 것으로 사료된다.
그러나 이러한 기능성이 부각되었음에도 불구하고, 메밀의 생리활성적인 사례는 미흡한 실정으로 본 연구 결과는 식품학적으로 중요한 자료를 제공할 것으로 사료된다.
따라서 본 연구 결과는 조리 및 식품학적의 기초 지식을 제공할 것으로 사료되어지고, 좀 더 정확한 결과를 위해 동물모델을 이용한 생리활성 연구가 필요할 것으로 판단되어지며, 메밀의 유효단일물질인 루틴(rutin) 등의 분리 방법 확립 등이 추가적으로 필요할 것으로 판단된다.
하지만 추가적으로 각 단백질 혹은 사이토카인을 조절하는 주요 인자에 대한 연구가 필요하며, 지금까지 결과들은 천연자원이 갖는 안정성에 집중하며, 부작용 등의 문제에서도 자유로울 수 있을 것으로 판단되며, 향후 조리업과 외식업계에 메밀의 특성에 관한 과학적 데이터를 제시함으로써 메밀의 정보를 알리면서 소비 등에도 큰 영향을 미칠 것으로 예상 되어지는 바이다.
0 mg/mL 농도로 처리한 경우에는 80%에 가까운 NO를 저해하였다. 향후 실질적으로 항염증 활성을 나타내는 유효물질의 분리 및 동정하는 연구가 필요할 것으로 판단된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
유럽, 미국, 캐나다에서는 메밀을 어떤 형태로 이용하는가?
메밀(Buckwheat)은 오래전부터 구황작물의 하나로 쌍자엽 식물의 마디풀과에 속하며, 고지대의 서늘한 기후와 척박한 땅에서 단기간 생육하는 식물로 세계 여러 나라에서 재배하고 있으며, 이용형태에 따라 중국과 러시아에서는 죽이나 비스켓 형태로 많이 이용하고 있고(Kim SH et al 2007), 유럽, 미국, 캐나다 등에서는 메밀빵, 스파게티, 마카로니의 형태로 이용하고 있다(Kim BR et al 2000). 또한, 일본에서는 국수형태로서 널리 대중화되어 있으며, 우리나라에서는 막국수, 메밀 부침과 메밀묵 등의 주원료로 소비되어 왔으나, 경제성장에 따라 식생활이 서구화되면서 증가하는 각종 성인병의 예방과 치료에 메밀이 효과가 있다는 연구결과와 함께 메밀의 소비도 증가하고 있다(Pomeranz Y 1985; Kim BR et al 2000).
메밀의 무기질 성분에는 어떤 것이 있는가?
0% 내외이며, 단백질은 약 13%로서 종피와 과피에 많이 함유되어 있다. 또한, 메밀의 무기질 성분으로 K, Mg, Ca,P 및 Fe의 함량이 많고, Mn, Zn, Na 및 Se 등은 미량 함유되어 있다(Lee SY et al 1991). 기존의 메밀에 관한 연구에서 K와 Mg은 주로 과피에 있으면서 단백질 부분에 농축되어 있기 때문에 단계적으로 제분을 할 경우에는 최종 단계에서 얻어지는 메밀가루에 무기질 함량이 많다고 보고하였다(Lee SY et al 1991).
마크로파지세포가 생성한 Prostaglandin E2(PGE2)는 어떤 특징을 갖는가?
그러나 염증 반응이 일어나면 관련 세포에서 iNOS의 발현이 증가하여 많은 양의 NO가 생성하고, 과도하게 생성된 NO는 조직의 손상, 유전자 변이, 신경 손상 등을 유발하고, 부종 등의 염증 반응을 촉진시키는 매개체로 작용하는 것으로 보고되어진다(Yun HY et al 1996). Prostaglandin E2(PGE2)는 통증과 발열에 주로 관여하는 염증 인자로서 염증 반응이 일어나면 대식세포의 COX-2에 의해 생성된다(Wang MT et al 2007, Sarkar D et al 2008). 따라서 염증 반응에서 생성되는 물질 중 iNOS, COX-2의 단백질 발현의 억제를 확인하여 항염증 효과를 분석하는 추세이다(Lee CB 2012; Ha HJ․Lee CB 2014).
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