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문제 정의
- 이와 같이 우리나라의 대표적인 베리류에 속하는 복분자와 오디는 천연색소 자원 및 기능성 소재로서 적합하고 특히 항산화 효과가 높은 것으로 알려져 있으나 이들은 주로 단일식물만을 대상으로 실행된 연구 결과이며 특히 항산화 활성과 페놀성 화합물의 상관성에 관한 연구는 미비한 상황이다. 따라서 본 연구에서는 복분자와 오디의 건강기능성 식품 소재로서의 이용 가능성을 위한 기초 자료를 얻기 위하여 복분자와 오디에 적합한 추출용매를 선정한 후에 추출물과 이들의 분획물에 대하여 항산화 활성, 페놀성 화합물 함량 및 이들의 상관성을 분석한 결과를 비교 검토하였다.
가설 설정
- 3)Values are mean±SD (n=3).
- 5)ND is an abbreviation for not detected.
제안 방법
- 8%(w/w)이었다. 복분자와 오디의 분획물은 동결건조 한 복분자와 오디의 조추출물 120 g에 증류수 1.2 L를 첨가하여 상온에서 12시간 교반한 후에 n-hexane(1.2 L, 1시간), chloroform(1.2 L, 1시간), ethyl acetate(1.2 L, 1시간), n-butanol(1.2 L, 1시간)을 순차적으로 첨가하고 교반하는 과정을 3회 반복하였다. 분획된 각 용액들은 모아서 40°C에서 감압 농축하여 용매를 제거한 후에 동결건조 하였다.
- 복분자와 오디의 조추출물은 복분자와 오디 분말 1 kg에 60%(v/v) acetone 10 L를 첨가하여 상온에서 12시간 교반한 후에 여과(Whatman No. 4)하는 과정을 3회 실시하였다. 이 여과액을 모아서 40°C에서 감압 농축하여 용매를 제거한 후에 동결건조 하였다.
- 복분자와 오디의 항산화 활성 연구에 적합한 추출용매의 선정은 복분자와 오디 분말 2.5 g에 20~100%(v/v)의 ethanol, methanol 및 acetone 추출용매 250 mL를 각각 첨가하여 상온에서 12시간 교반한 후에 Whatman No. 4(GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Sweden) 를 사용하여 여과하는 과정을 2회 반복하였으며, 이 여과액을 모아 500 mL로 정용하여 분석시료로 사용하였다.
- 시료액 500 μL에 5% NaNO275 μL를 첨가하여 상온에서 5분간 반응시킨 후에 10% AlCl3 150 μL를 첨가하였다.
- 암소에서 1시간 동안 반응시켜 725 nm(UV-1650PC, Shimadzu Co., Kyoto, Japan)에서 흡광도를 측정하였으며, gallic acid를 표준물질로 사용하여 작성한 검량곡선으로 함량을 계산한 후에 추출물의 총 페놀성 화합물 함량을 추출물 mg 당 μg gallic acid로 나타내었다.
대상 데이터
- , Gyeonggi, Korea)하여 사용하였다. 2,2-Diphenyl-1- picrylhydrazyl(DPPH), 2,2-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS), Folin-Ciocalteu reagent, butylated hydroxytoluene(BHT), gallic acid, protocatechuic acid, p-hydrobenzoic acid, vanillic acid, syringic acid, p-coumaric acid, ferulic acid, salicylic acid, rosmarinic acid 등과 같은 시약은 Sigma-Aldrich사 (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, 그 밖의 시약들은 analytical grade를 구입하여 사용하였다.
- 이동상은 6% formic acid(용매 A)와 acetonitrile(용매 B)이었으며, gradient program은 0~35분은 용매 A를 100%에서 82%로 감소, 35~40분은 용매 A를 82%로 유지, 40~42분은 용매 A를 82%에서 100%로 증가, 42~60분은 용매 A를 100%로 유지하게 설정하였다. 검출기는 photodiode array detector(PDA, waters 2998, Waters Co., Milford, MA, USA)를 사용하여 protocatechuic acid와 p-hydrobenzoic acid는 260 nm, gallic acid, vanillic acid 및 syringic acid는 270 nm, p-coumaric acid, ferulic acid, sinapic acid, salicylic acid 및 rosmarinic acid는 320 nm에서 검출하였다.
- 본 연구에 사용한 복분자(Rubus coreanus Miquel fruit) 와 오디(Morus alba L. fruit)는 전북 고창지역에서 2009년에 생산된 것을 구입하여 동결건조 한 후, 이를 150 μm로 분쇄(Single type stainless roller, Shinpoong Eng. Ltd., Gyeonggi, Korea)하여 사용하였다.
- 분석 시 사용된 ABTS radical cation 용액은 7 mM ABTS 용액에 2.45 mM potassium persulfate를 첨가한 후에 암소에서 12시간이상 실온에서 보관하여 최종농도가 2.45 mM인 ABTS radical cation 용액을 제조하였으며, 분석 직전에 2.45 mM ABTS radical cation 용액에 5 mM phosphate buffer saline(pH 7.4)을 첨가하여 734 nm에서 흡광도가 0.70±0.02가 되도록 희석하여 사용하였다.
- 제조된 조추출물과 분획물은 -20°C에서 보관하면서 항산화 활성의 분석시료로 사용하였다.
- 5(v/v) 로 혼합한 용매를 사용하였고, 검출기는 UV detector를 사용하여 530 nm에서 검출하였다. 표준물질은 cyanidin-3- glucoside, cyanidin-3-rutinoside, pelargonidin-3-glucoside 및 peonidin-3-glucoside를 사용하였다.
데이터처리
- 3)Different superscript letters (a-e) in the same column indicate a significant difference according to Duncan's multiple range test (P<0.05).
- 4)Different superscript letters (a-f) in the same column indicate a significant difference according to Duncan's multiple range test (P<0.05).
- 각 시료간의 유의성은 P<0.05 수준에서 one way ANOVA로 분산분석한 후에 Duncan's multiple range test로 비교하였으며, 총 폴리성 화합물, 총 플라보노이드, 안토시아닌 등과 같은 항산화 성분과 항산화 활성의 연관성은 Pearson 상관 분석을 이용한 단순 회귀 분석(simple regression analysis)을 실시하여 비교하였다.
- 각 실험은 3회 반복 실험하여 얻은 결과를 SAS 통계 프로그램(ver. 9.1, SAS Institute, Cary, NC, USA)을 이용하여 평균과 표준편차로 나타내었다. 각 시료간의 유의성은 P<0.
이론/모형
- ABTS assay는 Arts 등(17)의 방법을 이용하였다. 시료액 30 μL에 ABTS radical cation 용액 3 mL를 첨가하여 암소에서 7분간 반응시킨 후에 734 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 대조구로는 BHT를 사용하였다.
- Anthocyanin 조성은 Kim 등(20)의 방법을 이용하였다. 각 시료는 HPLC용 메탄올을 사용하여 5 mg/mL의 농도로 용해한 후에 0.
- DPPH assay은 Brand-Williams 등(16)의 방법을 이용 하였다. 시료액 0.
- DPPH radical 소거능 및 DPPH radical의 흡광도를 50% 감소시키는데 필요한 시료의 농도(the half maximal effective concentration, EC50, μg/mL)는 다음의 식에 의하여 얻어진 결과를 내삽법으로 계산하여 나타내었다.
- Phenolic acid 조성은 Abdel-Aal와 Rabalski(19)의 방법을 이용하였다. 각 시료는 HPLC용 메탄올을 사용하여 5 mg/mL의 농도로 용해한 후에 0.
- Reducing power는 Oyaizu(18)의 방법을 이용하였다. 시료액 1 mL에 0.
- Reducing power는 시료액 첨가구와 무첨가구의 흡광도의 차이로 나타내었으며, reducing power에서 반응액의 흡광도가 0.5가 되는데 필요한 시료의 농도(EC50, μg/mL)는 측정된 결과를 내삽법으로 계산하여 나타내었다.
- 총 페놀성 화합물 함량(total phenolic content)은 Dewanto 등(14)의 방법을 이용하였다. 시료액 0.
- 총 플라보노이드 함량(total flavonoid content)은 Jia 등 (15)의 방법을 이용하였다. 시료액 500 μL에 5% NaNO275 μL를 첨가하여 상온에서 5분간 반응시킨 후에 10% AlCl3 150 μL를 첨가하였다.
성능/효과
- 1)X1, X2, X3, Y, and R are total phenolic content, total flavonoid content, anthocyanin content, each antioxidant activity, and correlation coefficient, respectively.
- 2)EC50 values are expressed as the effective concentration at which antioxidant activity using DPPH or ABTS cation radicals were scavenged by 50%; absorbance was 0.5 for reducing power.
- 결과적으로 이들의 총 함량은 오디 60% acetone 추출물(77.9 μg/mg) 이 복분자 60% acetone 추출물(55.1 μg/mg)보다 1.4배 높게 나타났다.
- 다양한 추출용매를 사용하여 얻은 복분자와 오디의 추출용액 중에서 가장 높은 항산화 활성을 보인 60% acetone과 이들의 분획물을 대상으로 측정한 항산화 활성에서 시료별로는 오디, 분획별로는 ethyl acetate 분획의 EC50 값이 낮게 나타났다. 복분자와 오디의 항산화 성분 중 총 페놀성 화합물과 총 플라보노이드 함량이 안토시아닌 함량에 비해 매우 높게 나타났다.
- 이런 현상은 식물자원에 존재하는 다양한 항산화 물질이 추출에 사용된 용매의 극성에 의해서 용해되는 정도가 다르기 때문으로 알려져 있다(22). 따라서 다른 추출용매보다 DPPH radical 소거능이 우수한 항산화 물질을 많이 함유하고 있는 것으로 판단되는 60% acetone을 복분자와 오디의 항산화 활성 연구를 위한 가장 적합한 추출용매로 선정하였다.
- 따라서 복분자와 오디의 추출물과 이들의 분획물을 대상으로 측정된 항산화 성분과 시료의 농도(100 μg/ mL)에서 측정된 항산화 활성을 기준으로 상관성을 확인한결과(Table 4), 복분자와 오디의 총 페놀성 화합물 및 총 플라보노이드 함량과 각 항산화 활성의 상관계수(correlation coefficient, R)는 각각 0.84~1과 0.86~1로 높은 상관성을 나타내었다.
- 식물체 내에는 다양한 항산화 성분들이 함유되어 있으며, 이들의 특성에 따라 다른 항산화 활성을 나타낼 수 있기 때문에 항산화 활성을 정확하게 검증하기 위해서는 다양한 방법을 사용하여 측정해야 한다(23). 따라서 세 가지의 다른 항산화 활성 측정방법을 사용하여 항산화 활성을 측정한 결과, 복분자와 오디 60% acetone 추출물은 시료의 농도가 증가할수록 항산화 활성이 증가하는 농도 의존적인 특성을 보였으나(data not shown), 복분자 60% acetone 추출물이 오디 60% acetone 추출물보다 DPPH assay는 1.7배, ABTS assay는 1.1배, reducing power는 1.2배 높은 EC50값을 나타내어 용매 선정과 유사한 경향을 보였다. 항산화 활성별로는 대조구로 사용된 BHT가 117.
- 위의 결과들을 종합해보면 복분자와 오디의 항산화 성분은 추출에 사용된 용매의 종류에 따라 함량 및 조성이 변화하며 그 결과로서 항산화 활성에 영향을 주게 됨을 확인할 수 있었다. 또한 오디 ethyl acetate 분획물은 DPPH assay와 reducing power에서 BHT보다 각각 2.2와 1.2배 낮은 EC50 값을 보여 천연 항산화 소재로서의 가능성을 보였다.
- 86~1로 높은 상관성을 나타내었다. 반면에 안토시아닌 함량과 각 항산화 활성의 R은 복분자에서는 0.16~0.46의 낮은 상관성을, 오디에서는 0.83~0.89의 높은 상관성을 보였다. 복분자에서의 낮은 R 은 오디와 달리 가장 낮은 EC50 값을 나타낸 ethyl acetate 분획물이 60% acetone 추출물뿐만 아니라 n-butanol 분획물보다도 안토시아닌 함량이 낮았기 때문으로 판단된다.
- 반면에 오디 분획물별 EC50 값은 세가지 항산화 활성에서 n-hexane> water> chloroform> n-butanol> ethyl acetate 분획물 순으로 감소하여 시료와 분획물별로 항산화 활성이 달라지는 것으로 나타났으나, 가장 강한 항산화 활성은 복분자와 오디 모두 ethyl acetate 분획물로 나타났다.
- 3배 높게 나타났다. 반면에 오디 분획물에서는 총 페놀성 화합물, 총 플라보노이드 및 안토시아닌 함량의 경우 ethyl acetate 분획물이 60% acetone 추출물보다 각각 8.9, 7.2 및 2.5배 높게 나타났다. 한편 복분자와 오디의 분획물 중 chloroform 분획물에서는 안토시아닌이 검출되지 않았는데 이는 수용성이 강한 안토시아닌의 특성이 반영된 것으로 판단된다.
- 8 mg/100 g 높았다. 반면에 오디의 주된 안토시아닌은 60% acetone 추출물과 ethyl acetate 분획물에서 cyanidin-3-glucoside와 cyanidin-3-rutinoside이었으며, 이들의 함량은 ethyl acetate 분획물이 60% acetone 추출물보다 각각 3.3과 1.4배 높았다. 그러나 peonidin-3-glucoside는 총 4개의 시료 모두에서 검출되지 않았다.
- 복분자와 오디의 60% acetone 추출물과 이들의 분획물을 대상으로 총 페놀성 화합물, 총 플라보노이드 및 안토시 아닌 함량을 측정하고 이들이 항산화 활성에 미치는 영향을 단순 회귀 분석을 통하여 분석한 상관성의 결과는 Table 3 및 4와 같다. 복분자 60% acetone 추출물은 오디 60% acetone 추출물에 비해 안토시아닌 함량이 많았으나 총 페놀성 화합물과 총 플라보노이드 함량이 적었다. 결과적으로 이들의 총 함량은 오디 60% acetone 추출물(77.
- 복분자 분획물별 EC50 값은 DPPH assay에서 water> n-butanol> chloroform> n-hexane> ethyl acetate 분획물 순으로, ABTS assay와 reducing power에서 water> chloroform> n-hexane> n-butanol> ethyl acetate 분획물 순으로 감소하였다.
- 복분자 분획물별 항산화 성분의 함량은 총 페놀성 화합물과 총 플라보노이드의 경우 ethyl acetate 분획물이 60% acetone 추출물보다 각각 10.0과 4.7배, 안토시아닌의 경우 n-butanol 분획물이 2.3배 높게 나타났다. 반면에 오디 분획물에서는 총 페놀성 화합물, 총 플라보노이드 및 안토시아닌 함량의 경우 ethyl acetate 분획물이 60% acetone 추출물보다 각각 8.
- DPPH assay는 DPPH의 free radical이 항산화 활성을 가지고 있는 물질에게 전자를 내어주고 소거되는 산화반응을 이용하는 분석방법으로 항산화 성분이 존재하는 다양한 식물체의 항산화 활성을 탐색하는데 주로 사용된다 (16). 복분자와 오디 추출액의 DPPH radical 소거능은 각각 9.2~56.2%와 9.4~85.2%의 범위로 다양하게 나타났으며, 그중에서도 60% acetone으로 추출한 복분자와 오디 추출액이 가장 높은 활성을 보였다. 추출용매의 농도별로는 100%의 단일용매보다 단일용매에 증류수를 첨가한 60%와 80%의 농도에서, 추출용매별로는 acetone 용매에서 강한 항산화 활성을 보였으며, 복분자 추출액보다 오디 추출액의 DPPH radical 소거능이 높았음을 확인하였다.
- 다양한 추출용매를 사용하여 얻은 복분자와 오디의 추출용액 중에서 가장 높은 항산화 활성을 보인 60% acetone과 이들의 분획물을 대상으로 측정한 항산화 활성에서 시료별로는 오디, 분획별로는 ethyl acetate 분획의 EC50 값이 낮게 나타났다. 복분자와 오디의 항산화 성분 중 총 페놀성 화합물과 총 플라보노이드 함량이 안토시아닌 함량에 비해 매우 높게 나타났다. 항산화 성분과 항산화 활성의 상관성은 총 페놀성 화합물과 총 플라보노이드에서는 높은 상관성을나타냈으나 안토시아닌에서는 오디에서만 높은 상관성을 나타내었다.
- 복분자의 주된 안토시아닌은 60% acetone 추출물과 ethyl acetate 분획물에서 cyanidin-3-glucoside이었으며, 그 함량은 60% acetone 추출물이 ethyl acetate 분획물보다 2.8 mg/100 g 높았다. 반면에 오디의 주된 안토시아닌은 60% acetone 추출물과 ethyl acetate 분획물에서 cyanidin-3-glucoside와 cyanidin-3-rutinoside이었으며, 이들의 함량은 ethyl acetate 분획물이 60% acetone 추출물보다 각각 3.
- 복분자와 오디의 주된 phenolic acid는 protocatechuic acid, p-hydrobenzoic acid 및 salicylic acid이 었으며 주된 안토시아닌은 cyanidin-3-glucoside이었다. 위의 결과들을 종합해보면 복분자와 오디의 항산화 성분은 추출에 사용된 용매의 종류에 따라 함량 및 조성이 변화하며 그 결과로서 항산화 활성에 영향을 주게 됨을 확인할 수 있었다. 또한 오디 ethyl acetate 분획물은 DPPH assay와 reducing power에서 BHT보다 각각 2.
- 이는 0~100%의 ethanol 농도별 복분자 추출물의 총 페놀성 화합물과 총 플라보노이드 함량이 각각 48.8~67.1 μg/mg과 18.3~23.9 μg/mg, 오디 품종별 80% ethanol 추출물의 총 페놀성 화합물과 총 플라보노이드 함량이 각각 9.9~22.5 μg/mg과 1.3~3.4 μg/mg이라는 기존의 결과와 비교하면, 복분자 60% acetone 추출물은 총 페놀성 화합물의 함량은 낮지만 총 플라보노이드 함량은 높게 나타났으며, 오디 60% acetone 추출물은 총 페놀성 화합물과 총 플라보노이드 함량이 모두 높게 나타났다(9,11).
- 추출용매의 농도별로는 100%의 단일용매보다 단일용매에 증류수를 첨가한 60%와 80%의 농도에서, 추출용매별로는 acetone 용매에서 강한 항산화 활성을 보였으며, 복분자 추출액보다 오디 추출액의 DPPH radical 소거능이 높았음을 확인하였다. 이러한 결과는 추출용매의 농도별 DPPH assay에서 복분자 75% ethanol 추출물이 복분자 100% ethanol 추출물보다 1.1배 강한 활성을, 오디 50% ethanol 추출물이 오디 100% ethanol 추출물보다 1.9배 강한 활성을 보였다는 결과와 유사하였다 (9,12). 또한 추출용매별 DPPH assay에서도 복분자 75% acetone 추출물이 복분자 80% methanol 추출물보다 강한 활성을 보여 동일한 시료일지라도 추출용매에 따라 항산화 활성에 차이를 보인다는 결과와도 유사하였다(8,21).
- 2%의 범위로 다양하게 나타났으며, 그중에서도 60% acetone으로 추출한 복분자와 오디 추출액이 가장 높은 활성을 보였다. 추출용매의 농도별로는 100%의 단일용매보다 단일용매에 증류수를 첨가한 60%와 80%의 농도에서, 추출용매별로는 acetone 용매에서 강한 항산화 활성을 보였으며, 복분자 추출액보다 오디 추출액의 DPPH radical 소거능이 높았음을 확인하였다. 이러한 결과는 추출용매의 농도별 DPPH assay에서 복분자 75% ethanol 추출물이 복분자 100% ethanol 추출물보다 1.
- 이는 유기용매를 사용하여 얻은 식물체의 조추출물을 극성용매로 분획하는 경우에 분획물의 항산화 활성은 페놀성 화합물의 용해가 잘 일어나는 ethyl acetate 분획물에서 가장 높게 나타난다는 결과와 유사하였다 (24,25). 특히 오디 ethyl acetate 분획물은 DPPH assay와 reducing power에서 대조구로 사용된 BHT보다 각각 2.2와 1.2배 낮은 EC50 값을 보여 가장 강한 항산화 활성을 갖는 것으로 나타났다. 한편 복분자와 오디의 항산화 활성이 항산화 측정방법뿐만 아니라 시료 및 분획물별로 다른 결과를 보이는 이유를 알아보기 위해서는 이들 과실에 함유되어 있는 항산화 성분 분석이 필요하다고 판단된다.
- 복분자와 오디의 항산화 성분 중 총 페놀성 화합물과 총 플라보노이드 함량이 안토시아닌 함량에 비해 매우 높게 나타났다. 항산화 성분과 항산화 활성의 상관성은 총 페놀성 화합물과 총 플라보노이드에서는 높은 상관성을나타냈으나 안토시아닌에서는 오디에서만 높은 상관성을 나타내었다. 복분자와 오디의 주된 phenolic acid는 protocatechuic acid, p-hydrobenzoic acid 및 salicylic acid이 었으며 주된 안토시아닌은 cyanidin-3-glucoside이었다.
후속연구
- 최근에는 복분자 및 오디 추출물의 단순 가공제품에서 벗어나 건강기능성 식품 소재로 활용하기 위한 방안도 모색하고 있다(6,7). 이와 같은 복분자와 오디의 건강기능성 식품 소재화를 통하여 만성질환의 지연이나 예방에 도움을 줄 수 있는 페놀성 화합물을 손쉽게 섭취할 수 있을 것으로 기대된다.
- 2배 낮은 EC50 값을 보여 가장 강한 항산화 활성을 갖는 것으로 나타났다. 한편 복분자와 오디의 항산화 활성이 항산화 측정방법뿐만 아니라 시료 및 분획물별로 다른 결과를 보이는 이유를 알아보기 위해서는 이들 과실에 함유되어 있는 항산화 성분 분석이 필요하다고 판단된다.
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