Raw264.7 cells에서 바이칼린 함유 황금열수 추출물의 면역계 조절을 통한 항염증 효과 Anti-inflammatory Effect of Scutellaria baicalensis Hot Water Extracts Containing Baicalin on Modulation of the Immune System in Raw264.7 Cells원문보기
체내 면역시스템은 내부의 돌연변이 세포에 의하여 발생된 암 뿐만 아니라 세균감염에 의하여 기인된 여러질환으로 부터 우리의 몸을 보호한다. 하지만 노화됨에 따라 비정상적인 면역시스템은 류머티스 관절염과 같은 만성염증을 유발시킨다. 그러므로, 본 연구의 목적은 효능성분으로 바이칼린을 함유한 황금의 항염증 효과를 조사한 것이다. 먼저 HPLC 분석에서 SBWE는 42.2 mg/g의 바이칼린을 함유하고 있는 것으로 관찰되었다. Raw264.7 세포에서 황금열수추출물(SBWE)의 세포독성을 평가하기 위하여 MTT assay를 수행하였다. SBWE는 160 ${\mu}g/ml$ 이하의 농도에서 세포에 대한 독성이 없는 것으로 나타났다. 또한 lipopolysaccharide로 자극된 대식세포에서 발생하는 nitric oxide 소거능 효과를 조사해 본 결과 40 ${\mu}g/ml$의 농도에서 SBWE는 40%의 억제효과를 나타내었다. 뿐만 아니라 SBWE는 zymosan으로 자극된 대식세포의 식세포작용도 억제 하였다. 더욱이 SBWE는 농도에 비례하여 대식세포에서 생성되는 $TNF{\alpha}$함량을 감소시켰다. SBWE는 또한 시간경과 실험에서 인터류킨 베타($IL-1{\beta}$)의 생성을 억제하였다. 더욱이 cyclooxynase-2의 발현수준은 20 ${\mu}g/ml$의 SBWE 처리에 의하여 현저하게 감소되었다. 그러므로 이상의 연구결과는 황금 열수 추출물이 면역조절을 통해 항염증을 효능을 발휘할 수 있다는 하나의 증거를 제공한다.
체내 면역시스템은 내부의 돌연변이 세포에 의하여 발생된 암 뿐만 아니라 세균감염에 의하여 기인된 여러질환으로 부터 우리의 몸을 보호한다. 하지만 노화됨에 따라 비정상적인 면역시스템은 류머티스 관절염과 같은 만성염증을 유발시킨다. 그러므로, 본 연구의 목적은 효능성분으로 바이칼린을 함유한 황금의 항염증 효과를 조사한 것이다. 먼저 HPLC 분석에서 SBWE는 42.2 mg/g의 바이칼린을 함유하고 있는 것으로 관찰되었다. Raw264.7 세포에서 황금열수추출물(SBWE)의 세포독성을 평가하기 위하여 MTT assay를 수행하였다. SBWE는 160 ${\mu}g/ml$ 이하의 농도에서 세포에 대한 독성이 없는 것으로 나타났다. 또한 lipopolysaccharide로 자극된 대식세포에서 발생하는 nitric oxide 소거능 효과를 조사해 본 결과 40 ${\mu}g/ml$의 농도에서 SBWE는 40%의 억제효과를 나타내었다. 뿐만 아니라 SBWE는 zymosan으로 자극된 대식세포의 식세포작용도 억제 하였다. 더욱이 SBWE는 농도에 비례하여 대식세포에서 생성되는 $TNF{\alpha}$함량을 감소시켰다. SBWE는 또한 시간경과 실험에서 인터류킨 베타($IL-1{\beta}$)의 생성을 억제하였다. 더욱이 cyclooxynase-2의 발현수준은 20 ${\mu}g/ml$의 SBWE 처리에 의하여 현저하게 감소되었다. 그러므로 이상의 연구결과는 황금 열수 추출물이 면역조절을 통해 항염증을 효능을 발휘할 수 있다는 하나의 증거를 제공한다.
The immune system protects the body from bacterial infection and disease, as well as cancer that develops following the mutation of cells. Aging exerts adverse effects on the immune system, such as chronic inflammation, resulting in rheumatoid arthritis. The purpose of this study was to investigate ...
The immune system protects the body from bacterial infection and disease, as well as cancer that develops following the mutation of cells. Aging exerts adverse effects on the immune system, such as chronic inflammation, resulting in rheumatoid arthritis. The purpose of this study was to investigate the anti-inflammatory effectiveness of Scutellaria baicalensis, which contains baicalin. HPLC analysis showed that S. baicalensis hot water extracts (SBWE) contained 42.2 mg/g of baicalin. To evaluate the cytotoxicity of SBWE, an MTT assay was carried out in Raw264.7 cells. No cytotoxicity was observed below 160 ${\mu}g/ml$ of SBWE. SBWE at 40 ${\mu}g/ml$ reduced the amount of nitric oxide produced by macrophages stimulated with lipopolysaccharide by 40%. In addition, SBWE inhibited phagocytosis stimulated with zymosan. Furthermore, the content of tumor necrosis factor-alpha ($TNF-{\alpha}$) produced by the macrophages was decreased in the presence of SBWE in a dose-dependent manner. SBWE also inhibited the production of interleukin-1 beta ($IL-1{\beta}$) in a time course experiment. Moreover, treatment with 20 ${\mu}g/ml$ of SBWE remarkably decreased the expression level of cyclooxynase-2. The results provide evidence that SBWE may exert an anti-inflammatory effect through modulation of the immune system.
The immune system protects the body from bacterial infection and disease, as well as cancer that develops following the mutation of cells. Aging exerts adverse effects on the immune system, such as chronic inflammation, resulting in rheumatoid arthritis. The purpose of this study was to investigate the anti-inflammatory effectiveness of Scutellaria baicalensis, which contains baicalin. HPLC analysis showed that S. baicalensis hot water extracts (SBWE) contained 42.2 mg/g of baicalin. To evaluate the cytotoxicity of SBWE, an MTT assay was carried out in Raw264.7 cells. No cytotoxicity was observed below 160 ${\mu}g/ml$ of SBWE. SBWE at 40 ${\mu}g/ml$ reduced the amount of nitric oxide produced by macrophages stimulated with lipopolysaccharide by 40%. In addition, SBWE inhibited phagocytosis stimulated with zymosan. Furthermore, the content of tumor necrosis factor-alpha ($TNF-{\alpha}$) produced by the macrophages was decreased in the presence of SBWE in a dose-dependent manner. SBWE also inhibited the production of interleukin-1 beta ($IL-1{\beta}$) in a time course experiment. Moreover, treatment with 20 ${\mu}g/ml$ of SBWE remarkably decreased the expression level of cyclooxynase-2. The results provide evidence that SBWE may exert an anti-inflammatory effect through modulation of the immune system.
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문제 정의
따라서 본 연구는 그람 음성균의 세포 외막에 존재하는 lipopolysaccaride (LPS)로 염증반응을 일으켜 활성화된 Raw264.7 세포에서 황금열수추출물의 iNOS, COX-2, interleukin 그리고 TNFα와 같은 염증전매개인자에 미치는 영향을 조사하여 항염증 효과를 조사하고자 한다.
제안 방법
Column은 YMC gel ODS A 302, 4.6×250 mm, 5 ml, USA)을 이용하였고, baicalin에 대해서 각각 280 nm에서 10, 25, 50, 100 mg/ml의 농도로 분석하여 크로마토그램을 얻고 이로부터 평균면적을 얻어 검량곡선을 그리고 여기에 삽입하여 바이칼린을 정량한다.
FITC conjugated zymosan A 10 μl와 DMEM 90 μl를 처리하였다.
PBS 1 g/100 ml에 녹인 뒤 30분간 가열과정을 거쳐 활성화시킨 zymosan A 10 μl와 NBT (nitroblue tetrazolium) 20 μl 그리고 PBS 470 μl를 처리하였다.
Raw264.7 세포로부터 생성된 NO의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포 배양액 중에 존재하는 NO2-의 형태로서 측정하였다. Raw264.
TNFα (forward primer: 5-TCTCTCTAATCAGCCCTCTG-3, reverse primer: 5-CCAACTGGT TATCTCTCAGC-3), iNOS (forward primer: 5'-AAGCTGAAATGAATGAGGA-3', reverse primer:5'-GACCTCAGATAATGCAGAGC-3'), G3PDH (forward primer: 5'-TGA AGGTCGGTGTG AAC GGATTTGGC-3' reverse primer: 5'-CATGTA GGCCATGA GGATCCACCAC3') PCR 생성물을 2% agarose gel에 전기영동 시킨 뒤 ethidium bromide로 염색하였으며, AlphaEase® gel image-analysis software (alpha Inotech, San Leandro, CA, USA)를 사용하여 정량하였다.
The values obtained were compared with those of standard concentrations of sodium nitrite dissolved in Dulbecco’s modified Eagle’s minimal essential medium (DMEM), and the concentrations of nitrite in conditioned media of sample-treated cells were calculated.
Western blot의 band는 LAS3000® image analyzer (Fujifilm Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다.
그 다음 10% skim milk를 nitrocellulose membrane에 전 처리하고 목적 단백질에 대한 1차 항체(anti-iNOS, antiCOX-2, anti-IL-1β, anti-TNFα 그리고 anti-βactin)를 처리한다음 2차 항체를 처리 후, chemiluminescent ECL kit (Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 목적단백질을 검출하였다.
본 실험에 사용한 황금은 흐르는 물에 깨끗이 세척한 다음 자연 건조한 후, 수 차례 물로 세척하여 세척·건조된 상기 황금을 각각 증류수와 1:10의 중량 %비로 혼합하여 진탕기로 100℃에서 3 시간 동안 진탕하여 2회 반복하여 열수 추출하였고, 얻어진 용액을 합하여 회전 진공 농축하여 용매를 증발시켜 추출물을 얻었다.
뿐만 아니라 황금열수추출물은 다양한 초기의 염증단계에서 중요한 역할을 하는 pro-inflammatory cytokine인 cyclo-oxygenase-2 (COX-2)와 활성화된 macrophage에서 분비되어 염증반응을 일으키는 tumor necrosis factor-alpha (TNFα)의 단백질 발현 수준을 하향 조절했다.
세포에 SBWE 2.5, 5, 10, 20 그리고 40 μg/ml 농도를 전처리하고 1시간 뒤 LPS를 1 μg/ml 처리한뒤 24시간 배양하였다.
세포에 황금 열수 추출물 2.5, 5, 10, 20 그리고 40 μg/ml 농도를 전처리 하고 1시간 후 배양액을 제거하였다.
세포에 황금 열수 추출물 2.5, 5, 10, 20, 그리고 40 μg/ml 농도를 전처리 하고 1시간 후 배양액을 제거하였다.
황금 열수 추출물 역시 처리 시간에 따라 LPS 처리군과 비교하여 TNFα의 단백질 발현 수준을 억제시켰다.
황금 열수추출물의 TNFα와 IL-1β 단백질 발현 조절효과를 시간에 따라 조사하기 위해 황금열수추출물이 전 처리된 Raw264.7 세포에 1, 2, 4, 8 그리고 16 시간 동안 LPS로 자극하였다.
황금 열수추출물의 염증관련 cytokine의 단백질 수준에서의 발현 억제효과를 조사하였다. 황금열수추출물로 전 처리된 Raw264.
황금열수추출물의 Fluoro conjugated-Zymosan A에 의해 활성화된 Raw264.7 세포의 식균작용 억제능을 조사하였다. Fig.
황금열수추출물의 Zymosan A에 의해 활성화된 Raw264.7세포의 식균작용 억제능을 조사하였다. Fig.
대상 데이터
Raw264.7 세포는 5% CO2및 37℃에서 95% 이상의 습도를 유지한 배양기에서 10% fetal bovine serum, 2 mM glutamine and 100 μg/ml penicillin -streptomycin을 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였다.
세포배양을 위한 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), Trypsin-EDTA, penicillin / streptomycin / amphotericin (각각 10,000 U/ml, 10,000 μg/ml 및 2,500 μg/ml), fetal bovine serum (FBS) 시약은 Gibco BRL, Life Technologies (Paisley, Scotland)로 부터 구입하였다. Raw264.7 세포는 American Type of Culture Collection (Manassas, VA, USA)으로 부터 제공받았다. Raw264.
상기 추출물을 여과한 후, 여과된 여액을 동결건조하여 분말 형태의 황금 열수추출물(Scutellaria baicalensis hot water extracts, SBWE)을 얻는다. 분말형태의 황금 열수추출물을 시험농도로 희석하여 본 연구에 사용하였다.
세포배양을 위한 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), Trypsin-EDTA, penicillin / streptomycin / amphotericin (각각 10,000 U/ml, 10,000 μg/ml 및 2,500 μg/ml), fetal bovine serum (FBS) 시약은 Gibco BRL, Life Technologies (Paisley, Scotland)로 부터 구입하였다.
실험에 사용된 RNA는 황금열수추출물을 전처리 한 뒤 LPS 로 3시간 동안 자극한 Raw264.7 세포로부터 추출하였다. 추출을 위해 세포는 Trizol®로 분해시키고 25℃, 12,000× g에서 15분 동안 원심분리 한 뒤 cholroform을 첨가하였다.
실험에 사용된 RNA는 황금열수추출물을 전처리 한 뒤 LPS 로 3시간 동안 자극한 Raw264.7 세포로부터 추출하였다. 추출을 위해 세포는 Trizol®로 분해시키고 25℃, 12,000× g에서 15분 동안 원심분리 한 뒤 cholroform을 첨가하였다.
데이터처리
Level of significance was identified statistically (*, p<0.05) using Student’s t test.
Level of significance was identified statistically (*, p<0.05; **, p<0.01) using Student’s t test.
Level of significance was identified statistically using Student’s t test.
각 시료농도군에 대한 유의차 검정은 대조군과 비교하여 Student’s test 한 후 p<0.05 값을 통계적으로 유의성 있는 결과로 간주하였다.
각 실험은 3회 이상 반복실험을 통하여 그 결과를 얻어 각각의 시료농도에 대해 평균±표준편차로 나타내었다.
이론/모형
Hansen [8]의 방법에 따라 Raw264.7세포에 대한 황금열수 추출물의 세포독성을 MTT (3-(4,5-dimethyl-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 이용하여 측정하였다.
LPS (Lipopolysaccharide)에 의해 Raw264.7 세포로부터 생성되는 NO에 대한 황금 열수추출물의 억제효과를 세포배양액으로부터 Griess assay 방법에 의해 측정하였다. Fig.
황금열수추출물의 대식세포에 독성을 미치지 않는 농도를 결정하기 위하여 MTT assay를 수행하였다. Fig.
성능/효과
Fig. 3에서 보는 바와 같이 황금열수추출물의 2.5, 5, 10, 20, 그리고 40μg/ml 처리농도에서 NO의 생성억제 효과를 측정한 결과 80μg/ml의 농도로 처리한 세포군에서 NO의 생성 함량은 대조군와 비교했을 때 약 50% 정도의 소거능을 보여 공시험군과 비슷한 수준의 NO 생성량을 나타내었다.
Fig. 4에서 보는 바와같이 NBT 발색법을 이용하여 식균작용 억제능을 조사한 결과 zymosan A 처리 하에서 황금 열수 추출물은 20 μg/ml의 농도 이상에서 약 20% 정도의 식균작용 억제능을 나타내었다.
나이가 들어감에 따라 만성염증이 많이 생기고 이에 따른 류마티스 관절염, 동맥경화와 같은 다양한 노인성 질환이 빈번하게 발생한다[14, 16]. 그 결과 눈에 띄는 억제효과는 나타나지 않았으나 황금열수추출물의 농도가 증가함에 따라 염색된 세포수가 줄어든 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 황금열수추출물이 외부 자극으로부터 세포를 보호하고 체내에 과도한 염증반응을 억제하여 노화의 진행을 억제한다고 나타낸다.
다음으로 급성염증과 만성염증을 유발한다고 알려진 interleukin-1β (IL-1β)와 interleukin-6 (IL-6)의 단백질 발현조절 효과를 조사한결과, 황금열수추출물 처리군에서 IL-6의 단백질 발현 수준에는 변함이 없었으나 IL-1β의 단백질 발현 수준은 감소하였다.
따라서 황금열수추출물은 160 μg/ml 이하의 범위에서는 세포독성이 없는 것으로 관찰되었다.
또한 iNOS와 COX-2의 단백질 수준에서의 발현 억제 효과를 조사한 결과 황금 열수추출물은 20 μg/ml의 농도 이상에서 효과적으로 COX-2의 발현을 억제하였다.
또한 황금열수추출물의 급성염증과 만성염증을 유발한다고 알려진[9] interleukin-1β (IL-1β)와 interleukin-6 (IL-6)의 단백질 발현조절 효과를 조사한 결과, 황금열수추출물 처리군에서 IL-6의 단백질 발현 수준에는 변함이 없었으나 IL-1β의 단백질 발현 수준은 감소하였다.
반면 양성 대조군으로 염증치료제로 이용되고 있는 dexamethasone을 시간에 따라 처리한 결과, dexamethasone 처리 군은 LPS 처리 후 시간이 증가함에 따라 TNFα의 단백질 발현수준을 억제시키는 것을 확인하였다.
1A에서 보는 바와 같이 황금열수추출물 군에서도 지표물질인 바이칼린과 같은 위치에서 밴드가 검출됨을 확인할 수 있었다. 보다 정확하게 바이칼린을 정성하기 위하여 다음에는 HPLC를 이용하여 분석한 결과 Fig. 1B 및 Table 1에서 보는 바와 같이 12.135분에서 지표물질 바이칼린군과 황금열수추출물군에서 바이칼린 peak가 검출되었다. 이번에는 황금열수추출물에 함유되어 있는 절대 바이칼린 함량을 정량하기 위하여 HPLC를 이용하여 바이카린 지표물질 10, 25, 50, 100 mg/ml의 농도로 검량곡선을 Fig.
따라서 정상적인 수준의 염증반응을 유지하는 것이 매우 중요하다. 본 연구에서 황금열수추출물은 LPS로 자극된 Raw264.7 세포에서 농도가 증가함에 따라 macrophage의 식균작용과 NO 생성을 유의성 있게 억제하였다. 이전의 연구는 황금열수추출물이 macrophage의 NO 생성을 억제한다고 보고했으며 우리의 연구결과와도 일치한다[11, 20].
135분에서 지표물질 바이칼린군과 황금열수추출물군에서 바이칼린 peak가 검출되었다. 이번에는 황금열수추출물에 함유되어 있는 절대 바이칼린 함량을 정량하기 위하여 HPLC를 이용하여 바이카린 지표물질 10, 25, 50, 100 mg/ml의 농도로 검량곡선을 Fig. 1C에서와 같이 그리고 황금열수추출물의 결과를 삽입하여 바이칼린의 절대함량을 구한 결과 Table 2에서와 같이 42.2 mg/g 바이칼린이 함유되어 있는 것으로 나타났다.
황금열수추출물에 함유되어 있는 바이칼린을 정성하기 위하여 박층크로마토 그래피를 수행한 결과 Fig. 1A에서 보는 바와 같이 황금열수추출물 군에서도 지표물질인 바이칼린과 같은 위치에서 밴드가 검출됨을 확인할 수 있었다. 보다 정확하게 바이칼린을 정성하기 위하여 다음에는 HPLC를 이용하여 분석한 결과 Fig.
황금열수추출물은 LPS 처리 전과 비교하여 LPS 처리 후 TNFα의 단백질 발현 수준이 약간 높지만 대조군과 비교하였을때 TNFα의 단백질 발현 수준이 낮게 조절되었음을 확인하였다.
후속연구
이러한 결과는 황금열수추출물이 외부 자극으로부터 세포를 보호하고 체내에 과도한 염증반응을 억제하여 노화의 진행을 억제한다고 나타낸다. 따라서 황금열수추출물이 외부 스트레스로부터 몸을 보호하고 과도한 염증을 막음으로써 적절한 면역수준을 유지하여 신체를 젊고 건강하게 하는 건강식품으로의 개발이 기대된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
정상적인 수준의 염증반응이 중요한 까닭은 무엇인가?
염증반응은 외부 항원의 체내로의 침입과 손상된 세포 및 조직의 제거를 위해 필수적인 과정이지만, 과도한 염증반응은 주변 조직손상과 질병의 악화를 초래하고 종양의 성장을 돕는다[6]. 또한 염증반응에서 생성되는 NO 혹은 superoixde와 같은 활성 질소, 산소종에 의해 체내 세포 및 조직 손상이 일어나고 이것이 다시 염증의 원인이 되어 끊임없이 염증반응이 일어나게 된다[18]. 따라서 정상적인 수준의 염증반응을 유지하는 것이 매우 중요하다.
염증은 무엇인가?
염증은 외부로부터 박테리아나 바이러스와 같은 외부 항원이 체내로 침입하거나 세포나 조직이 어떠한 원인에 의하여 손상 받았을 때 그 손상에 대한 조직 반응을 일컫는다[15]. 염증세포는 종양의 개시 및 증진에서 DNA 손상을 야기하는 활성 질소 및 산소 종과 같은 다양한 염증전 매개인자를 방출한다[5].
만성염증이 일어날 경우 나타나는 기전은 무엇인가?
염증세포는 종양의 개시 및 증진에서 DNA 손상을 야기하는 활성 질소 및 산소 종과 같은 다양한 염증전 매개인자를 방출한다[5]. 염증은 크게 급성염증(acute inflammatory)과 만성염증(chronic inflammatory)으로 분류되며, 만성적으로 염증반응이 일어날 경우 염증전 cytokines과 chemokines이 과도하게 방출되어 주변 조직 손상과 더불어 종양세포의 내습, 전이, 이전 그리고 혈관신생을 증진시켜 종양의 성장을 돕는다[5, 12]. 림프구에서 분비되는 interleukin (IL)은 다양한 종류와 기능이 알려져 있으며 특히 Interleukin-1β (IL-1 β)와 -6 (IL-6)는 급성염증과 만성염증을 매개하는 인자이다.
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