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문제 정의
- HYS이 혈중 지질수치 개선에 더욱 유의한 효과를 보인 결과를 토대로 지질대사의 조절 기전을 더 구체적으로 알아보고자 콜레스테롤과 지방산 합성에 관여하는 유전자들의 발현을 조절하는 전사인자인 SREBP-1의 활성에 대한 HYS의 효과를 확인해 보았다. 그 결과, 대조군에서 SREBP-1 활성이 정상군에 비해 유의하게 증가하였으며, 실험군은 HYS 50 mg 투여군에서 유의성 있게 줄어든 결과를 보였다(Fig.
- 回春凉膈散의 고혈당 및 고지혈증 완화효과에 대한 구체적 기전을 알아보기 위해 세포 에너지 대사 과정에서 중추적 역할을 하는 SIRT1과 AMPK를 중심으로 그 하위 기전에 해당하는 지표들의 발현 변화를 확인해 보았다.
- 이에 본 연구에서는 db/db 마우스에서 回春凉膈散의 당 및 지질대사 장애 개선효과를 관찰하고, 그 생화학적 기전이 SIRT1, AMPK 및 SREBP-1발현 조절을 중심으로 함을 확인한 바 이에 보고하는 바이다.
- 이에 비만 및 그와 관련된 여러 합병증의 예방과 치료에 이상의 여러 부작용들을 최소화하면서 당및 지질대사를 효율적으로 조절할 수 있는 치료제가 필요한 실정으로, 본 연구에서는 回春凉膈散의 활용가능성을 검토해 보았다.
제안 방법
- Band density는 ATTO Densitograph Software(ATTO Corporation, Tokyo, Japan)로 측정하여 histone 또는 β-actin과의 비율로 정량하였다.
- NIH#3(샘타코바이오코리아) 먹이와 물을 자유롭게 섭취하도록하였으며, 2주간 일정한 온도(23±1 ℃), 습도(약 60%)와 밤낮주기(12시간씩)가 유지되는 환경에 적응시킨 후 18마리의 db/db 마우스는 체중과 혈당을 측정하여 각 군의 평균 체중과 혈당이 거의 동일하게 3군(n=6)으로 나누어 정상군(db/m 마우스, n=6) 포함 총 4군으로 배정하였다.
- SIRT1, AMPK, SREBP-1, ACCα, histone, β-actin을 확인하기 위해 각각의 단백질을 8% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)를 통해 전기영동 시켰다.
- 실온에서 10분씩 3번 TBST로 membrane을 washing한 후, 2차 항체(horseradish peroxidase-conjugated donkey anti-rabbit antibody; 1:5,000)를 5%의 탈지분유가 들어있는 TBST에 희석(1:2,000)하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. TBST로 washing한 후 enhanced chemiluminescence(Amersham)로 Hyperfilm(Amersham)에 노출시킨 후 단백질의 발현 정도를 분석하였다. Band density는 ATTO Densitograph Software(ATTO Corporation, Tokyo, Japan)로 측정하여 histone 또는 β-actin과의 비율로 정량하였다.
- 回春凉膈散이 특히 지질대사에 강한 조절력을 보임에 따라 지질합성 유전자의 발현을 촉진하는 전사 인자이면서 SIRT1과 AMPK로부터 그 활성이 직접적으로 억제되는 SREBP-1의 활성과 지방산 합성의 주요 효소인 ACCα의 발현변화를 관찰해 보았다.
- 고혈당과 함께 비만으로 인해 초래되는 고지혈증에 대한 HYS의 개선효과를 확인하기 위해 db/db 마우스에서 혈청 triglyceride를 측정하였다. 정상군(106.
- 비만으로 인한 당 및 지질대사 이상에 대해 回春凉膈散의 효과 및 대사조절 기전을 db/db 마우스에서 알아본 결과, 고혈당과 고중성지방혈증을 개선 완화하는 효과를 관찰하였고, 당 및 지질대사를 효율적으로 조절하였으며, 특히 지질 대사에 대한 개선효과가 더욱 유의함을 확인한 바 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 回春凉膈散(Table 1) 1첩 분량 35 g에 물 600 ml를 가하여 3시간 동안 전탕하였다. 전탕액을 여과지(Whatman NO.2, Maidstone, England)로 여과한 뒤, Evaporator(BUCHI, Switzerland)를 이용하여 감압 농축한 후, 동결 건조하여 얻은 분말을 생리식염수에 희석하여 실험동물에 경구투여하였다.
- NIH#3(샘타코바이오코리아) 먹이와 물을 자유롭게 섭취하도록하였으며, 2주간 일정한 온도(23±1 ℃), 습도(약 60%)와 밤낮주기(12시간씩)가 유지되는 환경에 적응시킨 후 18마리의 db/db 마우스는 체중과 혈당을 측정하여 각 군의 평균 체중과 혈당이 거의 동일하게 3군(n=6)으로 나누어 정상군(db/m 마우스, n=6) 포함 총 4군으로 배정하였다. 정상군과 대조군에게는 생리식염수를, Hoechunyanggyeok-san(HYS) 투여군에는 HYS 추출물 10 또는 50 mg/kg body weight을 2주간 매일 경구투여 하였다. 투여 종료 후 마취상태에서 심장천자를 통해 모든 마우스의 혈액을 채취하였고, 간은 빠르게 적출하여 액체 질소에 냉동한 뒤 -80 ℃에서 보관하였다.
대상 데이터
- Polyvinylidene difluoride(PVDF) membranes는 Millipore Corporation(Bedford, MA, USA)에서 구입하였고, β-actin, histone, SREBP-1, ACCα, SIRT1, AMPK의 항체는 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였다.
- Polyvinylidene difluoride(PVDF) membranes는 Millipore Corporation(Bedford, MA, USA)에서 구입하였고, β-actin, histone, SREBP-1, ACCα, SIRT1, AMPK의 항체는 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였다. 모든 혈청 분석에 사용된 kit는 신양화학(부산, 한국)에서 구입하였고, 이 외에 모든 시약은 Sigma Aldrich(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 약재는 휴먼허브(대구, 한국)에서 구입하여 사용하였다. 回春凉膈散(Table 1) 1첩 분량 35 g에 물 600 ml를 가하여 3시간 동안 전탕하였다.
- 생후 12주령 된 수컷 db/db 마우스 (C57BL/KsJ) 18마리와 db/m 마우스 6마리를 샘타코바이오코리아(오산, 한국)로부터 공급받았다. NIH#3(샘타코바이오코리아) 먹이와 물을 자유롭게 섭취하도록하였으며, 2주간 일정한 온도(23±1 ℃), 습도(약 60%)와 밤낮주기(12시간씩)가 유지되는 환경에 적응시킨 후 18마리의 db/db 마우스는 체중과 혈당을 측정하여 각 군의 평균 체중과 혈당이 거의 동일하게 3군(n=6)으로 나누어 정상군(db/m 마우스, n=6) 포함 총 4군으로 배정하였다.
데이터처리
- Significantly different from vehicle-treated db/db mice values by Dunnett's t-test (** p<0.01).
- 실험결과는 평균과 표준편차(mean±SD)로 표기하였으며, SPSS 18.0 for Windows program을 사용하여 one-way analysis of variance(ANOVA)를 실시하여 유의수준 p-value<0.05에서 Dunnett's t-test의 다중검정을 하였다.
이론/모형
- HYS의 당 및 지질대사 조절 기전을 구체적으로 탐구하기 위해 SIRT1과 상호촉진 작용을 통해 세포대사를 조절하는 AMPK의 발현정도를 Western blotting을 통해 확인하였다. 그 결과, 정상군에 비해 대조군에서 SIRT1의 발현이 유의하게 감소하였고, 실험군은 HYS 10, 50 mg 투여군 모두에서 정상군에 가까운 발현을 보였다(Fig.
- 심장에서 채혈한 혈액을 원심분리하여 혈청을 얻었다. 혈청 glucose, triglyceride는 glucose, triglyceride assay kit를 사용하여 제작사(신양화학)의 protocol에 따라 측정하였다. 혈청 샘플 5 μl에 시약 200 μl를 첨가한 후 37 ℃에서 5분간 incubate 한 뒤 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
성능/효과
- 3A). AMPK의 발현정도를 확인해 본 결과에서는, 유의성은 없었으나 대조군에 비해 HYS 투여군에서 농도의존적으로 발현이 증가하는 경향을 보였다(Fig. 3B).
- SREBP-1의 하위 표적 효소인 ACCα 발현에 대한 HYS의 효과를 확인해 본 결과에서는, SREBP-1과 마찬가지로 대조군에서 ACCα 발현이 정상군에 비해 유의하게 증가하였다.
- 回春凉膈散은 SIRT1과 AMPK의 촉진 및 그에 따른 SREBP-1과 ACCα의 억제에 의하여 당 및 지질대사 이상을 개선함으로써 혈당과 혈중 중성 지방 수치를 감소시키는 효과를 보였다.
- HYS이 혈중 지질수치 개선에 더욱 유의한 효과를 보인 결과를 토대로 지질대사의 조절 기전을 더 구체적으로 알아보고자 콜레스테롤과 지방산 합성에 관여하는 유전자들의 발현을 조절하는 전사인자인 SREBP-1의 활성에 대한 HYS의 효과를 확인해 보았다. 그 결과, 대조군에서 SREBP-1 활성이 정상군에 비해 유의하게 증가하였으며, 실험군은 HYS 50 mg 투여군에서 유의성 있게 줄어든 결과를 보였다(Fig. 4).
- HYS의 당 및 지질대사 조절 기전을 구체적으로 탐구하기 위해 SIRT1과 상호촉진 작용을 통해 세포대사를 조절하는 AMPK의 발현정도를 Western blotting을 통해 확인하였다. 그 결과, 정상군에 비해 대조군에서 SIRT1의 발현이 유의하게 감소하였고, 실험군은 HYS 10, 50 mg 투여군 모두에서 정상군에 가까운 발현을 보였다(Fig. 3A). AMPK의 발현정도를 확인해 본 결과에서는, 유의성은 없었으나 대조군에 비해 HYS 투여군에서 농도의존적으로 발현이 증가하는 경향을 보였다(Fig.
- 먼저 db/db 마우스에서 SIRT1과 AMPK의 발현량을 Western blotting을 통해 확인해 본 결과, 대조군에서 SIRT1의 발현이 줄어든 반면 回春凉膈散 투여군에서는 정상군에 가까운 발현을 보였고, AMPK의 경우는 유의성은 없었으나 回春凉膈散의 투여 농도가 증가함에 따라 그 발현량이 늘어나는 경향을 보였다.
- 본 실험에서는 SREBP-1의 활성이 정상군에 비해 유의하게 증가되어 지질 합성이 항진되어 있는 것으로 보이는 대조군과 달리, 回春凉膈散 투여군에서는 SREBP-1 활성과 ACCα 발현이 모두 줄어든 결과를 보였다.
- 비만으로 인해 제 2형 당뇨병이 초래되는 모델인 db/db 마우스에 回春凉膈散을 2주간 투여하여 고혈당 및 고지혈증에 대한 개선 효과를 관찰할 수 있었고, 그 중에서도 특히 혈중 중성지방의 감소효과가 더욱 유의함을 확인하였다. 이로써 回春凉膈散이 당 및 지질대사를 유의하게 조절하는 효과가 있음을 알 수 있었다.
- 비만으로 인해 초래되는 고혈당에 대한 HYS의 효과를 확인하기 위해 혈청 glucose를 측정해본 결과, 실험시작 시 104.52±3.49 mg/dl에서 118.49±5.30 mg/dl로의 변화를 보인 정상군에 비해 대조군에서는 475.05±39.51 mg/dl에서 596.97±10.66 mg/dl로 현저한 증가를 보였다.
- 이로써 HYS은 AMPK보다는 SIRT1의 발현활성을 통한 신호전달에 더 많은 영향을 미쳐 당 및 지질대사에 대한 조절효능을 가짐을 알 수 있었다. 回春凉膈散이 특히 지질대사에 강한 조절력을 보임에 따라 지질합성 유전자의 발현을 촉진하는 전사 인자이면서 SIRT1과 AMPK로부터 그 활성이 직접적으로 억제되는 SREBP-1의 활성과 지방산 합성의 주요 효소인 ACCα의 발현변화를 관찰해 보았다.
- 이로써 HYS은 SREBP-1 활성을 억제해 지질대사를 조절함을 알 수 있었으며, 아울러 결과 3에서 SREBP-1의 활성을 직접적으로 억제하는 SIRT1과 AMPK의 발현이 촉진된 결과와 유관하다 하겠다.
- 이로써 HYS이 SREBP-1 활성억제를 통해 ACCα 발현을 낮춤으로써 지질 합성을 효과적으로 제어하고 지방산 산화를 촉진함을 알 수 있었다.
- 이로써 回春凉膈散은 SIRT1과 AMPK의 촉진 및 그에 따른 SERBP-1 활성과 ACCα 발현 억제를 통해 동화작용에서 이화작용으로의 대사를 활성화시킴으로써 포도당 및 지방 대사장애를 개선하는데 유효한 효과가 있고, 특히 SIRT1, SREBP-1, ACC를 주축으로 하는 신호전달경로를 통해 지질대사를 효과적으로 조절함을 알 수 있었다(Fig. 6).
- 비만으로 인해 제 2형 당뇨병이 초래되는 모델인 db/db 마우스에 回春凉膈散을 2주간 투여하여 고혈당 및 고지혈증에 대한 개선 효과를 관찰할 수 있었고, 그 중에서도 특히 혈중 중성지방의 감소효과가 더욱 유의함을 확인하였다. 이로써 回春凉膈散이 당 및 지질대사를 유의하게 조절하는 효과가 있음을 알 수 있었다.
- 이상의 결과를 통해 HYS이 비만으로 유발되는 고혈당 및 고지혈증을 완화하는 효능이 있음을 알 수 있었고, 특히 지질수치를 개선하는데 더욱 유의한 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
- SREBP-1의 하위 표적 효소인 ACCα 발현에 대한 HYS의 효과를 확인해 본 결과에서는, SREBP-1과 마찬가지로 대조군에서 ACCα 발현이 정상군에 비해 유의하게 증가하였다. 이에 비해 실험군은 HYS 50 mg 투여군에서 정상군 수준에 가까운 발현을 보여 유의한 감소효과를 확인하였다(Fig. 5).
- 이에 비해 실험군의 경우 HYS 10 mg 투여군은 473.13±42.64 mg/dl에서 525.49±22.57 mg/dl, 50 mg 투여군에서는 474.95±42.76 mg/dl에서 408.16±56.00 mg/dl로의 변화를 보여 투여 종료 후 대조군에 비해 유의하게 낮은 수준을 보였고 HYS 50 mg 투여군은 투여 전에 비해 혈청 glucose가 현저하게 감소하였다(Fig. 1).
- 정상군(106.94±6.69 mg/dl)과 비교하여 182.67±18.70 mg/dl로 뚜렷한 증가를 보인 대조군에 비해 실험군은 HYS 10 mg 투여군에서 125.00±10.56 mg/dl, 50 mg 투여군에서 109.17±9.39 mg/dl로 통계적으로 유의하게 감소하였다(Fig. 2).
후속연구
- 비만으로 인해 유발된 고혈당에 대한 回春凉膈散의 저하효과는 확인하였으나 당대사와 관련한 실험은 부족하였다. 따라서 향후 구체적인 기전 연구를 통해 回春凉膈散의 고지질혈증, 고혈당 조절 효과에 관한 실험적 결과를 마련하여 비만, 당뇨병 및 그로 인한 합병증 치료에 있어 回春凉膈散의 임상적 활용에 관한 객관적인 근거를 확고히 해야할 것으로 사료된다.
- 이로써 回春凉膈散은 비만에서의 탄수화물 및 지질대사 이상을 교정함으로써, 비만으로 초래되는 대사성 질환의 치료 및 예방에 응용될 수 있을 것으로 사료된다.
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