고체상 추출과 친화 크로마토 그라피-유도결합 플라즈마 질량분석법을 이용한 한국인 혈청에서의 셀레노 단백질 정량 Quantification of seleno proteins in Korean blood serum using solid phase extraction and affinity chromatography-inductively coupled plasma/mass spectrometry원문보기
본 연구에서는 음이온 고체상 추출법 (AE SPE; anion exchange solid phase extraction)을 사용하여 간섭요인을 제거한 후, 친화 크로마토그래피AF HPLC; affinity high performance liquid chromatography)와 유도결합 플라스마 질량분석법 (ICP/MS; inductively coupled plasma/mass spectrometry)을 사용하여 한국인의 혈청에서의 셀레노 단백질을 분리하고 정량하였다. 먼저 동위원소 희석법으로 셀레늄 총량을 분석한 결과, 건강한 한국 사람의 혈청내 평균농도는 $94.3{\pm}2.3ngg^{-1}$ 이었다. AE SPE와 AF 컬럼을 online으로 연결하여 셀레노단백질인 glutathione peroxidase (GPx), selenoprotein P (SelP), selenoalbumin (SeAlb)을 분리하고, 후 컬럼 동위원소 희석법 (PC ID; post column isotope dilution)으로 정량하였다. 혈청 인증표준물인 BCR-637을 분석한 결과 전체 셀레노 단백질의 합은 $85.4{\pm}3.4ngg^{-1}$으로 문헌값인 $81{\pm}7ngg^{-1}$과 일치하는 결과를 얻을 수 있었다. 20 명의 건강한 한국인의 혈청에서 얻은 셀레노 단백질 GPx, SelP 및 SeAlb 의 농도는 각각 $12.1{\pm}1.4ngg^{-1}$, $57.2{\pm}2.0ngg^{-1}$, 그리고 $20.0{\pm}1.9ngg^{-1}$ 이었으며 이들의 합인 $89.3ngg^{-1}$은 셀레늄의 총량값인 $94.3ngg^{-1}$과 거의 같은 값으로 혈청에서의 셀레늄은 주로 셀레노 단백질로 구성되어 있음을 알았다. 이 중 GPx의 농도는 간섭을 제거하기 전인 $25.0ngg^{-1}$에 비해 50% 이상 크게 감소하였는데 이로서 간섭은 주로 GPx에 포함되어 있음을 확인할 수 있었다. AE SPE는 간섭요인인 Cl과 Br을 제거 하는데 매우 효과적임을 보여주었다.
본 연구에서는 음이온 고체상 추출법 (AE SPE; anion exchange solid phase extraction)을 사용하여 간섭요인을 제거한 후, 친화 크로마토그래피 AF HPLC; affinity high performance liquid chromatography)와 유도결합 플라스마 질량분석법 (ICP/MS; inductively coupled plasma/mass spectrometry)을 사용하여 한국인의 혈청에서의 셀레노 단백질을 분리하고 정량하였다. 먼저 동위원소 희석법으로 셀레늄 총량을 분석한 결과, 건강한 한국 사람의 혈청내 평균농도는 $94.3{\pm}2.3ngg^{-1}$ 이었다. AE SPE와 AF 컬럼을 online으로 연결하여 셀레노단백질인 glutathione peroxidase (GPx), selenoprotein P (SelP), selenoalbumin (SeAlb)을 분리하고, 후 컬럼 동위원소 희석법 (PC ID; post column isotope dilution)으로 정량하였다. 혈청 인증표준물인 BCR-637을 분석한 결과 전체 셀레노 단백질의 합은 $85.4{\pm}3.4ngg^{-1}$으로 문헌값인 $81{\pm}7ngg^{-1}$과 일치하는 결과를 얻을 수 있었다. 20 명의 건강한 한국인의 혈청에서 얻은 셀레노 단백질 GPx, SelP 및 SeAlb 의 농도는 각각 $12.1{\pm}1.4ngg^{-1}$, $57.2{\pm}2.0ngg^{-1}$, 그리고 $20.0{\pm}1.9ngg^{-1}$ 이었으며 이들의 합인 $89.3ngg^{-1}$은 셀레늄의 총량값인 $94.3ngg^{-1}$과 거의 같은 값으로 혈청에서의 셀레늄은 주로 셀레노 단백질로 구성되어 있음을 알았다. 이 중 GPx의 농도는 간섭을 제거하기 전인 $25.0ngg^{-1}$에 비해 50% 이상 크게 감소하였는데 이로서 간섭은 주로 GPx에 포함되어 있음을 확인할 수 있었다. AE SPE는 간섭요인인 Cl과 Br을 제거 하는데 매우 효과적임을 보여주었다.
Interferences were removed using anion exchange solid phase extraction (AE SPE) in quantification of selenoproteins in Korean human blood serum with affinity high performance liquid chromatography (AF HPLC)-inductively coupled plasma/mass spectrometry (ICP/MS). The average selenium level obtained fo...
Interferences were removed using anion exchange solid phase extraction (AE SPE) in quantification of selenoproteins in Korean human blood serum with affinity high performance liquid chromatography (AF HPLC)-inductively coupled plasma/mass spectrometry (ICP/MS). The average selenium level obtained for healthy Koreans was $94.3{\pm}2.3ngg^{-1}$ using isotope dilution method. AE SPE was coupled to AF column to separate 3 selenoproteins, glutathione peroxidase GPx, selenoprotein SelP, and selenoalbumin SeAlb. Post column isotope dilution was employed to quantify the proteins. The certified reference material of human blood serum BCR-637 was analyzed to give total selenoprotein concentration of $85.4{\pm}3.4ngg^{-1}$, which agreed well with the reference value of $81{\pm}7ngg^{-1}$. The pooled concentration of GPx, SelP, and SeAlb from healthy Koreans (n=20) was $12.1{\pm}1.4ngg^{-1}$, $57.2{\pm}2.0ngg^{-1}$, and $20.0{\pm}1.9ngg^{-1}$, respectively. The sum of selenoproteins is $89.3ngg^{-1}$, which is about the same as the total selenium concentration of $94.3ngg^{-1}$. The fact suggests that selenium in blood serum is mostly consisted of selenoproteins. After the removal of interference, GPx showed a significant decrease (more than 50%) from $25.0ngg^{-1}$ to $12.1ngg^{-1}$. It was identified that the interference in blood serum was mostly from GPx and the use of AE SPE was proven to be efficient in eliminating Cl and Br that cause interference to GPx.
Interferences were removed using anion exchange solid phase extraction (AE SPE) in quantification of selenoproteins in Korean human blood serum with affinity high performance liquid chromatography (AF HPLC)-inductively coupled plasma/mass spectrometry (ICP/MS). The average selenium level obtained for healthy Koreans was $94.3{\pm}2.3ngg^{-1}$ using isotope dilution method. AE SPE was coupled to AF column to separate 3 selenoproteins, glutathione peroxidase GPx, selenoprotein SelP, and selenoalbumin SeAlb. Post column isotope dilution was employed to quantify the proteins. The certified reference material of human blood serum BCR-637 was analyzed to give total selenoprotein concentration of $85.4{\pm}3.4ngg^{-1}$, which agreed well with the reference value of $81{\pm}7ngg^{-1}$. The pooled concentration of GPx, SelP, and SeAlb from healthy Koreans (n=20) was $12.1{\pm}1.4ngg^{-1}$, $57.2{\pm}2.0ngg^{-1}$, and $20.0{\pm}1.9ngg^{-1}$, respectively. The sum of selenoproteins is $89.3ngg^{-1}$, which is about the same as the total selenium concentration of $94.3ngg^{-1}$. The fact suggests that selenium in blood serum is mostly consisted of selenoproteins. After the removal of interference, GPx showed a significant decrease (more than 50%) from $25.0ngg^{-1}$ to $12.1ngg^{-1}$. It was identified that the interference in blood serum was mostly from GPx and the use of AE SPE was proven to be efficient in eliminating Cl and Br that cause interference to GPx.
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문제 정의
따라서 정확한 셀레노 단백질 정량을 위해서는 동중간섭을 제거하거나 시료준비과정에서 간섭이온들을 제거할 필요성이 있으므로 본 연구에서는 AE SPE를 컬럼을 사용하여 간섭이온을 제거하였다. 양이온에 의한 간섭은 크지 않거나 m/z를 잘 선택하면 배제할 수 있으므로 본 연구에서는 음이온에 대한 간섭을 집중적으로 연구하였다. AE SPE는 Cl−과 Br−을 선택적으로 제거하며 셀레노단백질이 머무르지 않기 때문에 따로 용리과정이 필요 없으며 시료가 희석되지 않는 장점이 있다.
제안 방법
이 분석법을 건강한 한국인의 혈청시료에 대하여 적용하였고 그 결과를 다음의 Table 5에 나타내었다. AE SPE를 사용하여 혈청 시료 속의 간섭요인을 제거하였을 때와 제거하지 않았을 때를 비교 하였다. 간섭 요인을 제거하기 전 (NO SPE)의 GPx의 양은 25.
AF HPLC에서는 HEP와 BLUE 컬럼을 사용하였다. 먼저 GPx와 albumin의 표준 시료를 이용하여 흐름속도와 주입시료의 부피등, 분리를 위한 최적 조건을 설정하고 혈청 시료 속의 셀레노 단백질을 분리하였다.
음이온들은 선택적으로 컬럼에 붙잡히지만 셀레노 단백질들은 SPE 카트리지를 통과한 후에 분석컬럼으로 들어가게 된다. Off-line으로 분석할 경우는 SPE 카트리지를 통과시킨 용출액을 모아 희석하지 않은 채로 분석하였다.
2). 따라서 본격적인 분리 및 정량에는 다음의 AF HPLC를 사용하였다.
혈청에는 아연, 철과 같은 양이온과 Br− , Cl− , SO42−,및 PO43−등의 음이온 많이 존재하며 이 들은 셀레늄의 측정에 동중간섭을 일으키게 된다. 따라서 정확한 셀레노 단백질 정량을 위해서는 동중간섭을 제거하거나 시료준비과정에서 간섭이온들을 제거할 필요성이 있으므로 본 연구에서는 AE SPE를 컬럼을 사용하여 간섭이온을 제거하였다. 양이온에 의한 간섭은 크지 않거나 m/z를 잘 선택하면 배제할 수 있으므로 본 연구에서는 음이온에 대한 간섭을 집중적으로 연구하였다.
6 mm, CE Healthcare Bio-Sciences AB, Sweden)를 사용하였고, 두 개의 컬럼을 연결하기 위해 six-way 밸브(Rheodyne, Model 9725i)를 사용하였다. 또한 셀레노단백질을 크기로서 분리하기 위해 SuperdexTM 75 PC 3.2/30 컬럼 (Pharmacia, Uppsala, Sweden)을 사용하였다.
AF HPLC에서는 HEP와 BLUE 컬럼을 사용하였다. 먼저 GPx와 albumin의 표준 시료를 이용하여 흐름속도와 주입시료의 부피등, 분리를 위한 최적 조건을 설정하고 혈청 시료 속의 셀레노 단백질을 분리하였다. Six-way 밸브에 연결한 HEP과 BLUE 컬럼을 이용하여 셀레노 단백질을 분리하기 위한 방법은 기존연구23에 따른 것으로 다음과 같이 Fig.
먼저 SEC 컬럼을 이용하여 혈청 시료 속의 셀레노 단백질을 분리하여 보았다. SEC 컬럼에서 용질의 크기가 크면 클수록 더 빨리 통과되므로 크기가 가장 큰 GPx (~90 kDa)가 제일 먼저 나타나고 그 뒤에 SeAlb (~66 kDa)과 SelP (~57 kDa)의 순서로 나타난다.
먼저 표준물질인 CRM을 이용하여 혈청 시료 속의 간섭 매트릭스의 제거한 후에 셀레노 단백질의 종별 정량법의 정확성을 확인하였다. 사용된 CRM은 BCR637 (Se certified 81 ± 7 ng mL−1, IRMM, Geel, Belgium)로서 그 결과는 다음의 Table 4에 나타내었다.
먼저 혈청에서 AE SPE를 이용한 음이온의 제거 후와 제거 전에 측정한 셀레늄 총량을 비교하였다. 검정 선법 (EC; external calibration curve)과 동위원소 희석법 (ID; isotope dilution method)을 모두 사용하여 비교하였다.
본 연구에서는 AE SPE를 사용하여 음이온 매트릭스를 제거한 뒤에 AF HPLC와 ICP/MS를 결합하여 대표적인 생체 시료인 혈청 시료에서 셀레노 단백질을 분리하고 정량하였다. AE SPE는 혈청 속 간섭요인 특히 GPx에서의 Cl− 과 Br−을 제거 하는데 효과적이었다.
GPx는 이 두 컬럼에 붙잡히지 않으므로 초기에 용리되어 분리된다. 본 연구에서는 AE SPE를 앞부분에 장착하여 사용하였다.
즉, 매트릭스에 과량 존재하는 Cl−(40Ar37Cl on 77Se) 또는 Br−(81Br1H on 82Se)과 반응하여 동중분자들을 만들어 셀레늄의 측정에 간섭하게 된다. 본 연구에서는 on-line 및 off-line SPE로 매트릭스를 제거하고 AFHPLC-ICP/MS를 이용하여 한국인의 혈청에서의 셀레노 단백질들을 분리하여 검출하였고 정확한 정량분석을 위하여서는 후 컬럼 동위원소 희석법을 사용하였다.
본 연구에서는 음이온 교환수지가 채워져 있는 SPE를 컬럼에 on-line으로 연결하거나 또는 off-line으로 간섭이온을 제거하였다. 두 방법 모두 가능하며 본 연구에 사용해 보았으나 결과의 차이는 없었다.
셀레노단백질을 분리하기 위해 Heparin Sepharose (HEP)와 Blue Sepharose(50 mm × 4.6 mm, CE Healthcare Bio-Sciences AB, Sweden)를 사용하였고, 두 개의 컬럼을 연결하기 위해 six-way 밸브(Rheodyne, Model 9725i)를 사용하였다.
오염을 최소화하기 위하여 clean booth내에서 실험을 진행하였으며 실험에 사용한 모든 용기와 기구는 산세척 후 탈 이온수로 세척, 건조하여 사용하였다. 별도로 기술되지 않은 시약들은 가능한 최고 순도의 분석급 또는 이와 동일한 순도의 제품을 사용하였다.
채혈된 시료는 항응고제인 헤파린이 포함된 tube에 보관하였으며 1789 xg으로 10 분간 원심 분리하여 상등액을 취한 후 별도의 전처리 과정 없이 0.45 µm 필터로 걸러서 분석하였다.
단백질 표준 용액 (GPx from bovine erythrocytes, Albumin from human serum, Sigma-Aldrich)을 탈 이온수에 묽혀 사용하였다. Human serum CRM은 BCR-637 serum (IRMM, Geel, Belgium)을 사용하였다.
02 mg g−1)를 2% HNO3에 묽혀 사용하였다. 단백질 표준 용액 (GPx from bovine erythrocytes, Albumin from human serum, Sigma-Aldrich)을 탈 이온수에 묽혀 사용하였다. Human serum CRM은 BCR-637 serum (IRMM, Geel, Belgium)을 사용하였다.
사용된 CRM은 BCR637 (Se certified 81 ± 7 ng mL−1, IRMM, Geel, Belgium)로서 그 결과는 다음의 Table 4에 나타내었다.
셀레노단백질 분석을 위해 사용한 ICP/MS는 팔중 극자 반응셀이 장착된 7500 ce Model (Agilent, Japan)이었다. HPLC pump는 Alltech의 Model 626 dual pump (Alltech, USA)을 사용하였으며, 시료 주입 밸브는 Rheodyne Model 7125 (Cotati, CA, USA)가 사용되었다.
, USA) 탈 이온수를 사용하였다. 용기의 세척과 시료에 사용한 질산(HNO3)은 동우화인켐사에서 구입한 반도체급 시약을 사용하였다. Methanol은 99.
혈청 시료 속의 셀레노단백질을 분리 및 정량하기 위하여 먼저 SEC를 사용하였고 그 다음에 AFC를 이용하였다. 먼저 SEC에 대한 최적의 조건들을 찾아 이 동상은 5% MeOH와 ammonium acetate 50 mM을 pH 7.
혈청 시료는 한국교원대학교 보건소로부터 충북 청주 지역에 거주하는 20-30 대의 건강한 성인의 혈청을 제공받았다. 채혈된 시료는 항응고제인 헤파린이 포함된 tube에 보관하였으며 1789 xg으로 10 분간 원심 분리하여 상등액을 취한 후 별도의 전처리 과정 없이 0.
데이터처리
먼저 혈청에서 AE SPE를 이용한 음이온의 제거 후와 제거 전에 측정한 셀레늄 총량을 비교하였다. 검정 선법 (EC; external calibration curve)과 동위원소 희석법 (ID; isotope dilution method)을 모두 사용하여 비교하였다. ID로 정량 시에는 78Se spike을 사용하여 78Se/80Se 비율을 측정하고 그 결과를 다음의 Table 3에 나타내었다.
이론/모형
ICP/MS의 최적 조건 (Table 1)은 선행연구22에 따라 사용하였고 SPE와 HPLC의 조건은 다음의 Table 2에 나타내었다.
성능/효과
이는 SelP와 SeAlb은 AF 컬럼에 의하여 붙잡힌 다음 용리되므로 다른 간섭이온들이 배제되는 한편, GPx는 컬럼을 그냥 통과하여 다른 간섭이온들 및 자유 아미노산과 함께 용리되기 때문이다. 결과적으로 GPx에 대부분의 간섭요인이 존재함을 알 수 있었으며 또한 AE SPE가 효과적으로 혈청 시료 속의 간섭요인을 제거하는 것을 보여준다.
기존의 실험조건16을 개선하여 (ammonium acetate 50 mM, pH 7.0) 30분 이내로 셀레노 단백질의 분리가 가능하였지만 분리능은 충분하지 못하였고 다시 좀더 약한 조건을 사용하여 0.05 M Tris-HNO3를 pH 7.40에 맞추고 0.1 mL min−1에서 3 개의 셀레노 단백질을 분리할 수 있었다.
4 ng g−1보다 훨씬 더 심하였다. 매트릭스이온들을 제거한 후에는 EC법과 ID법은 95% 신뢰수준에서 일치하는 결과를 보여준다. 결국 간섭이온들이 시료에 존재할 때에 검정곡선법은 큰 오차를 가져오게 된다는 것을 잘 보여주고 있다.
4)이다. 본 연구에서는 보다 더 효율적인 binding/elution 과정 방법을 적용하여 기존의 결과보다 크로마토그래피의 시간을 10분 가량 줄일 수 있었다. 즉, binding buffer로서 0.
시료주입량은 AE SPE-affinity 컬럼과 SEC 컬럼 모두 100 µL로 일정하게 유지하였다.
실험 결과는 85.4 ± 3.4 ng g−1로서 문헌치인 81 ± 7 ng g−1과 일치하며 본 연구의 AF HPLC-ICP/MS 분석법이 혈청의 정량분석에 잘 이용될 수 있음을 보여주고 있다.
이에 따라 미국 국립 암연구원은 셀레늄과 비타민 E를 함께 투여했을 때에 특정 암에 대하여 효과가 있는지를 검증하기 위한 대규모 연구 프로젝트 (SELECT; Selenium and Vit E cancer prevention trial)를 진행하였지만 2008년과 2011년 중간 결과 보고서를 통해 잠정적으로 암 예방에 큰 효과를 주지 못한다고 결론을 내렸다.10 하지만 이것은 미국에 사는 연구대상그룹이 이미 셀레늄섭취가 충분히 이루어져있기 때문에 억지로 셀레늄의 섭취를 늘려도 인체에서의 셀레노 단백질이 추가로 합성되거나 농도가 증가하지 않아 그 효과가 미미하다고 보인다.
후속연구
음이온들은 동중간섭을 일으키며 동시에 혈청에서는 셀레노 단백질 외에 SeMet같은 셀레노 아미노산 그리고 무기 셀레늄이 존재할 수 있기 때문이다. 따라서 좀 더 엄밀한 의미에서의 순수 GPx를 정량하려면 간섭하는 양이온 및 음이온, 그리고 자유 셀레늄 아미노산을 모두 제거한 뒤에 하여야 할 것이다.
본 연구를 통해 얻은 결과는 앞으로 건강한 한국인에 대하여 혈청에서의 셀레노 단백질의 기초값으로 사용될 수 있으며 한국인의 셀레늄의 영양상태를 모니터링하는데 사용될 수 있을 것이다. 또는 이를 이용하여 셀레노 단백질을 biomarker로 이용한 암의 진단 등 질병의 기초 진단에도 활용될 수 있을 것으로 기대한다.
AE SPE는 혈청 속 간섭요인 특히 GPx에서의 Cl− 과 Br−을 제거 하는데 효과적이었다. 본 연구를 통해 얻은 결과는 앞으로 건강한 한국인에 대하여 혈청에서의 셀레노 단백질의 기초값으로 사용될 수 있으며 한국인의 셀레늄의 영양상태를 모니터링하는데 사용될 수 있을 것이다. 또는 이를 이용하여 셀레노 단백질을 biomarker로 이용한 암의 진단 등 질병의 기초 진단에도 활용될 수 있을 것으로 기대한다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
셀레노 단백질의 분리와 분석에서 SEC의 단점은 무엇인가?
따라서 셀레노 단백질을 분리하고 높은 감도로 분석하기에는 HPLC-ICP/ MS 방법이 매우 효과적이다. 초기에는 크기배제 크로 마토 그라피 (SEC; size exclusion chromatography)를 사 용하여 분리하는 방법이 있으나 시간이 많이 걸리고 분해능이 높지 않은 단점이 있었다.14 본 연구에서도 기존의 방법을 개선하여 SEC-IPC/MS를 이용한 셀레노 단백질의 분리및 검출이 가능하였지만 여전히 분리능이 그렇게 높지 않았다.
셀레노단백질은 무엇인가?
셀레노단백질 (selenoprotein)은 셀레늄을 포함한 단백질로서 유전자적 명령에 의한 셀레노시스테인 (SeCys; selenocysteine)이 단백질내에 참여한 경우와 셀레늄이 아미노산의 황의 위치 (예; SeMet)에 무작위로 치환되어 포함되는 셀렌 포함 단백질 (selenium containing protein)이 있다. 본 논문에서는 두 가지 경우 다 셀레노 단백질이라고 부르고자 한다.
HPLC-ICP/ MS 방법이 셀레노 단백질을 분리하고 분석하는데 효과적인 이유는 무엇인가?
이 셀레노 단백질들을 정확히 정량분석 하는데 에는 몇 가지 어려운 점이 있는데 첫째는 그 농도가 매우 낮아서 분석에 어려운 점이 있다는 것이며 또한, 혈청에는 많은 다른 이온들이 공존하고 있기 때문에 심한 기질효과를 받는다는 것이다. 따라서 셀레노 단백질을 분리하고 높은 감도로 분석하기에는 HPLC-ICP/ MS 방법이 매우 효과적이다.
참고문헌 (26)
H. Reyes, L. J. M. Marchante, J. I. Alonso and A. Sanz- Medel, J. Anal. At. Spectrom., 18, 11-16 (2003).
B. Hurwitz, J. Klaus, and M. Llabre, Arch. Intern. Med., 167, 146-154 (2007).
M. Baum, G. Shor-Posner, and S. Lai, JAIDS, 15, 370- 374 (1997).
U. Peters, C. B. Foster, N. Chatterjee, A. Schatzkin, D. Reding, G. L. Andriole, E. D.Crawford, S. Sturup, S. J. Chanock and R. B. Hayes, Am. J. Clin. Nutr., 85, 209- 217 (2007).
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