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문제 정의
- 본 연구는 고콜레스테롤 식이를 급여한 마우스의 지질대사에 알긴산 올리고당이 미치는 영향을 조사하였다. 실험동물은 4주령 된 수컷 apoE 마우스를 사용하였으며, 정상군, 고콜레스테롤 식이대조군, 알긴산 올리고당 5%와 10% 첨가군으로 나누어 6주간 급여하였다.
- 본 연구는 식이 가능 미생물 Bacillus subtilis KCTC 11872BP 균주에 의해 생성된 저분자 알긴산 올리고당의 효능검정 연구의 일환으로, 알긴산 올리고당 섭취가 고콜레스테롤 식이를 공급받은 실험동물의 항비만 효과와 지질대사에 미치는 영향을 알아보았다.
제안 방법
- 본 실험에 사용한 식이는 AIN-93G 식이 조성에 준하여 제조하였다. 고콜레스테롤 식이는 기초식이에 콜레스테롤 1%를 첨가한 양만큼 사료의 양을 줄여 조제하고 실험식이(experimental diet)는 콜레스테롤 식이에 중량비율로 알긴산 올리고당 5%와 10%를 각각 혼합하여 제조하였다(Table 1). 체중은 일주일에 한 번씩 일정시간에 실험동물 저울(GF-2000, AND, Anyang, Korea)을 이용하여 측정하였으며, 식이섭취량은 일주일에 두 번씩 측정하여 공급하고 남은 식이를 4℃에서 냉장보관 하였다.
- 식이효율(food efficiency ratio, FER)은 전 체중증가량을 동일 기간 동안의식이섭취량으로 나누어 계산하였다. 배변량은 실험식이 급여기간 중 실험 6주째에 3일간 metabolic cage에서 수집 조사하였다.
- 체중은 일주일에 한 번씩 일정시간에 실험동물 저울(GF-2000, AND, Anyang, Korea)을 이용하여 측정하였으며, 식이섭취량은 일주일에 두 번씩 측정하여 공급하고 남은 식이를 4℃에서 냉장보관 하였다. 식이효율(food efficiency ratio, FER)은 전 체중증가량을 동일 기간 동안의식이섭취량으로 나누어 계산하였다. 배변량은 실험식이 급여기간 중 실험 6주째에 3일간 metabolic cage에서 수집 조사하였다.
- 실험동물은 4주령 된 수컷 apoE 마우스를 사용하였으며, 정상군, 고콜레스테롤 식이대조군, 알긴산 올리고당 5%와 10% 첨가군으로 나누어 6주간 급여하였다. 실험식이는 AIN-93G 식이를 기본으로 하여 콜레스테롤(1%, w/w)을 혼합하였으며, 알긴산 올리고당을 각각 5%와 10% 수준으로 혼합하였다. 실험기간 동안 증체량은 고콜레스테롤 식이대조군에 비해 알긴산 올리고당 10% 첨가군이 약 7.
- 실험이 종료된 실험동물은 12시간 절식시킨 후 안와정맥총(orvital plexus)으로부터 혈액을 채취하여 원심분리관에 담아 냉장에서 1시간 방치한 후에 원심분리(2,500×g, 10 min) 하여 취한 혈청을 저온(-70℃)에 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 이 배양물(150 mL)을 5 L의 배지[3% sodium alginate, 1% yeast extract, 0.2% NaCl, 0.2% K2HPO4, 0.1% KH2PO4, 0.1% MgSO4, 0.05% CaCl2, 0.1% trace element(pH 7.0)]와 혼합하여 37°C에서 14일간 배양한 후 10,000×g에서 30분간 원심분리 하여 상층액을 회수하였다.
- 실험이 종료된 실험동물은 12시간 절식시킨 후 안와정맥총(orvital plexus)으로부터 혈액을 채취하여 원심분리관에 담아 냉장에서 1시간 방치한 후에 원심분리(2,500×g, 10 min) 하여 취한 혈청을 저온(-70℃)에 보관하면서 실험에 사용하였다. 채혈이 끝난 후 간, 고환지방과 신장지방도 별도로 적출하여 0.9% 생리식염수에 세척한 다음 여과지로 물기를 제거하고 무게를 측정하였다. 간조직의 일부는 4% formaldehyde 용액에 담가 고정한 후 실험에 사용되기 전까지 –70℃에서 보관하였다.
- 고콜레스테롤 식이는 기초식이에 콜레스테롤 1%를 첨가한 양만큼 사료의 양을 줄여 조제하고 실험식이(experimental diet)는 콜레스테롤 식이에 중량비율로 알긴산 올리고당 5%와 10%를 각각 혼합하여 제조하였다(Table 1). 체중은 일주일에 한 번씩 일정시간에 실험동물 저울(GF-2000, AND, Anyang, Korea)을 이용하여 측정하였으며, 식이섭취량은 일주일에 두 번씩 측정하여 공급하고 남은 식이를 4℃에서 냉장보관 하였다. 식이효율(food efficiency ratio, FER)은 전 체중증가량을 동일 기간 동안의식이섭취량으로 나누어 계산하였다.
- 5 mL로 지질을 추출하고 여액을 회수하여 N2 gas로 용매를 증발시킨 후 지질 함량을 구하였다. 총 콜레스테롤과 중성지질 함량은 kit(total cholesterol, AM 202-k; triglyceride, AM 157S-k, Asan Pharm. Co., Seoul, Korea) 시약으로 측정하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 sodium alginate는 신원무역상사(Seoul, Korea)에서 구입하였다. 알긴산 올리고당을 제조하기 위해 우선 Bacillus subtilis KCTC 11782BP 균주를 150 mL의 배지(0.
- 본 연구는 고콜레스테롤 식이를 급여한 마우스의 지질대사에 알긴산 올리고당이 미치는 영향을 조사하였다. 실험동물은 4주령 된 수컷 apoE 마우스를 사용하였으며, 정상군, 고콜레스테롤 식이대조군, 알긴산 올리고당 5%와 10% 첨가군으로 나누어 6주간 급여하였다. 실험식이는 AIN-93G 식이를 기본으로 하여 콜레스테롤(1%, w/w)을 혼합하였으며, 알긴산 올리고당을 각각 5%와 10% 수준으로 혼합하였다.
- 실험동물은 4주령, 수컷 apoE 마우스를 중앙실험동물(주)(Seoul, Korea)로부터 구입하였고, 실험 전 1주일 동안 일반 고형사료(AIN-93G)로 적응기를 거친 후 난괴법(randomized complete block design)으로 정상군(N), 고콜레스테롤 식이대조군(HC), 알긴산 올리고당 5% 첨가군(HC-AOL), 알긴산 올리고당 10% 첨가군(HC-AOH)으로 나누어 6주간 사육하였으며, 물과 실험식이는 자유롭게 공급하였다. 본 실험에 사용한 식이는 AIN-93G 식이 조성에 준하여 제조하였다.
데이터처리
- Different letters (a-c) above the bars indicate significant differences (P<0.05) by Duncan's multiple range test.
- Values with different superscripts (a-c) within a row indicate significant difference (P<0.05) by Duncan's multiple range test.
- Values with different superscripts (a-d) within a row indicate significant difference (P<0.05) by Duncan's multiple range test.
- 본 실험결과는 SPSS(statistical package forsocial sciences, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 통계 프로그램 (version 18.0)을 이용하여 평균과 표준오차를 나타내었고, 각 처리군의 측정치에 대해 일원배치 분산분석(one-way ANOVA test) 후 Duncan's multiple range test를 이용하여 P<0.05 수준에서 유의성 검정을 실시하였다.
이론/모형
- 간 조직과 분변의 지질 함량은 Folch 등(16)의 방법에 따라 시료 0.5 g을 취하여 증류수 7 mL를 넣고 1분간 균질화한 다음 chloroform : methanol(1:2, v/v) 7.5 mL로 지질을 추출하고 여액을 회수하여 N2 gas로 용매를 증발시킨 후 지질 함량을 구하였다. 총 콜레스테롤과 중성지질 함량은 kit(total cholesterol, AM 202-k; triglyceride, AM 157S-k, Asan Pharm.
- 실험동물은 4주령, 수컷 apoE 마우스를 중앙실험동물(주)(Seoul, Korea)로부터 구입하였고, 실험 전 1주일 동안 일반 고형사료(AIN-93G)로 적응기를 거친 후 난괴법(randomized complete block design)으로 정상군(N), 고콜레스테롤 식이대조군(HC), 알긴산 올리고당 5% 첨가군(HC-AOL), 알긴산 올리고당 10% 첨가군(HC-AOH)으로 나누어 6주간 사육하였으며, 물과 실험식이는 자유롭게 공급하였다. 본 실험에 사용한 식이는 AIN-93G 식이 조성에 준하여 제조하였다. 고콜레스테롤 식이는 기초식이에 콜레스테롤 1%를 첨가한 양만큼 사료의 양을 줄여 조제하고 실험식이(experimental diet)는 콜레스테롤 식이에 중량비율로 알긴산 올리고당 5%와 10%를 각각 혼합하여 제조하였다(Table 1).
- 실험종료 후 분리한 공복 시 혈청의 생화학치는 Han 등(15)의 연구에 준하여 총 콜레스테롤(total cholesterol, TC) 및 고밀도지단백 콜레스테롤(high density lipoprotein-cholesterol, HDL-C) 농도는 각각 enzymatic colorimetry 검사법을 이용하였고, 저밀도지단백 콜레스테롤(low density lipoprotein-cholesterol, LDL-C) 농도는 enzyme immunoassay(EIA) 검사법을 이용하였으며, 중성지방(triglyceride, TG) 농도는 lipase, glycerokinase(GK), L-α-glycerol phosphate oxidase(GPO) colorimetry 검사법을 이용하여 자동혈액분석기(ADVIA 1650, Bayer, Shiga, Japan)로 각각 측정하였다.
성능/효과
- 고콜레스테롤 식이와 알긴산 올리고당을 6주간 섭취한 실험동물의 장기 무게를 비교한 결과는 Table 3과 같다. 각 식이섭취군의 간의 무게를 살펴보면, 고콜레스테롤 식이대조군는 정상군에 비하여 증가하였고 알긴산 올리고당 첨가 군이 고콜레스테롤 식이대조군보다 감소하였지만 유의적 차이는 없었다. 일반적으로 고콜레스테롤 식이를 장기간 섭취하였을 때 콜레스테롤이 체외로 정상적으로 배출되지 못하고 간 내부에 축적되어 간 비대증을 유발시킨다(18).
- 간 조직 내 지질 수준은 고콜레스테롤을 섭취했을 경우 정상군에 비해 유의적으로 증가하였으나, 알긴산 올리고당 10%를 섭취했을 때 고콜레스테롤 식이대조군보다 총 콜레스테롤 함량은 3배 이상, 중성지방 함량은 33.5% 유의적으로 감소하였다(P<0.05).
- 고콜레스테롤 섭취는 혈청 중 총 콜레스테롤, 중성지방, LDL-콜레스테롤 수준을 정상군보다 각각 16%, 12%, 47.1% 유의적으로 증가시켰으며, 반면에 알긴산 올리고당 10%를 섭취한 경우 고콜레스테롤 식이대조군보다 각각 57.5%, 51.4%, 82.9% 유의적으로 감소시켰다(P<0.05).
- 고콜레스테롤 식이군에서 나타난 분변 내 총 콜레스테롤 함량은 알긴산 올리고당 10% 첨가군에서 정상군보다 21% 유의적으로 증가하였다(P<0.05).
- 고콜레스테롤의 섭취로 인해 간의 지질 함량이 높아져 정상군보다 고콜레스테롤 식이대조군의 총 콜레스테롤 함량이 59.08 mg/g으로 약 2배 유의적으로 증가하였다(P<0.05).
- 반면 알긴산 올리고당 10% 첨가군은 신장 주변지방과 부고환지방 함량이 고콜레스테롤 식이대조군보다 각각 148.4%, 131.4% 유의적으로 감소하여(P<0.05) 고콜레스테롤 식이에 의한 장기 내 지방축적을 완화시키는 효과를 나타내었다.
- Lee 등(8)은 수용성 알긴산과 저분자화 알긴산을 섭취한 실험동물에서 고콜레스테롤 섭취군보다 혈청 중 총 콜레스테롤, 유리콜레스테롤, LDL-콜레스테롤, 중성지질 및 인지질에 대해 현저한 저감 효과를 보였다고 보고하였다. 본 실험에서 콜레스테롤 식이 섭취에 따른 비정상적인 혈청 지질 수준이 알긴산 올리고당의 섭취에 의해 혈청 총 콜레스테롤, 중성지질, LDL-콜레스테롤을 효과적으로 감소시킬 뿐만 아니라 HDL-콜레스테롤을 효과적으로 증가시켜 혈중 지질 함량의 개선 효과가 뛰어난 것을 확인하였으며 이로 인해 고지혈증, 고혈압, 동맥경화 등의 심혈관계질환의 예방에 효과가 있을 것으로 사료된다.
- 일반적으로 간 조직 내 중성지방 감소는 지단백질과 지방합성을 억제시키는 결과를 초래하며, 간 조직 내 콜레스테롤 감소는 혈액으로의 VLDL 합성을 감소시켜 결과적으로 혈액 내 콜레스테롤 수준을 감소시킨다(25). 본 연구 결과 알긴산 올리고당은 혈액 중 콜레스테롤과 중성지방 수준을 감소시켜 간 조직 내 지질의 흡수를 지연시키거나 축적을 저해하여 지질대사의 개선에 효과적으로 작용하였을 것으로 사료된다.
- Suzuki 등(17)의 연구 결과를 보면 알긴산 5% 섭취한 실험군이 기초식이군보다 흰쥐의 체중을 감소시켜 준다고 보고하였다. 본 연구에서도 알긴산 올리고당이 고콜레스테롤 식이를 섭취한 실험동물의 체중 감소를 확인하였다.
- 분변 내 총 콜레스테롤 함량은 정상군과 비교했을 때 고콜레스테롤 식이대조군이 약간 높았으며, 알긴산 올리고당 10% 첨가군은 정상군보다 21% 유의적으로 증가하였다(P<0.05).
- 식이섭취량은 알긴산 올리고당 10% 첨가군이 고콜레스테롤 식이대조군에 비해 16.6% 유의적으로 높았으나(P<0.05), 식이효율은 알긴산 올리고당 첨가군이 식이섭취량에 비해 체중증가량이 낮아 대조군에 비해 유의적으로 낮았다(P<0.05).
- 실험기간 동안 증체량은 고콜레스테롤 식이대조군에 비해 알긴산 올리고당 10% 첨가군이 약 7.6% 유의적으로 감소하였다(P<0.05).
- 알긴산 올리고당과 고콜레스테롤 식이를 섭취한 실험동물의 체중증가량, 식이섭취량 및 식이효율을 Table 2에 나타내었다. 실험식이 섭취 6주 후 알긴산 올리고당 10% 첨가군의 체중증가량은 고콜레스테롤 식이대조군보다 약 7.6%감소하였다. 식이섭취량은 알긴산 올리고당 10% 첨가군이 고콜레스테롤 식이대조군에 비해 16.
- 알긴산 올리고당 5%와 10% 첨가군은 각각 185 mg/dL, 150 mg/dL로 고콜레스테롤 식이대조군보다 27.7%, 57.5% 유의적으로 감소하였다(P<0.05).
- 알긴산 올리고당 5%와 10% 첨가군은 각각 24.67 mg/dL, 23.33 mg/dL로 고콜레스테롤 식이대조군에 비해 각각 73%, 82.9% 유의적으로 감소하였다(P<0.05).
- 장기조직 중 신장 주변지방과 부고환지방의 무게는 고콜레스테롤 식이대조군이 정상군에 비해 각각 42.6%, 27.6% 유의적으로 증가하였다(P<0.05).
- 전체 콜레스테롤에 대한 HDL-콜레스테롤의 비율을 살펴보면 정상군이 0.76으로 고콜레스테롤 식이대조군이 0.67인 것에 비해 감소하였으며, 알긴산 올리고당 5%와 10% 첨가군은 각각 0.96, 0.95로 유의적으로 증가하였다(P<0.05).
- 중성지방 함량은 정상군보다 고콜레스테롤 식이대조군이 수치적으로 조금 증가하였으나 유의적 차이는 없었으며, 알긴산 올리고당 5%와 10% 첨가군은 각각 147 mg/g, 138.59 mg/g으로 고콜레스테롤 식이대조군보다 각각 25.1%, 33.5% 유의적으로 감소하였다(P<0.05).
- 특히 총 콜레스테롤과 중성지방은 알긴산 올리고당의 첨가량이 높을수록 유의적으로 감소하였다(P<0.05).
- 혈청 HDL-콜레스테롤 함량은 실험군간 유의적 차이는 크게 나타나지 않았으나, 전체 콜레스테롤에 대한 HDL-콜레스테롤 비율에서 알긴산 올리고당 첨가군이 유의적으로 높았다(P<0.05).
- 혈청 중 중성지방은 고콜레스테롤 식이는 정상군에 비해 12% 유의적으로 증가하였으나(P<0.05), 알긴산 올리고당 5%와 10% 첨가군은 고콜레스테롤 식이대조군보다 각각 23.9%, 51.4% 유의적으로 감소하였다(P<0.05).
후속연구
- 05). 이상의 실험 결과 고콜레스테롤 식이와 알긴산 올리고당을 함께 섭취한 마우스는 체중 감량과 장기 내 지방의 중량을 감소시켜 비만 예방효과가 있고, 혈액, 간지질 및 분변 지질 수준의 개선 효과가 높아 지질대사와 관련된 만성질환 예방에 효과가 있을 것으로 기대된다.
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