HAase는 신체의 연골, 피부, 눈의 초자체 등에 포함된 고분자 다당류의 HA를 분해하는 효소로서 상처나 염증질환 시 활성화되어 염증, 알레르기 유발과 관련된 효소이다. 본 연구는 500종 식물에서 각 종당 한 식물체로부터 한 천연물의 메탄올 추출물(500추출물)을 이용하여 생물학적으로 기능이 다양하고 산업적으로 활용 가능성이 많은 HAase 저해제를 검색하였다. 그 결과 HAase 저해효과가 가장 우수한 천연물 추출물은 때죽나무 줄기 추출물 57.28%, 매화말발도리 줄기 추출물 53.50%의 저해효과를 나타내었다. 이 같은 추출물들의 농도 별 저해효과를 확인한 결과 농도 의존적으로 저해율이 증가하였다. 이 같은 결과로 볼 때 때죽나무, 매화말발도리 추출물은 HAase 효소의 저해효과가 우수하여 향후 HA 분해와 관련된 항염증 및 항 알레르기 연구에 이용될 수 있다.
HAase는 신체의 연골, 피부, 눈의 초자체 등에 포함된 고분자 다당류의 HA를 분해하는 효소로서 상처나 염증질환 시 활성화되어 염증, 알레르기 유발과 관련된 효소이다. 본 연구는 500종 식물에서 각 종당 한 식물체로부터 한 천연물의 메탄올 추출물(500추출물)을 이용하여 생물학적으로 기능이 다양하고 산업적으로 활용 가능성이 많은 HAase 저해제를 검색하였다. 그 결과 HAase 저해효과가 가장 우수한 천연물 추출물은 때죽나무 줄기 추출물 57.28%, 매화말발도리 줄기 추출물 53.50%의 저해효과를 나타내었다. 이 같은 추출물들의 농도 별 저해효과를 확인한 결과 농도 의존적으로 저해율이 증가하였다. 이 같은 결과로 볼 때 때죽나무, 매화말발도리 추출물은 HAase 효소의 저해효과가 우수하여 향후 HA 분해와 관련된 항염증 및 항 알레르기 연구에 이용될 수 있다.
Mammalian hyaluronidases (HAase, EC 3.2.1.35) are a family of enzymes that hydrolyse N-acetyl-D-glucosamine (1-4) glycosidic bonds in hyaluronic acid, which is found in skin, cartilage, and the vitreous body. Although HAase is generally present in an inactive form within subcellular lysosomes, it is...
Mammalian hyaluronidases (HAase, EC 3.2.1.35) are a family of enzymes that hydrolyse N-acetyl-D-glucosamine (1-4) glycosidic bonds in hyaluronic acid, which is found in skin, cartilage, and the vitreous body. Although HAase is generally present in an inactive form within subcellular lysosomes, it is released in an active form in some types of inflammation and tissue injuries, thereby contributing to the inflammatory response. The HAase inhibitory activity of 500 methanolic extracts of 500 species from medicinal plants was screened using a Morgan microplate assay. The viscosity of the hyaluronic acid was measured with an Ubbelohde viscometer. Three MeOH extracts inhibited more than 50% of HAase activity at a concentration of 2 mg/ml. HAase inhibitory rates (%) of three species of medicinal plant extracts, Styrax japonica, Deutzia coreana, and Osmanthus insularis were 57.28%, 53.50%, and 53.19%, respectively. The rate of HAase inhibition of the extracts was dose dependent. In the HAase inhibitory assay using the Ubbelohde viscometer, the results were in good agreement with the results from the Morgan assay. The results suggest that HAase inhibitory compounds extracted from the stem of S. japonica, D. coreana, and O. insularis might be multifunctional and prevent the degradation of hyaluronic acid and the induction of allergic reactions and inflammation.
Mammalian hyaluronidases (HAase, EC 3.2.1.35) are a family of enzymes that hydrolyse N-acetyl-D-glucosamine (1-4) glycosidic bonds in hyaluronic acid, which is found in skin, cartilage, and the vitreous body. Although HAase is generally present in an inactive form within subcellular lysosomes, it is released in an active form in some types of inflammation and tissue injuries, thereby contributing to the inflammatory response. The HAase inhibitory activity of 500 methanolic extracts of 500 species from medicinal plants was screened using a Morgan microplate assay. The viscosity of the hyaluronic acid was measured with an Ubbelohde viscometer. Three MeOH extracts inhibited more than 50% of HAase activity at a concentration of 2 mg/ml. HAase inhibitory rates (%) of three species of medicinal plant extracts, Styrax japonica, Deutzia coreana, and Osmanthus insularis were 57.28%, 53.50%, and 53.19%, respectively. The rate of HAase inhibition of the extracts was dose dependent. In the HAase inhibitory assay using the Ubbelohde viscometer, the results were in good agreement with the results from the Morgan assay. The results suggest that HAase inhibitory compounds extracted from the stem of S. japonica, D. coreana, and O. insularis might be multifunctional and prevent the degradation of hyaluronic acid and the induction of allergic reactions and inflammation.
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문제 정의
따라서 식물과 같은 천연물에서 새로운 HAase의 저해제를 개발하고자 연구를 시도하였으나 아직 상용화될 정도로 우수한 저해제는 개발되지 않았다[10, 24]. 따라서 본 연구는 국내에서 자생하는 500종의 천연물로부터 HAase 저해 활성이 있는 물질을 개발하고자, 천연물에서 methanol (MeOH) 추출물을 얻고, 이를 이용하여 HAase 저해효과를 탐색 및 선별하였다.
제안 방법
1차 스크리닝을 통해 50% 이상의 HAase 저해율(%)을 보인 천연물 3종을 선별하여 농도 별 저해활성을 확인하였다. 즉, 0.
1차 스크리닝을 통해 선별된 때죽나무, 매화말발도리, 박달목서 추출물들을 0, 0.25, 0.5, 1, 2 mg/ml의 농도로 조성하여 농도 별 HAase 저해활성을 확인하였다(Table 2, Fig. 3).
500종의 천연물 추출물에 대한 HAase 저해활성은 Morgan-Elson assay 방법을 변형하여 사용하였다[18]. 정량원리는 HA가 HAase에 의해 분해되어 생성된 N-acetylglucosamine의 정량을 DMAB solution (p-dimethylaminobenzaldehyde 0.
5, 1, 2 mg/ml의 농도로 희석한 뒤 HAase 저해활성을 측정하여 농도 별 저해율을 계산하였다. 양성대조군인 항알레르기 약물인 DSCG를 동일 농도(0, 0.25, 0.5, 1, 2 mg/ml)로 하여 HAase 저해율 변화를 비교 분석하였으며, 효소활성 저해율을 산출하여 IC50 값으로 평가하였다. 이때 IC50은 효소 활성을 50% 저해하는 농도이다.
1차 스크리닝을 통해 50% 이상의 HAase 저해율(%)을 보인 천연물 3종을 선별하여 농도 별 저해활성을 확인하였다. 즉, 0.1 M acetate buffer (pH 3.5)로 각 천연물시료를 0, 0.25, 0.5, 1, 2 mg/ml의 농도로 희석한 뒤 HAase 저해활성을 측정하여 농도 별 저해율을 계산하였다. 양성대조군인 항알레르기 약물인 DSCG를 동일 농도(0, 0.
대상 데이터
본 실험에서 사용한 천연물 추출물 500종은 한국식물추출물은행(KRIBB)에서 제공받아 사용하였다. 시료 500종 추출물의 사용된 부위는 Fig.
이론/모형
1차 스크리닝을 통해 50% 이상의 저해율을 보인 천연물 3종을 European Pharmacopoeia 7.0에 명시된 Ubbelohde viscometer방법[4]으로 HAase 저해활성을 측정하였다. 유럽 약전(European Pharmarcopoeia) 기준 HAase (1113.
성능/효과
2차 검색결과 HAase 저해율이 50% 이상을 보인 때죽나무, 매화말발도리, 박달목서 추출물을 우베로데 점도계(Ubbelohde viscometer)를 이용한 HAase 저해활성 측정법으로 확인 실험한 결과 Fig. 4와 같다.
2 cell에 처리하여 염증관여인자인 cyclooxygenase-2 (COX-2), inducible nitric oxide synthase (iNOS), interleukin-1β (IL-1β)를 RT-PCR과 Western blot을 통하여 발현량을 확인하여 항염증 효과를 보고하였다. 결과적으로, 때죽나무 추출물은 HAase를 저해하여 HA 가수분해를 차단하며, 저분자 분해산물에 의한 염증유발을 억제하는 것으로 판단된다. 이상과 같이 HAase 억제효과를 나타내는 천연물 추출물을 바탕으로 효능 물질의 분리와 구조에 관한 연구는 향후 성형외과 분야에서 주입된 필러(filler)의 분해방지, 항 염증제, 알레르기 저해제를 포함한 다기능성 물질로 개발이 기대된다.
본 연구에서 우선 천연물 500종 가운데 HAase저해 활성이 우수한 50종의 천연물을 선별한 결과, Table 1과 같다. 그 가운데 HAase 저해활성이 가장 우수한 천연물 3종은 때죽나무(Styrax japonica) 줄기 57.28%, 매화말발도리(Deutzia coreana)줄기 53.50%, 박달목서(Osmanthus insularis) 줄기 53.19% 순으로 억제 효과를 보였다. 시험에 사용된 추출물의 기원은 줄기 추출물이 다른 부위보다 HAase 저해 효과가 크게 나타났다.
1%의 효소활성이 각각 저해되었다. 따라서 2차 선발된 천연물을 대상으로 HAase 저해효과를 점도측정 법으로 확인한 결과, 때죽나무, 매화말발도리, 박달목서 순으로 저해효과를 보여 1차, 2차 스크리닝 결과와 유의성 있는 연구결과를 보였다.
HAase는 신체 내 상해 시 활성화되어 염증반응을 유발하고, 혈관 결합조직을 분해하여 암 전이를 촉진하는 효소로 알려져 있다[9, 12]. 따라서 때죽나무, 매화말발도리의 추출물들은 HAase 저해를 통해 염증유발 및 암 전이를 저해할 수 있다. 이와 유사한 연구로는 Lee 등[16]은 때죽나무 줄기와 잎에서 분리 된 성분이 항염증 활성을 가지고 있다고 보고한 바 있고, Kwon 등[14]은 때죽나무로부터 분리한 styraxlignolide F를 인간 폐암세포에 적용 시 항암효과가 있는 것으로 보고하였다.
19% 순으로 억제 효과를 보였다. 시험에 사용된 추출물의 기원은 줄기 추출물이 다른 부위보다 HAase 저해 효과가 크게 나타났다. 이 같이 식물 부위 별 HAase 저해활성의 차이는 Dhananjaya[6]등이 인디카망기페라(Mangifera indica)의 줄기껍질의 메탄올 추출물이 HAase에 강력한 저해활성 효과가 있다고 보고한 바 있고, Tarannum [28] 등이 앵무새 나무(Butea monosperma)의 줄기껍질 에탄올 추출물에서 HAase 저해효과가 우수하다고 보고한 바 있어, 우리의 연구결과와 유사하였다.
때죽나무, 매화말발도리의 추출물은 2 mg/ml의 농도에서 양성 대조군인 DSCG과 유사한 저해율을 보였다. 천연물 2 mg/ml 이하의 농도에서는 모든 천연물이 양성 대조군보다 낮은 저해 활성을 보였으며, 모든 시료에서 농도 의존적으로 HAase 저해활성이 증가하였다. 이들 추출물에 의한 HAase 저해율을 IC50값으로 계산한 결과, Table 3과 같이 때죽나무 추출물 1.
4와 같다. 효소액 HAase는 유럽약전 기준 효소 활성 수치인 0.667 IU/ml로 조제하고, 여기에 양성대조군인 DSCG와 천연물 추출물(0.2 mg/ml)을 처치하였을 때, DSCG 처치군에서는 음성 대조군(미처치군) 보다 38.1% 활성이 저해되었고, 때죽나무 추출물은 34.8% 저해, 매화말발도리 추출물은 34.8% 저해 및 박달목서 추출물은 5.1%의 효소활성이 각각 저해되었다. 따라서 2차 선발된 천연물을 대상으로 HAase 저해효과를 점도측정 법으로 확인한 결과, 때죽나무, 매화말발도리, 박달목서 순으로 저해효과를 보여 1차, 2차 스크리닝 결과와 유의성 있는 연구결과를 보였다.
후속연구
이와 유사한 연구로는 Lee 등[16]은 때죽나무 줄기와 잎에서 분리 된 성분이 항염증 활성을 가지고 있다고 보고한 바 있고, Kwon 등[14]은 때죽나무로부터 분리한 styraxlignolide F를 인간 폐암세포에 적용 시 항암효과가 있는 것으로 보고하였다. 따라서 HAase 저해 활성이 가장 우수한 때죽나무는 항염증, 암 전이의 저해제로서 추가적인 연구가 필요하다. 본 연구 결과 HAase 저해효과가 있는 것으로 처음 알려진 매화말발도리, 박달목서, 주엽나무 추출물에 대한 식물화학적 성분과 효능분석은 지속적으로 연구가 요구된다.
따라서 HAase 저해 활성이 가장 우수한 때죽나무는 항염증, 암 전이의 저해제로서 추가적인 연구가 필요하다. 본 연구 결과 HAase 저해효과가 있는 것으로 처음 알려진 매화말발도리, 박달목서, 주엽나무 추출물에 대한 식물화학적 성분과 효능분석은 지속적으로 연구가 요구된다.
결과적으로, 때죽나무 추출물은 HAase를 저해하여 HA 가수분해를 차단하며, 저분자 분해산물에 의한 염증유발을 억제하는 것으로 판단된다. 이상과 같이 HAase 억제효과를 나타내는 천연물 추출물을 바탕으로 효능 물질의 분리와 구조에 관한 연구는 향후 성형외과 분야에서 주입된 필러(filler)의 분해방지, 항 염증제, 알레르기 저해제를 포함한 다기능성 물질로 개발이 기대된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
HAase란 무엇인가?
HAase는 신체의 연골, 피부, 눈의 초자체 등에 포함된 고분자 다당류의 HA를 분해하는 효소로서 상처나 염증질환 시 활성화되어 염증, 알레르기 유발과 관련된 효소이다. 본 연구는 500종 식물에서 각 종당 한 식물체로부터 한 천연물의 메탄올 추출물(500추출물)을 이용하여 생물학적으로 기능이 다양하고 산업적으로 활용 가능성이 많은 HAase 저해제를 검색하였다.
선정된 500종 식물 중 HAase 저해효과가 우수한 천연물 추출물의 저해효과는?
본 연구는 500종 식물에서 각 종당 한 식물체로부터 한 천연물의 메탄올 추출물(500추출물)을 이용하여 생물학적으로 기능이 다양하고 산업적으로 활용 가능성이 많은 HAase 저해제를 검색하였다. 그 결과 HAase 저해효과가 가장 우수한 천연물 추출물은 때죽나무 줄기 추출물 57.28%, 매화말발도리 줄기 추출물 53.50%의 저해효과를 나타내었다. 이 같은 추출물들의 농도 별 저해효과를 확인한 결과 농도 의존적으로 저해율이 증가하였다.
hyaluronidase는 가수분해 기작에 따라 무엇으로 구분될 수 있는가?
HA의 분해효소인 hyaluronidase (HAase)는 연쇄상 구균에서 처음 발견된 효소로서, 세포간극의 구성성분인 HA를 분해하여 약물의 확산을 용이하게 해주는 특징 때문에 주사제, 항바이러스제 등 피하주사 시 주로 사용된다[5, 13, 19]. HAase는 HA를 가수분해하는 기작에 따라 포유류 형 HAase (Mammalian type, EC 3.2.1.35, hyaluronoglucosaminidase), 거머리 형 HAase (Leeches type, EC 3.2.1.36, hyaluronoglucuronidase) 와 박테리아 형 HAase (Bacterial type, EC 4.2.2.1, hyaluronate lyase)로 구분된다. 특히 포유류 형 HAase는 인체 내의 고환, 피부, 간, 태반 체액 등에 존재하여 HA의 구성성분인 glucuronic acid와 glucosamine사이의 β-(1,4) 배당체 결합을 가수분해하여 사당류(tetrasaccharide)를 생성하거나, 우리 몸의 관절에 있는 활액 및 연골의 성분인 chondroitin, chondroitin-4-sulfate, chondroitin-6-sulfate을 가수분해하는 특징이 있다[7, 19].
참고문헌 (32)
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