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문제 정의
- 본 연구에서는 유산균에 의한 발효물이 혈장 지질 저하 효과, 간 기능 보호 작용, 정장작용, 면역기능 강화, 항돌연변이 효과, 항산화활성 및 항암작용 등의 다양 건강기능을 지니고 있으므로[2], probiotics로 흑마늘 발효물을 제조함에 있어 주요 활성 인자로 S-allyl cysteine (SAC)의 함량변화 및 항염증과 체내 항산화활성을 평가하여 흑마늘 probiotics 발효물 제조를 위한 최적의 조건을 확인하고자 하였다.
제안 방법
- PBS (pH 7.4)로 3회 세척한 후 1XDCFHDA를 배지에 100 μl 첨가하여 1시간 동안 37℃, 5% CO2 조건에서 배양한 후 또 다시 PBS로 3회 씻어낸 다음 H2O2를 1 mM의 농도로 배지에 첨가하였다.
- RAW 264.7 대식세포에 H2O2로 산화적 스트레스를 유발시킨 후 발효 흑마늘 추출물이 ROS 생성에 미치는 영향을 DCFH-DA assay로 확인하였다(Fig. 5). DCFH-DA는 세포에 처리하면 세포 안으로 침투하여 H2O2와 결합하여 형광을 발하는 DCF를 생성하게 되므로 그 정도를 측정하여 intercellular ROS를 측정 할 수 있다[10].
- 22 μm membrane filter로 여과한 후 이를 분석용 시료로 사용 하였다. SAC 함량은 질량분석기(SQ Quantum LC-MS/MS, Thermo scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 분석하였다. 분석용 칼럼은 ZORBAX SB-C18 (4.
- 45 μm membrane filter로 여과한 여액을 시료로 사용하였다. pH와 산도는 자동적정기(G20 compact titrator, Mettler Toledo, Switzerland)를 사용하여 측정하였다. 자동적정기의 혼합 속도와 시간은 각각 30%와 15초로 하였으며, 종말점은 pH 8.
- 흑마늘에 대한 발효능이 우수한 균주를 선발하기 위하여 9종의 probiotics 각각을 MRS (Difco, USA) 평판배지에 streaking하여 37℃에서 24~48시간 배양한 후 생성된 single colony를 다시 MRS 배지에 접종하고 48시간 배양하여 starter를 제조하였다. 각각의 starter는 37℃에서 24시간 MRS 배지에서 배양한 후, 10% 탈지분유(서울우유협동조합, 서울)와 3% 흑설탕을 첨가하여 멸균한 용액에 접종하였다. 이를 37℃에서 24시간 배양하여 멸균한 20% 흑마늘 추출물에 각 3% (w/w)씩 접종한 다음 48시간 배양하여 생균수를 측정하였다.
- 2%)에 비하여 생존율이 낮았다. 나머지 균주에서는 생존율이 낮아 동일한 실험조건하에서는 생균이 확인되지 않았으므로 상기 4개의 균주를 흑마늘 발효물 제조용 균주로 선발하여 이후 실험을 진행하였다.
- 마우스 대식세포인 RAW 264.7 대식세포에서 LPS로 산화적 스트레스를 유발하여 발효 흑마늘 추출물이 NO 생성에 미치는 영향을 확인하였다(Fig. 4). NO는 면역기능에 관여하므로 염증유발에 중요한 역할을 하고, L-arginine이 L-citrulline으로 변화되는 과정에서 nitric oxide synthase (NOS)에 의해 생성되는 활성산소의 일종이다[15, 20].
- 마우스 대식세포인 RAW 264.7 세포에 대한 흑마늘 발효물의 세포독성을 확인하기 위하여 LPS 단독 처리군에서 세포의 독성을 나타내지 않는 농도(1 μg/ml)로 LPS를 처리하고, 예비 실험을 통해 흑마늘 발효물의 농도를 100 μg/ml로 정하여 병용처리 하였을 때 세포 독성을 확인하기 위해 MTT assay를 수행하였다(Fig. 3).
- 발효 시간별로 시료를 회수하여 1분 동안 균질화시킨 후 1 ml를 취해 0.04% bromocresol purple이 첨가된 MRS 평판배지에 접종하여 평판측정법으로 생균수를 측정하였다. 각각의 plate는 37℃ incubator에서 48시간 동안 배양하면서 형성된 colony 수를 계측하고 그 colony에 희석배수를 곱하여 시료 ml당 CFU (colony forming unit)로 나타내었다.
- 분석용 칼럼은 ZORBAX SB-C18 (4.6×250 mm, 5 μm, Agilent)을 사용하였고, 이동상은 물에 용해한 0.1% formic acid와 acetonitrile로 용해한 0.1% formic acid를 99:1, 80:20 및 0:100의 비율로 조절하면서 분석하였다.
- plantarum)을 선발하였다(Table 1). 선발된 균주를 이용한 발효물은 발효균주 선발시와 동일한 조건에서 발효하였으며, 72시간 동안 배양하면서, 발효 전(0시간), 12, 24 및 72시간에 시료를 취하여 생균수, pH, 산도 및 S-allyl cysteine (SAC)를 분석하였으며, 발효물을 동결 건조하여 분말화 한 것을 세포 실험용 시료로 사용하였다.
- 세포로부터 생성된 NO의 양을 세포 배양액 중에 존재하는 NO2-의 형태로서 Griess reagent system (Promega, USA)을 이용하여 측정하였다. RAW 264.
- MTT 용액(5 mg/ml) 10 μl를 넣어 37℃에서 2시간 반응시킨 후 dimethyl sulfoxid (DMSO, Amresco, USA)를 100 μl 가하고 10분간 교반하여 ELISA reader (Epoch, Bioteck, Germany)로 570 nm 흡광도를 측정하였다. 세포의 독성은 시료를 처리하지 않은 무대조군 대비 시료 처리군의 세포 수에 대한 비로 세포생존율을 산출하여 표시하였다.
- 각각의 starter는 37℃에서 24시간 MRS 배지에서 배양한 후, 10% 탈지분유(서울우유협동조합, 서울)와 3% 흑설탕을 첨가하여 멸균한 용액에 접종하였다. 이를 37℃에서 24시간 배양하여 멸균한 20% 흑마늘 추출물에 각 3% (w/w)씩 접종한 다음 48시간 배양하여 생균수를 측정하였다.
- pH와 산도는 자동적정기(G20 compact titrator, Mettler Toledo, Switzerland)를 사용하여 측정하였다. 자동적정기의 혼합 속도와 시간은 각각 30%와 15초로 하였으며, 종말점은 pH 8.4로 설정하여 0.1 N NaOH 용액 소요량에 젖산계수를 곱하여 표시하였다.
- 실험에 사용한 흑마늘은 남해보물섬흑마늘영농조합법인(경남 남해군)에서 구매를 하였으며, 껍질을 제거한 흑마늘은 초저온냉동고에 저장하고 실험 시 해동하여 사용하였다. 흑마늘 발효물 제조를 위해 3차 증류수에 흑마늘을 10, 20, 30%(w/v) 농도로 첨가한 후 믹서기(Hanil, Korea)에서 3분간 파쇄였다. 이것을 121℃에서 15분간 멸균한 다음 probiotics 균주를 접종하였다.
- 흑마늘 발효물의 intracellular ROS는 intracellular ROS assay kit (Cell biolabs, USA)를 이용하여 측정하였다. 96 well black plate에 5×104 cell/well의 RAW 264.
- 흑마늘에 대한 발효능이 우수한 균주를 선발하기 위하여 9종의 probiotics 각각을 MRS (Difco, USA) 평판배지에 streaking하여 37℃에서 24~48시간 배양한 후 생성된 single colony를 다시 MRS 배지에 접종하고 48시간 배양하여 starter를 제조하였다. 각각의 starter는 37℃에서 24시간 MRS 배지에서 배양한 후, 10% 탈지분유(서울우유협동조합, 서울)와 3% 흑설탕을 첨가하여 멸균한 용액에 접종하였다.
- 흑마늘이 각각 10, 20, 30%씩 첨가된 배지에 선발된 발효능이 우수한 probiotics 4종의 균주를 각각 3%씩 접종하여 생균수를 측정한 결과는 Fig. 1과 같다. 4종의 균주 중 L.
대상 데이터
- 7 마우스 대식세포는 한국세포주은행(KCLB, Korea Cell Line Bank, Korea)에서 분양받아 실험에 사용하였다. RAW 264.7 세포는 10% fetal bovine serum (FBS, Hyclone, USA), 250 units/ml의 penicillin (Sigma Co Ltd, USA)및 250 mg/ml의 streptomycin (Sigma Co Ltd, USA)을 포함하는 DMEM (Gibco, Germany) 배지를 사용하였다. 세포는 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였고, 2일 후 RAW 264.
- 실험에 사용된 RAW 264.7 마우스 대식세포는 한국세포주은행(KCLB, Korea Cell Line Bank, Korea)에서 분양받아 실험에 사용하였다. RAW 264.
- 실험에 사용한 흑마늘은 남해보물섬흑마늘영농조합법인(경남 남해군)에서 구매를 하였으며, 껍질을 제거한 흑마늘은 초저온냉동고에 저장하고 실험 시 해동하여 사용하였다. 흑마늘 발효물 제조를 위해 3차 증류수에 흑마늘을 10, 20, 30%(w/v) 농도로 첨가한 후 믹서기(Hanil, Korea)에서 3분간 파쇄였다.
- 이것을 121℃에서 15분간 멸균한 다음 probiotics 균주를 접종하였다. 흑마늘 발효를 위한 균주는 농촌진흥청 농업유전자원지원센터(KACC)로부터 9종의 probiotics를 분양받아 사용하였다.
- 흑마늘 추출물이 첨가된 배지에서 생육능이 우수한 probiotics 4종(L. rhamnosus, L. paracasei subsp. paracasei, L. casei, L. plantarum)을 선발하였다(Table 1). 선발된 균주를 이용한 발효물은 발효균주 선발시와 동일한 조건에서 발효하였으며, 72시간 동안 배양하면서, 발효 전(0시간), 12, 24 및 72시간에 시료를 취하여 생균수, pH, 산도 및 S-allyl cysteine (SAC)를 분석하였으며, 발효물을 동결 건조하여 분말화 한 것을 세포 실험용 시료로 사용하였다.
데이터처리
- 분석 결과는 SPSS 12.0 (12.0 SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 평균±표준편차로 나타내었으며, ANOVA의 one-way Duncan's multiple test로 유의수준은 0.05 이하로 유의성을 분석하였다.
- 세포실험 결과는 ANOVA의 one-way Tukey’s test로 유의수준 0.05 및 0.01 이하로 유의성 분석을 실시하였다.
이론/모형
- 7 cells. Cell viability was evaluated by MTT assay. Raw 264.
- 22 μm 필터에 여과하여 사용하였다. 세포의 생존에 미치는 영향을 관찰하기 위해 3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5- di-phenyl-tetrazolium bromide (MTT, Amresco, USA) 방법을 이용하여 측정하였다. 96 well plates에 RAW 264.
성능/효과
- 22 log CFU/ml로 균의 증식이 우수하였다. 4종류의 균주 중에서 L. plantarum이 가장 우수한 증식율을 보였는데, 흑마늘의 첨가 농도에 관계없이 발효 72시간까지 초기 생균수에 비해 높은 생균수를 유지하였다.
- 1과 같다. 4종의 균주 중 L. plantarum의 생육이 가장 좋았으며 4 균주 모두에서 24시간까지는 생균수가 증가하다가 이후부터는 감소하는 경향을 나타내었다. L.
- 64 log CFU/ml로 다른 농도에 비해 증식율이 높았으며, 흑마늘 30% 첨가시 24시간 이후에 큰 폭으로 생균수가 감소하였으나 20% 흑마늘 첨가군에서는 72시간까지 증식율이 유지되었다. L. casei 균주를 접종한 실험군에서는 흑마늘 10% 첨가시 8.22 log CFU/ml로 균의 증식이 우수하였다. 4종류의 균주 중에서 L.
- L. rhamnosus 균주 접종시 흑마늘 농도가 높을수록 발효 34시간 이후의 생육속도의 감소폭은 오히려 낮아지는 경향이었다. 흑마늘 10% 첨가군에서는 24시간 이후에 생육속도가 큰 폭으로 감소하였으나 흑마늘의 첨가 농도가 높아질수록 probiotics의 증식이 더 잘 유지되는 경향이었다.
- plantarum 4개의 균주가 생존율 100% 이상을 나타내었다. L. salivarius 균은 75.6%의 생존율을 보여 흑마늘을 영양분으로 이용은 가능할 것으로 판단되나 이상의 4개의 균주(100.1~106.2%)에 비하여 생존율이 낮았다. 나머지 균주에서는 생존율이 낮아 동일한 실험조건하에서는 생균이 확인되지 않았으므로 상기 4개의 균주를 흑마늘 발효물 제조용 균주로 선발하여 이후 실험을 진행하였다.
- LPS 단독 처리구에서 NO 생성량은 18.37 μM이었는데, 흑마늘을 혼합함으로써 NO 생성량은 감소하여 발효 전 시료에서 10.24~17.66 μM로 일부 시료에서는 유의적으로 생성량이 감소하였다.
- Probiotics를 접종한 발효물에서도 흑마늘의 첨가 농도가 많을수록 SAC 함량도 높았는데, L. rhamnosus 균주로 발효한 발효물에서는 흑마늘의 첨가량에 관계없이 발효기간이 경과 할수록 SAC 함량은 증가하였다. 반면, 여타 균주를 접종한 발효물에서는 일정 조건을 제외하고는 발효초기에 비해 발효 72시간 후에 발효물 중의 SAC 함량은 미량씩 감소하는 경향이었다.
- paracasei subsp. paracasei 균주는 흑마늘 10% 첨가시에는 발효 24시간에 8.64 log CFU/ml로 다른 농도에 비해 증식율이 높았으며, 흑마늘 30% 첨가시 24시간 이후에 큰 폭으로 생균수가 감소하였으나 20% 흑마늘 첨가군에서는 72시간까지 증식율이 유지되었다. L.
- paracasei subsp. paracasei, L. casei 및 L. plantarum 균주는 30% 흑마늘 첨가군에 비해 흑마늘의 첨가농도가 낮을 때 probiotics의 생육이 더 좋았다.
- paracasei subsp. paracasei, L. casei, L. plantarum 4개의 균주가 생존율 100% 이상을 나타내었다. L.
- 따라서 흑마늘 발효물은 100 μg/ml의 농도에서는 세포독성을 나타내지 않음을 확인하였고, 실험 농도로 설정하였다.
- rhamnosus 균주로 발효한 발효물에서는 흑마늘의 첨가량에 관계없이 발효기간이 경과 할수록 SAC 함량은 증가하였다. 반면, 여타 균주를 접종한 발효물에서는 일정 조건을 제외하고는 발효초기에 비해 발효 72시간 후에 발효물 중의 SAC 함량은 미량씩 감소하는 경향이었다. 즉, L.
- 3). 발효 전 시료의 경우 93~103%의 세포생존율을 나타내었으며, 72시간 발효시켰을 때는 91~99%의 세포 생존율을 나타내었다. 따라서 흑마늘 발효물은 100 μg/ml의 농도에서는 세포독성을 나타내지 않음을 확인하였고, 실험 농도로 설정하였다.
- 발효기간 동안 산도의 변화는 pH의 변화와 상반되게 증가 하는 경향을 나타내었으며, 흑마늘의 첨가량이 많을수록 초기 발효물의 산도가 높았고, 산도의 증가폭도 더 적었다. 즉, 산도가 가장 높았던 L.
- 3배 정도에 불과하였다. 발효물 제조시 흑마늘의 첨가량이 많아질수록 초기 산도는 높았으며, 발효가 진행되면서부터는 흑마늘의 첨가량이 많을수록 미생물의 생육은 오히려 방해를 받아 산의 생성이 상대적으로 적어지게 되어 산도의 증가폭은 더 적어지는 것으로 판단된다.
- 흑마늘을 10~30% 첨가하여 발효물을 제조하면서 발효시간에 따른 SAC 함량 변화를 분석한 결과는 Table 3과 같다. 발효물 중의 SAC 함량은 흑마늘로부터 유래하는 것으로 흑마늘의 첨가량이 많을수록 그 함량이 높았는데, probiotics를 접종하지 않은 대조군의 경우 37℃에서 72시간 동안 보관되는 동안 그 함량이 점차 감소하는 경향을 보여 흑마늘 중의 SAC 함량이 일정 온도에서 저장되는 동안에도 자연 감소함을 알 수 있었다.
- 생체내에 ROS가 증가하게 되면 세포 및 조직에 산화적 스트레스로 작용하여 세포와 조직에 손상을 초래하게 되면 염증, 노화 관련 변성, 종양의 생성, 당뇨병 등 만성질환에 직간접적으로 영향 미치게 되므로 세포내 대사과정에서 ROS의 충분한 제어가 요구된다[8, 19]. 본 연구에서 정상 세포에 비해 H2O2 단독 처리시 intercellular ROS 생성은 4배 증가하였으며, L. casei 와 L. plantarum을 접종하여 발효한 시료들에서 유의적으로 H2O2 처리군에 비해 ROS 생성이 감소되어 흑마늘 뿐만 아니라 흑마늘 발효물도 intercellular ROS의 제어에 유효한 것으로 판단된다.
- 버섯 종균으로 발효한 진피 발효물의 항산화 활성을 평가한 결과 배양시간과 시료의 농도에 의존적으로 항산화 효과가 증가한다고 보고되어 있는데[25], 본 실험의 결과에서는 일부 시료를 제외하고는 균주 접종 초기에 비해 72시간 발효 후 ROS 생성이 오히려 증가하였다. 이는 균주를 접종하지 않고, 동일한 조건에서 보관한 대조군과 비교 할 때 발효에 사용된 균주뿐만 아니라 흑마늘의 농도에 따라서도 ROS 생성이 영향을 받음을 알 수 있었다. 이러한 결과는 발효 전 시료에서는 흑마늘 자체의 항산화 활성으로 인하여 intercellular ROS 생성 억제능이 우수하나, 발효과정을 거치면서 흑마늘의 유효성분들이 미생물의 생육과정에서 생성되는 산화물의 소거에 활용되며, 미생물 대사로 인해 분해되거나 저분자화됨으로써 항산화 활성이 감소하기 때문에 발효 전 시료에 비해 상대적인 ROS 생성량이 더 높아졌기 때문으로 추정된다.
- 발효기간 동안 산도의 변화는 pH의 변화와 상반되게 증가 하는 경향을 나타내었으며, 흑마늘의 첨가량이 많을수록 초기 발효물의 산도가 높았고, 산도의 증가폭도 더 적었다. 즉, 산도가 가장 높았던 L. plantarum 균주를 접종한 실험군(#9)의 경우 흑마늘을 10% 첨가하였을 때 산도는 0.85% 이던 것이 발효 72시간에는 1.65%로 약 2배 증가하였으나 흑마늘을 30% 첨가하였을 때는 흑마늘 자체의 pH로 인해 발효물 제조 직후의 산도가 1.52%로 높았으며 발효 72시간 후에는 2.01%로 증가하였으나 증가폭은 1.3배 정도에 불과하였다. 발효물 제조시 흑마늘의 첨가량이 많아질수록 초기 산도는 높았으며, 발효가 진행되면서부터는 흑마늘의 첨가량이 많을수록 미생물의 생육은 오히려 방해를 받아 산의 생성이 상대적으로 적어지게 되어 산도의 증가폭은 더 적어지는 것으로 판단된다.
- rhamnosus 균주 접종시 흑마늘 농도가 높을수록 발효 34시간 이후의 생육속도의 감소폭은 오히려 낮아지는 경향이었다. 흑마늘 10% 첨가군에서는 24시간 이후에 생육속도가 큰 폭으로 감소하였으나 흑마늘의 첨가 농도가 높아질수록 probiotics의 증식이 더 잘 유지되는 경향이었다. L.
- 5 부근으로 낮기 때문으로 판단된다. 흑마늘의 첨가비율이 적을수록 pH의 저하율이 더 커져 10% 흑마늘 발효물에서는 균을 접종하지 않은 대조군을 제외한 모든 실험군의 pH가 발효 12시간 이후부터 유의적으로 감소하기 시작하여 발효 48시간 이후부터는 3.5이하로 낮아졌다. 반면 흑마늘의 첨가 비율이 가장 높은 30% 첨가군(C)에서는 발효 24시간까지 pH의 차이가 미미하였으며, 발효 72시간 이후에도 3.
후속연구
- plantarum 접종 발효물은 흑마늘 20% 첨가군에서만 SAC 함량이 감소하지 않거나 증가하였다. 이러한 경향은 발효 균주의 생육 및 대사특성과 상관성이 있을 것으로 추정되며, 흑마늘 발효 제품 중의 SAC 함량 감소를 방지하기 위해서는 복합균주를 이용한 발효조건을 설정하기 위한 연구가 추가로 진행되어야 할 것으로 판단된다.
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