Cellulophaga lytica PKA 1005의 Cellulose 분해 조효소 생산 최적 조건과 조효소의 특성 Optimization and Characterization of Conditions for Cellulose-degrading Crude Enzymes Produced by Cellulophaga lytica PKA 1005원문보기
This study was conducted to investigate optimum conditions for the production of cellulose-degrading crude enzymes by an isolated marine bacterium. A marine microorganism producing an extracellular cellulose-degrading enzyme was isolated from the red seaweed, Grateloupia elliptica Holmes. The isolat...
This study was conducted to investigate optimum conditions for the production of cellulose-degrading crude enzymes by an isolated marine bacterium. A marine microorganism producing an extracellular cellulose-degrading enzyme was isolated from the red seaweed, Grateloupia elliptica Holmes. The isolated bacterium was identified as Cellulophaga lytica by 16S ribosomal RNA gene sequence analysis and physiological profiling and designated as Cellulophaga lytica PKA 1005. The optimum conditions for the growth of Cellulophaga lytica PKA 1005 were pH 7, 2% NaCl, and $30^{\circ}C$ with 36 h incubation time. To obtain the crude enzyme, the culture medium of the strain was centrifuged for 30 min at $12,000{\times}g$ and $4^{\circ}C$, and the supernatant was used as crude enzyme. The optimum conditions for the production of the cellulose-degrading crude enzyme were pH 8, $35^{\circ}C$, 8% carboxyl methyl cellulose, and 60 h reaction time.
This study was conducted to investigate optimum conditions for the production of cellulose-degrading crude enzymes by an isolated marine bacterium. A marine microorganism producing an extracellular cellulose-degrading enzyme was isolated from the red seaweed, Grateloupia elliptica Holmes. The isolated bacterium was identified as Cellulophaga lytica by 16S ribosomal RNA gene sequence analysis and physiological profiling and designated as Cellulophaga lytica PKA 1005. The optimum conditions for the growth of Cellulophaga lytica PKA 1005 were pH 7, 2% NaCl, and $30^{\circ}C$ with 36 h incubation time. To obtain the crude enzyme, the culture medium of the strain was centrifuged for 30 min at $12,000{\times}g$ and $4^{\circ}C$, and the supernatant was used as crude enzyme. The optimum conditions for the production of the cellulose-degrading crude enzyme were pH 8, $35^{\circ}C$, 8% carboxyl methyl cellulose, and 60 h reaction time.
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문제 정의
이에 본 연구에서는 해조류 cellulose를 이용하기 위한 기초연구로서 분해가 진행중인 해조류와 주변 해수로부터 cellulose 분해 활성이 우수한 미생물을 탐색하고 분리하여 cellulose 분해 효소를 생산하는 미생물의 최적 생육조건 및 그 조효소액의 cellulose 분해 특성을 확인하고자 하였다.
가설 설정
1)Means in the same column (a-f) bearing different superscripts are significantly different (p < 0.05). The mixture of CMC and crude enzyme adjusted to pH 8.
2)Mixture of CMC and crude enzyme adjusted to pH 2-10.
3)Means in the same row (A-B) and column (a-d) bearing different superscripts are significantly different (p < 0.05).
1)Means in the same column (a-f) bearing different superscripts are significantly different (p < 0.05). The mixture of CMC and crude enzyme adjusted to pH 8.
제안 방법
C. lytica PKA 1005 균주가 생산하는 조효소액의 cellulose 분해 활성을 확인하기 위해 pH, 온도, cellulose 농도 및 반응시간을 달리하여 cellulose 분해 활성을 측정하였다.
MB 배지를 기본 배지로 사용하였으며, 균은 106 cfu/ml 농도로 배지 5 ml당 100 μl씩 접종하였다. pH 확인을 위해 MB 배지를 0.1 N 및 1 N HCl과 0.1 N 및 1 N NaOH로 pH 2-10으로 조정하였으며 균을 접종 후, 30℃에서 24시간 배양하였다. 최적 pH로 조정한 MB 배지의 NaCl 농도를 2-7%로 조정한 후, 30℃에서 24시간 배양하여 NaCl 농도 조건을 확인하였고, 또한 최적 pH 및 NaCl 농도로 조정한 MB 배지에 균을 접종 후, 배양 온도를 10-40℃로 달리하고 24시간 배양하여 최적 온도 조건을 확인하였고, 최적 pH, NaCl 농도 및 온도조건에서 균을 72시간까지 배양하며 최적 배양 시간조건을 확인하였다.
2D) 배양 36시간까지 균의 성장속도가 급격히 증가하였고 이후 균의 성장 속도가 감소하였으며, 48시간 이후에는 균체의 성장이 거의 없었다. 따라서 36시간을 최적 배양시간으로 하였다.
최적 pH 조건에서 온도를 10-40℃로 달리하여 CMC와 조효소액 1:1 혼합물을 24시간 배양한 후 최적 온도 조건을 확인하였으며, 최적 CMC 농도를 확인하기 위해 1-11% 농도의 CMC를 pH 8 및 35℃ 조건에서 24시간 배양하여 실험하였다. 또한 최적 시간 조건을 확인하기 위해 최적 pH, 온도 및 CMC 농도 조건으로 72시간까지 배양하며 실험하였다.
부산 송정 연안에서 채취한 분해중인 Grateloupia elliptica와 그 주변 해수로부터 형태적으로 다른 colony를 분리하였으며, cellulose 분해능이 우수한 단일 colony는 (주)마크로젠에서 16S rRNA sequence analysis로 16S rDNA 염기서열을 확인한 후(Fig. 1), NCBI blast를 통하여 동정하였다. 그 결과, Cellulophaga lytica sp.
분리·동정된 cellulose 분해균으로부터 얻은 cellulose 분해 조효소액의 초기 pH, 온도, CMC 농도 및 배양 시간 특성을 확인하였으며, CMC 분해능은 점도 및 환원당 함량을 측정하였다.
분리·동정된 cellulose 분해균을 최적 생육 조건으로 대량 배양 후, 원심분리기(SUPRA 22K, Hanil Science Co., Seoul, Korea)로 4℃에서 12,000×g, 30 min 조건으로 원심 분리하여 상층액을 조효소액으로 하였다.
분리·동정된 알긴산 분해 미생물의 최적 pH, NaCl 농도, 배양온도 및 배양 시간 조건을 확인하기 위해, 각 조건에서 균을 배양한 후, 600 nm에서 흡광도를 2회 반복 측정하였다.
희석액은 MA 배지에 분주·도말 후, 30℃에서 48시간 배양하였으며, 생성된 colony를 확인하고 형태적으로 다른 colony를 선택하였다. 선택된 균주는 cellulose 분해 활성 측정을 위하여 균체 배양액과 carboxyl methyl cellulose (CMC)를 1:1로 혼합하여 30℃에서 24시간 배양 후, 환원당 생성량 및 점도 측정으로 cellulose 분해능을 확인하였다. 이중 cellulose 분해능이 우수한 단일 colony는 염기서열 분석을 (주)마크로젠(Seoul, Korea)에 의뢰하여 16S rRNA sequence analysis로 분석하여 16S rDNA 염기서열을 구하여 NCBI blast를 통해 동정하였다.
선택된 균주는 cellulose 분해 활성 측정을 위하여 균체 배양액과 carboxyl methyl cellulose (CMC)를 1:1로 혼합하여 30℃에서 24시간 배양 후, 환원당 생성량 및 점도 측정으로 cellulose 분해능을 확인하였다. 이중 cellulose 분해능이 우수한 단일 colony는 염기서열 분석을 (주)마크로젠(Seoul, Korea)에 의뢰하여 16S rRNA sequence analysis로 분석하여 16S rDNA 염기서열을 구하여 NCBI blast를 통해 동정하였다.
조효소액의 시간에 따른 활성조건을 확인하기 위하여 pH 8, 35℃ , cellulose 농도 8%의 최적 조건에서 시간을 달리하여 실험한 결과(Table 4), 60시간에서 점도가 0.09 cP 및 환원당 함량이 456.88 μg/ml으로 최대 분해 활성을 나타내었 으며, 이 후에는 환원당 값이 감소하여 60시간을 최적 활성 조건으로 하였다.
1 N 및 1 N NaOH를 이용하여 pH 2-10까지 조정하였으며, CMC와 조효소액을 1:1 혼합 후 30℃에서 24시간 배양하여 실험하였다. 최적 pH 조건에서 온도를 10-40℃로 달리하여 CMC와 조효소액 1:1 혼합물을 24시간 배양한 후 최적 온도 조건을 확인하였으며, 최적 CMC 농도를 확인하기 위해 1-11% 농도의 CMC를 pH 8 및 35℃ 조건에서 24시간 배양하여 실험하였다. 또한 최적 시간 조건을 확인하기 위해 최적 pH, 온도 및 CMC 농도 조건으로 72시간까지 배양하며 실험하였다.
환원당은 Somogyi-Nelson법[16]으로 520 nm에서 표준당 (glucose)으로 작성한 검량곡선으로부터 환원당 함량을 측정 하였다. 최적 pH 조건을 확인하기 위해 0.1 N 및 1 N HCl 과 0.1 N 및 1 N NaOH를 이용하여 pH 2-10까지 조정하였으며, CMC와 조효소액을 1:1 혼합 후 30℃에서 24시간 배양하여 실험하였다. 최적 pH 조건에서 온도를 10-40℃로 달리하여 CMC와 조효소액 1:1 혼합물을 24시간 배양한 후 최적 온도 조건을 확인하였으며, 최적 CMC 농도를 확인하기 위해 1-11% 농도의 CMC를 pH 8 및 35℃ 조건에서 24시간 배양하여 실험하였다.
1 N 및 1 N NaOH로 pH 2-10으로 조정하였으며 균을 접종 후, 30℃에서 24시간 배양하였다. 최적 pH로 조정한 MB 배지의 NaCl 농도를 2-7%로 조정한 후, 30℃에서 24시간 배양하여 NaCl 농도 조건을 확인하였고, 또한 최적 pH 및 NaCl 농도로 조정한 MB 배지에 균을 접종 후, 배양 온도를 10-40℃로 달리하고 24시간 배양하여 최적 온도 조건을 확인하였고, 최적 pH, NaCl 농도 및 온도조건에서 균을 72시간까지 배양하며 최적 배양 시간조건을 확인하였다.
희석액은 MA 배지에 분주·도말 후, 30℃에서 48시간 배양하였으며, 생성된 colony를 확인하고 형태적으로 다른 colony를 선택하였다.
대상 데이터
Cellulose 분해 미생물은 부산의 송정 연안에서 분해중인 해조류 및 그 주변 해수를 채집하였으며, 멸균된 2% NaCl phosphate buffer (pH7.4)를 이용하여 해수 및 해조류를 희석하였다. 희석액은 MA 배지에 분주·도말 후, 30℃에서 48시간 배양하였으며, 생성된 colony를 확인하고 형태적으로 다른 colony를 선택하였다.
본 실험에 사용한 기질은 carboxyl methyl cellulose(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)를 사용하였으며, 배지는 marine broth (MB, Difco, Detroit, MI, USA) 및 marine agar (MA, Difco)를 사용하였다.
데이터처리
실험 결과의 통계처리는 SAS program (Statistical analytical system V8.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하여 분산 분석한 후 Ducan의 다중검정법으로 p < 0.05 수준에서 항목들 간의 유의적 차이를 검정하였다.
이론/모형
분리·동정된 cellulose 분해균으로부터 얻은 cellulose 분해 조효소액의 초기 pH, 온도, CMC 농도 및 배양 시간 특성을 확인하였으며, CMC 분해능은 점도 및 환원당 함량을 측정하였다. 점도 측정은 점도계(LVLTDV-II, Brookfield Co., Middleboro, MA, USA)를 이용하여 Stevens와 Levin[21]의 방법을 참고하여 25℃에서 각 조건별로 측정하였다. 환원당은 Somogyi-Nelson법[16]으로 520 nm에서 표준당 (glucose)으로 작성한 검량곡선으로부터 환원당 함량을 측정 하였다.
, Middleboro, MA, USA)를 이용하여 Stevens와 Levin[21]의 방법을 참고하여 25℃에서 각 조건별로 측정하였다. 환원당은 Somogyi-Nelson법[16]으로 520 nm에서 표준당 (glucose)으로 작성한 검량곡선으로부터 환원당 함량을 측정 하였다. 최적 pH 조건을 확인하기 위해 0.
성능/효과
C. lytica PKA 1005 균주의 최적 배양 온도를 확인하기 위하여, 10-40℃의 온도에서 배양한 결과(Fig. 2C), 30℃에서 0.546으로 가장 높은 활성을 보였으며, 그 이외의 온도에서는 활성이 감소하는 것을 확인하였다. 이 결과는 Cytophaga lytica 균주[6]의 최적온도가 22-30℃라는 결과와 같은 결과를 나타냈다.
C. lytica PKA 1005의 최적 생육조건은 pH 7, 2% NaCl, 30℃ 및 36시간의 배양조건인 것으로 나타났으며, C. lytica PKA 1005는 중성 및 중온 영역에서 대량 배양하여 cellulose 분해효소를 효율적으로 획득할 수 있을 것으로 사료된다.
그 결과, Cellulophaga lytica sp. IFO16021(GenBank: AB032512.1)와 99% 유사성을 보였으며, 본 연구에서 분리한 cellulose 분해균을 Cellulophaga lytica PKA 1005으로 명명하였다.
이 결과는 Cytophaga lytica 균주[6]의 최적온도가 22-30℃라는 결과와 같은 결과를 나타냈다. 앞서 결정한 최적배양 조건에서 배양시간을 달리하며 C. lytica PKA 1005의 균성장을 확인한 결과(Fig. 2D) 배양 36시간까지 균의 성장속도가 급격히 증가하였고 이후 균의 성장 속도가 감소하였으며, 48시간 이후에는 균체의 성장이 거의 없었다. 따라서 36시간을 최적 배양시간으로 하였다.
5%에서 높은 생육활성을 보인다는 결과와 유사하였다. 이러한 결과로 보아 해양에서 분리한 미생물은 NaCl의 일정농도 요구되어질 때 생육활성이 높을 것으로 사료되어지며, 본 연구에서 분리한 C. lytica PKA 1005 균주도 NaCl 2% 농도에서 최적 생육활성을 보이는 것을 확인하였다.
33 cP로 가장 낮았다. 이로부터 pH 8에서 C. lytica PKA 1005 균주가 생산하는 조효소액의 cellulose 분해 활성이 가장 뛰어남을 확인하였다. 이러한 결과는 Salinivibrio sp.
88 μg/ml으로 최대 분해 활성을 나타내었으며, 이 후에는 환원당 값이 감소하여 60시간을 최적 활성 조건으로 하였다. 이상의 결과를 종합해 볼 때, C. lytica PKA 1005이 생산하는 조효소액의 최적 cellulose 분해 조건은 pH 8, 35℃ , 8% CMC 및 반응시간 60시간임을 확인하였으며, 다른 미생물이 분비하는 cellulose-degrading enzyme 특성을 비교 시(Table 5), 해수유래 C. lytica PKA1005 균주가 35℃ 에서 최적 온도를 가지는 것에 비하여 육상 미생물 유래 효소가 40-60℃ 에서 최적온도를 나타내고 있어 육상미생물보다 낮은 온도에서 최적 활성을 가지므로 산업적인 대량배양 이용 시 낮은 온도에서 반응을 유도할 수 있어 효과적일 것으로 사료된다.
조효소액의 pH 특성을 확인하기 위해 0.1 N HCl 및 0.1 N NaOH를 이용하여 초기 pH를 조정하여 cellulose 분해 활성을 실험한 결과(Table 1), pH 8에서 환원당 함량이 344.70 μg/ml로 가장 높았고, 점도가 0.33 cP로 가장 낮았다.
조효소액의 온도에 따른 특성을 확인하기 위하여 pH 8에서 10-40℃로 온도를 달리하며 실험한 결과(Table 2), 35℃ 에서 환원당 함량 363.82 μg/ml, 점도가 0.38 cP로 가장 높은 활성을 나타내었다.
조효소액의 최적 기질 농도를 확인하기 위하여 pH 8 및 35℃ 조건에서 cellulose농도를 1-11%로 달리하여 실험한 결과(Table 3), cellulose 농도 8%에서 환원당 함량이 343.12 μg/ml으로 가장 높은 cellulose 분해 활성을 나타내는 것을 확인하였다.
초기 pH를 2에서 10까지 변화시키면서 배양한 균주의 생육 특성을 측정한 결과(Fig. 2A) pH 7에서 0.505으로 가장 높은 생육활성을 보였으며, pH 5 이하와 pH 9 이상에서는 생육이 정지하는 것을 확인하였다. 이 결과는 Cellulophaga lytica LBH-14 [4] 균주가 pH 7.
5에서 최적 cell growth를 보인다는 결과와 유사한 결과를 나타냈다. 해양유래 미생물인 C. lytica PKA 1005 균주와 NaCl 농도와의 생육관계를 알아보기 위하여 NaCl 농도를 변화시키면서 균주의 생육정도를 확인한 결과(Fig. 2B) C. lytica PKA 1005 균주의 경우 NaCl 농도 2, 3 및 4%에서 각각 흡광도 값이 0.557, 0.530및 0.523로 높은 생육활성을 보였으며, 그 중에서 2% NaCl 농도에서 균주의 성장이 가장 활발하였고, 5% 이상의 NaCl 농도에서는 균 생육이 억제되는 것으로 나타났다. 이는 해양 유래 미생물의 경우 NaCl 농도가 3% 내외의 범위에서 최적 생육활성을 보인다는 결과와 유사하였으며[11], 녹조류인 Ulva lactuca로부터 분리한 Bacillus flexus [24]가 최적 NaCl 농도 3.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
Cellulose는 무엇인가?
Cellulose는 자연계에 존재하는 가장 풍부한 탄수화물 자원으로 포도당이 β-1,4-glycosidic 결합으로 이루어진 중합체로 식물체의 약 40%를 차지하는 식물체 세포벽의 주요 구성성분이다[17, 18]. 이러한 cellulose를 활용하기 위해서는 cellulose를 가수분해하여 glucose로 전환함으로서 각종 산업에 이용할 수 있다.
각종 산업에 cellulose를 활용하기 위해, 어떤 과정이 필요한가?
Cellulose는 자연계에 존재하는 가장 풍부한 탄수화물 자원으로 포도당이 β-1,4-glycosidic 결합으로 이루어진 중합체로 식물체의 약 40%를 차지하는 식물체 세포벽의 주요 구성성분이다[17, 18]. 이러한 cellulose를 활용하기 위해서는 cellulose를 가수분해하여 glucose로 전환함으로서 각종 산업에 이용할 수 있다. 그 중에서 섬유소 분해 효소를 이용한 방법은 물리, 화학적 방법에 비해 많은 장점을 가지고 있으나, 반응 속도가 늦고 분해율이 낮으며 효소 비용이 비싸다는 단점을 가지고 있다.
해양유래 미생물인 C. lytica PKA 1005 균주의 생육 특성을 측정하였을 때, 균주와 NaCl 농도와의 생육관계는 어떠한가?
해양유래 미생물인 C. lytica PKA 1005 균주와 NaCl 농도와의 생육관계를 알아보기 위하여 NaCl 농도를 변화시키면서 균주의 생육정도를 확인한 결과(Fig. 2B) C. lytica PKA 1005 균주의 경우 NaCl 농도 2, 3 및 4%에서 각각 흡광도 값이 0.557, 0.530 및 0.523로 높은 생육활성을 보였으며, 그 중에서 2% NaCl 농도에서 균주의 성장이 가장 활발하였고, 5% 이상의 NaCl 농도에서는 균 생육이 억제되는 것으로 나타났다. 이는 해양 유래 미생물의 경우 NaCl 농도가 3% 내외의 범위에서 최적 생육활성을 보인다는 결과와 유사하였으며[11], 녹조류인 Ulva lactuca로부터 분리한 Bacillus flexus [24]가 최적 NaCl 농도 3.
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