In order to determine the functional benefits of Cordyceps militaris in the immune system, we examined the immunomodulatory activities of C. militaris using an immunocompromised C57BL/6 mice, mouse spleen cells, RAW 264.7 macrophage cells, and A549 lung carcinoma cells. Mice were injected intraperit...
In order to determine the functional benefits of Cordyceps militaris in the immune system, we examined the immunomodulatory activities of C. militaris using an immunocompromised C57BL/6 mice, mouse spleen cells, RAW 264.7 macrophage cells, and A549 lung carcinoma cells. Mice were injected intraperitioneally with an immunosuppressive drug, cyclophosphamide, and then administered orally with 30, 100 and 300 mg/kg of 50% ethanol extract of C. militaris (CME 30, CME 100 and CME 300) for 14 days. CME increased splenocyte proliferation and natural killer (NK) cell activity compared to 3% hydroxypropyl methylcellulose-treated control mice. CME also increased the production of Th1 cytokines, IL-2 and TNF-${\alpha}$ in spleen cells isolated from CME-injected mice and in vitro, which suggested the enhanced cellular immunity in response to CME. CME also increased splenocyte proliferation, NK cell activity, and IL-2 and TNF-${\alpha}$ production compared to 1 ${\mu}M$ methotrexate-treated spleen cells in vitro. We examined whether C. militaris regulates the production of inflammatory mediators in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. CME inhibited LPS-induced NO production and iNOS expression in a dose dependent manner, while COX-2 expression was remained unchanged. In addition, CME also has free radical scavenging activity, indicating its antioxidant activity. These results indicate that C. militaris enhances immune activity by promoting immune cell proliferation and cytokine production.
In order to determine the functional benefits of Cordyceps militaris in the immune system, we examined the immunomodulatory activities of C. militaris using an immunocompromised C57BL/6 mice, mouse spleen cells, RAW 264.7 macrophage cells, and A549 lung carcinoma cells. Mice were injected intraperitioneally with an immunosuppressive drug, cyclophosphamide, and then administered orally with 30, 100 and 300 mg/kg of 50% ethanol extract of C. militaris (CME 30, CME 100 and CME 300) for 14 days. CME increased splenocyte proliferation and natural killer (NK) cell activity compared to 3% hydroxypropyl methylcellulose-treated control mice. CME also increased the production of Th1 cytokines, IL-2 and TNF-${\alpha}$ in spleen cells isolated from CME-injected mice and in vitro, which suggested the enhanced cellular immunity in response to CME. CME also increased splenocyte proliferation, NK cell activity, and IL-2 and TNF-${\alpha}$ production compared to 1 ${\mu}M$ methotrexate-treated spleen cells in vitro. We examined whether C. militaris regulates the production of inflammatory mediators in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. CME inhibited LPS-induced NO production and iNOS expression in a dose dependent manner, while COX-2 expression was remained unchanged. In addition, CME also has free radical scavenging activity, indicating its antioxidant activity. These results indicate that C. militaris enhances immune activity by promoting immune cell proliferation and cytokine production.
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문제 정의
본 연구는 밀리타리스 동충하초의 면역력 증강 기전을 밝히는 연구로 면역 억제된 마우스에 밀리타리스 동충하초 에탄올 추출물을 투여하거나 또는 정상마우스에서 분리한 비장세포, 대식세포인 RAW 264.7 cell과 폐암세포인 A549 cell에 밀리타리스 동충하초 에탄올 추출물을 처리하여 면역증강 작용 및 면역조절 인자의 발현과 생성에 미치는 영향을 평가하였다. 그 결과 밀리타리스 동충하초 에탄올 추출물은 면역 억제된 마우스의 비장 무게와 비장세포의 증식을 증가시켰다.
본 연구에서는 밀리타리스 동충하초의 면역력 증강작용을 in vivo와 in vitro에서 비교, 평가하였다. 마우스에 cyclophosphamide를 투여하여 면역억제한 후 밀리타리스 동충하초 50% 에탄올 추출물을 14일간 경구투여하였다.
가설 설정
1)The results are expressed as mean±SEM of 8 mice per group.
16-18) 밀리타리스 동충하초의 항암효과는 세포사멸을 유도하는 caspase-3 활성 촉진과 세포의 생존을 조절하고 종양 형성에 기여하는 Akt의 비활성을 통해 암세포의 세포사멸을 유도하거나,16) telomerase 역전사효소의 전사기능을 억제시켜 암세포의 성장을 억제함으로서 나타난다.17) 항암 효과는 항암성분에 의한 직접적인 작용일 수도 있으나 면역기능을 강화시켜 나타내는 간접적인 작용일 수도 있다. 밀리타리스 동충하초는 자연살해세포(natural killer cell)의 작용을 강화시키고 항바이러스 사이토카인(cytokine)의 분비를 증가시켜 독감(influenza virus), 헤르페스 바이러스(herpes virus) 같은 바이러스 복제를억제한다.
The splenocytes were activated with ConA and the cell proliferation was measured by MTT assay. B. Administration of C. militaris enhances NK cell activity. The splenocytes were incubated with YAC-1 cell and the released LDH was determined by LDH cytotoxicity assay.
제안 방법
밀리타리스 동충하초가 다양한 종류의 암세포 증식을 억제함이 보고되었다.16-18) 우리는 CME가 세포증식에 영향을 미치는 농도가 세포에 따라 차이가 있는지와 CME의 폐암세포 억제작용을 검정하기 위하여 사람의 폐암 상피세포인 A549 cell에 CME를 처리하였다. 10 μg/ml CME는 A549 cell의 증식을 14.
밀리타리스 동충하초는 자연살해세포(natural killer cell)의 작용을 강화시키고 항바이러스 사이토카인(cytokine)의 분비를 증가시켜 독감(influenza virus), 헤르페스 바이러스(herpes virus) 같은 바이러스 복제를억제한다.19) 이러한 항종양, 항바이러스 작용은 면역증강 작용과 밀접한 연관을 가지므로 우리는 밀리타리스 동충하초의 면역증강 작용을 연구하였다.
96-well U-bottom culture plate에 1×104 cells/100 μl의 YAC-1 세포를 넣고 비장세포 : YAC-1 세포(effector-to-target) 비가 200 : 1, 100 : 1, 50 : 1이 되도록 비장세포를 넣은 후 37oC, 5% CO2에서 4시간 동안 배양하였다.
96-well plate에 각 농도(0, 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 5 mg/ml)의 CME 또는 cordycepin(0, 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1 mg/ml)과 양성 대조물질인 비타민 C와 동량의 300 μM DPPH를 혼합하여 37℃에서30분간 배양한 후 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
IL-2와 TNF-α의 농도는 표준액을 사용하여 얻은 표준곡선에 따라 계산하였다.
IL-2와 TNF-α의 생성을 증가시켰고, cyclophosphamide에 의해 저하된 자연살해세포 활성을 증가시켰다.
RAW 264.7 cell을 96-well plate에 1×105 cells/well로 분주하고, 24시간 부착한 후 1 μg/ml lipopolysaccharide(LPS)와 0, 10, 20, 50, 100 μg/ml 농도의 CME를 처리하였다.
TBST buffer로 세척한 후 HRP가 결합된 2차 항체와 실온에서 30분간 반응시켰다. TBST buffer로 세척하고 enhanced chemiluminescence kit(Thermo Scientific, IL, USA)로 blot을 반응시킨 후 X-ray film에 현상하여 확인하였다.
밀리타리스 동충하초 추출물 투여군(CME)은 cyclophosphamide를 day 0과 3에 복강투여하고, 3% HPMC에 현탁한 CME를 day 1부터 30 mg/kg(CME 30), 100 mg/kg (CME 100) 그리고 300 mg/kg(CME 300) 용량으로 14일 동안 매일 1회 경구투여하였다. 각 군의 마우스는 day 14에 희생하여, 체중 및 면역 장기의 무게를 측정하였고, 비장을 적출하여 면역학적 분석에 사용하였다.
대식세포인 RAW 264.7 cell과 대표적인폐암(lung adenocarcinoma) 세포인 A549 cell의 증식은 1 μg/ml LPS와 CME를 처리하여 배양한 후 MTT법으로 측정하였다.
정상군(normal group)은 생리식염수를 실험 시작일(day 0)과 day 3에 복강투여하고, 밀리타리스 동충하초 추출물 현탁액인 3% hydroxypropyl methylcellulose(HPMC)를 day 1부터 매일 1회 경구투여하였다. 대조군(control group)은 면역억제제인 cyclophosphamide를 실험 시작일(day 0)에 150 mg/kg, day 3에 100 mg/kg 복강투여하고 3% HPMC를 day 1부터 매일 1회 경구투여하였다. 밀리타리스 동충하초 추출물 투여군(CME)은 cyclophosphamide를 day 0과 3에 복강투여하고, 3% HPMC에 현탁한 CME를 day 1부터 30 mg/kg(CME 30), 100 mg/kg (CME 100) 그리고 300 mg/kg(CME 300) 용량으로 14일 동안 매일 1회 경구투여하였다.
동충하초가 비장세포의 DNA 합성을 촉진시켜 비장의 무게를 증가시킨다는 보고29)가 있으므로 면역억제 마우스 비장세포 증식에 미치는 CME의 영향을 측정하였다. 마우스에 cyclophosphamide를 주사하여 면역력을 억제시킨 후 3% HPMC를 투여한 대조군의 비장세포 증식을 100%로 하였을 경우, 면역력을 억제시키지 않은 정상군의 비장세포는 144.
또한 in vitro에서 밀리타리스 동충하초 추출물의 비장세포 증식에 미치는 영향을 측정하기 위하여 cyclophosphamide로 면역 억제한 마우스의 비장세포와는 별도로 정상 마우스에서 비장세포를 분리한 후 면역억제 작용이 있는 1 μM methotrexate(MTX) 처리하여 24시간 동안 배양한 후 1 μg/ml ConA와 0~100 μg/ml의 CME를 처리하였다.
또한 동충하초 추출물은 methotrexate에 의해 감소된 IL-2와 TNF-α의 생성을 증가시켰다.
또한 일정 농도에서 methotrexate에 의해 감소된 정상 마우스 비장세포의 증식과 IL-2와 TNF-α의 생성을 증가시켰다.
또한 정상 마우스의 비장에서 분리한 비장세포를 96-well plate에 5×105 cells/well이 되도록 분주하고 MTX 처리하여 24시간 배양한 후 1 μg/ml ConA와 CME를 농도 별로 첨가한 후 48시간 배양하여 유리된 IL-2와 TNF-α를 측정하였다.
마우스를 희생하여 체중 및 비장의 무게, 비장세포의 증식과 IL-2와 TNF-α의 생성, 자연살해 세포 활성을 측정하였다.
본 연구에서는 밀리타리스 동충하초의 면역력 증강작용을 in vivo와 in vitro에서 비교, 평가하였다. 마우스에 cyclophosphamide를 투여하여 면역억제한 후 밀리타리스 동충하초 50% 에탄올 추출물을 14일간 경구투여하였다. 마우스를 희생하여 체중 및 비장의 무게, 비장세포의 증식과 IL-2와 TNF-α의 생성, 자연살해 세포 활성을 측정하였다.
면역력을 억제시킨 마우스에서 관찰한 결과가 in vitro에서도 유사하게 나타내는지 알아보기 위하여 정상 마우스에서 분리한 비장세포에 1 μg/ml ConA와 CME를 처리하였다.
면역억제 마우스에서 분리한 비장세포를 24-well plate에 5×106 cells/well이 되도록 분주한 후, 5 μg/ml의 ConA를 첨가하여 48시간 동안 배양한 후 배양액에 유리된 IL-2와 TNF-α를 ELISA kit(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 측정하였다.
대조군(control group)은 면역억제제인 cyclophosphamide를 실험 시작일(day 0)에 150 mg/kg, day 3에 100 mg/kg 복강투여하고 3% HPMC를 day 1부터 매일 1회 경구투여하였다. 밀리타리스 동충하초 추출물 투여군(CME)은 cyclophosphamide를 day 0과 3에 복강투여하고, 3% HPMC에 현탁한 CME를 day 1부터 30 mg/kg(CME 30), 100 mg/kg (CME 100) 그리고 300 mg/kg(CME 300) 용량으로 14일 동안 매일 1회 경구투여하였다. 각 군의 마우스는 day 14에 희생하여, 체중 및 면역 장기의 무게를 측정하였고, 비장을 적출하여 면역학적 분석에 사용하였다.
밀리타리스 동충하초 추출물(CME)이 마우스의 체중 및 면역 장기의 무게에 미치는 영향을 알아보기 위하여 마우스의 체중 및 비장의 무게를 측정하였다(Table I). 모든 실험군에서 실험이 진행된 14일간 약 5% 정도의 체중이 증가되어 면역억제제인 cyclophosphamide 및 CME 투여가 실험동물의 체중에는 영향을 주지 않음을 알 수 있었다(Table I).
밀리타리스 동충하초 추출물을 투여한 마우스에서 관찰한 결과를 in vitro에서 증명하기 위하여 정상 마우스의 비장세포를 분리하여 증식 및 IL-2와 TNF-α의 분비를 측정하였다.
밀리타리스 동충하초 추출물의 사이토카인 생성에 미치는 영향을 cyclophosphamide 투여한 면역억제 마우스 비장세포와 정상 마우스에서 추출한 비장세포에 MTX를 처리한 세포로 나누어 측정하였다. 면역억제 마우스에서 분리한 비장세포를 24-well plate에 5×106 cells/well이 되도록 분주한 후, 5 μg/ml의 ConA를 첨가하여 48시간 동안 배양한 후 배양액에 유리된 IL-2와 TNF-α를 ELISA kit(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 측정하였다.
밀리타리스 동충하초 추출물의 항산화 활성을 동충하초의 주요 성분인 cordycepin과 대표적 항산화 물질인 비타민 C와 비교하여 DPPH radical 소거 능력으로 측정하였다. CME 농도가 0.
밀리타리스 동충하초 추출물이 NK 세포 활성에 미치는 영향을 측정하였다. 대조군 마우스의 NK 세포 활성(% cytotoxicity)은 비장세포 : YAC-1 비율이 200 : 1, 100 : 1, 50 : 1인 경우 16.
밀리타리스 동충하초 추출물이 RAW 264.7 cell의 사이토카인 분비에 미치는 영향을 알아보기 위해 IL-2와 TNF-α를 측정하였다.
밀리타리스 동충하초 추출물이 사이토카인 분비에 미치는 영향을 알아보기 위해 주로 세포성 면역을 조절하는 Th1 사이토카인 중에서 IL-2와 TNF-α를 측정하였다.
밀리타리스 동충하초가 면역과 염증반응에서 중요한 역할을 담당하는 대식세포에 미치는 영향을 측정하였다. CME는 50 μg/ml 이상의 농도에서 RAW 264.
1% Tween 20)에 녹인 6% skim milk 용액에 넣고 실온에서 2시간 교반하였다. 비특이적 결합을 차단한 blot을 iNOS(BD Pharmingen, San Diego, CA, USA)와 COX-2(Santa Cruz, Santa Cruz, CA, USA)에 특이적으로 결합하는 항체와 실온에서 1시간 결합시켰다. TBST buffer로 세척한 후 HRP가 결합된 2차 항체와 실온에서 30분간 반응시켰다.
세포에 단백질 분해효소 억제제(10 μM leupeptin, 20 μg/ml chymostain, 2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride)를 함유한 radioimmunoprecipitation assay(RIPA) buffer를 넣고 30분간 얼음에서 lysis 시킨 후 원심분리하여 단백질 시료를 얻었다.
마우스는 5군(n=8)으로 분류하여 처치하였다. 정상군(normal group)은 생리식염수를 실험 시작일(day 0)과 day 3에 복강투여하고, 밀리타리스 동충하초 추출물 현탁액인 3% hydroxypropyl methylcellulose(HPMC)를 day 1부터 매일 1회 경구투여하였다. 대조군(control group)은 면역억제제인 cyclophosphamide를 실험 시작일(day 0)에 150 mg/kg, day 3에 100 mg/kg 복강투여하고 3% HPMC를 day 1부터 매일 1회 경구투여하였다.
대상 데이터
마우스 대식세포주 RAW 264.7 cell(ATCC, Manassas, VA, USA)은 Dulbecco's modified eagle's medium(DMEM)에 사람의 폐 상피세포주 A549 cell(ATCC)은 Ham's F-12 medium에 10% FBS, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin을 첨가하여 37oC, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
면역억제 실험에 사용한 마우스(정상군, 대조군, CME)의 비장세포에 1 μg/ml concanavalin A(ConA)를 넣고 48시간 배양하였다.
본 연구에 사용된 마우스는 수컷 C57BL/6(6~7주령, 체중 18~23 g)로 오리엔트 바이오(성남, 한국)로부터 구입하였다. 동물실험은 동아ST(주) 연구본부 동물실험윤리위원회(IACUC)의 승인(승인번호 I-1111006)과 인하대학교 의과대학 동물실험윤리위원회의 승인(INHA 130605-206)을 받았으며 그 규정을 준수하여 실시하였다.
본 연구에 사용된 밀리타리스 동충하초는 (주)머쉬텍(횡성, 한국)으로부터 제공받았다. 건조된 밀리타리스 동충하초를 파쇄한 후 50% 에탄올에서 3일간 상온, 상압에서 추출하여 여과, 농축, 살균을 거친 후 분무 건조하였다.
비장세포를 배양액(RPMI 1640 containing 10% fetal bovine serum(FBS), 100 U/ml penicillin, and 100 μg/ml streptomycin)에 현탁 후 실험에 사용하였다.
표준액은 0~100 μM의 sodium nitrate를 사용하였다.
데이터처리
본 실험 자료의 통계처리는 Student's t-test를 실시하여 평균치(mean)와 표준편차(SD) 또는 표준오차(SEM)로 나타내었고, p값이 0.05 미만일 때 유의성이 있다고 판정하였다.
이론/모형
LDH cytotoxic assay는 LDH assay kit(Abcam, Cambridge, England)를 이용하여 실행하였다. 세포배양액에 LDH working mixture를 100 μl 첨가하고 실온(15~25℃)의 암소에서 30분간 반응 후, 반응정지 용액인 1N HCl 50 μl를 첨가한 후 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
마우스 비장세포, RAW 264.7 cell과 A549 cell의 증식은 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 방법으로 측정하였다.27) 비장세포를 96-well plate에 5×105 cells/well이 되도록 분주하였다.
DPPH가 가진 radical은 알코올 등의 유기용매에서 안정하며 proton-radical scavenger에 의해 탈색되므로 광흡수가 되는 비율을 이용하여 항산화 정도를 측정한다. 밀리타리스 동충하초의 유리기 소거 활성을 DPPH assay로 측정하였다. 96-well plate에 각 농도(0, 0.
사이토카인의 측정은 제조회사의 실험방법에 따라 실험하였다. 96-well plate에 각각 IL-2와 TNF-α의 capture antibody를 18시간 동안 부착시킨다.
자연살해(NK)세포의 세포 독성은 NK세포가 NK-sensitive한 YAC-1 세포(한국세포주은행)를 공격하여 파괴된 YAC-1 세포로부터 유리된 lactate dehydrogenase를 측정하는 방법(LDH cytotoxic assay)을 이용하였다. 96-well U-bottom culture plate에 1×104 cells/100 μl의 YAC-1 세포를 넣고 비장세포 : YAC-1 세포(effector-to-target) 비가 200 : 1, 100 : 1, 50 : 1이 되도록 비장세포를 넣은 후 37oC, 5% CO2에서 4시간 동안 배양하였다.
CME는 MTX에 의해 억제된 정상 마우스 비장세포의 IL-2의 분비를 증가시켰고 10 μg/ml에서 가장 효과가 가장 좋았으며, TNF-α의 분비는 1~50 μg/ml에서 일부 회복시켰다.
그 결과 Kim 등30)의 보고와 같이 동충하초 추출물은 면역억제 마우스의 체중에는 영향을 주지 않았으나 비장의 무게는 증가시켰다. Cyclophosphamide는 비장세포의 증식을 억제하였고, 동충하초 추출물은 용량 의존적으로 비장세포 증식을 증가시켰다. 동충하초 추출물은 IL-2와 TNF-α의 분비를 증가시켰으며 자연살해세포의 활성을 현저하게 증가시켰다.
7 cells was determined by Griess reaction (n=4). D. Protein expressions of iNOS and COX-2 were measured (n=3). Data were mean±SD, *p<0.
LPS 처리군에서 TNF-α는 2226.5±274.7 pg/ml로 LPS를 처리하지 않은 대조군의 241.2±62.1 pg/ml에 비해 9배 이상 증가하였고, 20 μg/ml CME는 2420.4±274.4 pg/ml로 LPS 처리군에 비해 약간 증가하였다(Fig. 3B).
3C). NO를 생성하는 iNOS와 prostaglandin을 생성하는 COX-2 발현을 측정한 결과, LPS는 iNOS 및 COX-2의 발현을 증가시켰으며, CME는 LPS에 의해 유도된 iNOS의 발현을 농도 의존적으로 억제하였으나 COX-2의 발현에는 영향을 미치지 않았다(Fig. 3D). 밀리타리스 동충하초 부탄올(butanol) 추출물39)과 70% 에탄올 추출물40)이 COX-2의 발현을 농도 의존적으로 감소시킨다는 보고와 에탄올 추출물이 COX-2의 발현을 증가시킨다는 상반된 보고41)가 있다.
TNF-α의 분비는 유의하게 변화시키지 않았으며, NO분비는 농도 의존적으로 억제하였다.
7 cell과 폐암세포인 A549 cell에 밀리타리스 동충하초 에탄올 추출물을 처리하여 면역증강 작용 및 면역조절 인자의 발현과 생성에 미치는 영향을 평가하였다. 그 결과 밀리타리스 동충하초 에탄올 추출물은 면역 억제된 마우스의 비장 무게와 비장세포의 증식을 증가시켰다. IL-2와 TNF-α의 생성을 증가시켰고, cyclophosphamide에 의해 저하된 자연살해세포 활성을 증가시켰다.
동충하초 추출물은 IL-2와 TNF-α의 분비를 증가시켰으며 자연살해세포의 활성을 현저하게 증가시켰다.
동충하초 추출물은 methotrexate에 의해 감소된 비장세포의 증식을 저농도(0.1~5 μg/ml)에서는 증가시켰으나 20 μg/ml 이상의 고농도에서는 억제하였다.
마우스에 cyclophosphamide를 주사하여 면역력을 억제시킨 후 3% HPMC를 투여한 대조군의 비장세포 증식을 100%로 하였을 경우, 면역력을 억제시키지 않은 정상군의 비장세포는 144.1±10.0%로 cyclophosphamide는 31% 억제하였다(Fig. 1A).
2B). 마우스에 경구로 투여한 CME의 생체 농도와 in vitro에서 처리한 농도사이의 절대적인 비교 실험은 현실적으로 어렵고 보고된 선행연구가 없으므로 우리는 본 실험을 통하여 마우스 비장세포의 in vitro 실험에서의 CME의 적정 농도를 알 수 있었다.
면역억제제인 MTX를 처리한 후 ConA와 CME를 넣고 비장세포의 증식을 측정한 결과, MTX 처리는 비장세포의 증식을 억제하였으며 CME는 저농도(0.1~5 μg/ml)에서는 MTX에 의한 증식억제를 일부 회복시켰으나 20 μg/ml 이상의 고농도에서는 세포증식을 억제하였다(Fig. 2B).
밀리타리스 동충하초 추출물(CME)이 마우스의 체중 및 면역 장기의 무게에 미치는 영향을 알아보기 위하여 마우스의 체중 및 비장의 무게를 측정하였다(Table I). 모든 실험군에서 실험이 진행된 14일간 약 5% 정도의 체중이 증가되어 면역억제제인 cyclophosphamide 및 CME 투여가 실험동물의 체중에는 영향을 주지 않음을 알 수 있었다(Table I). 비장의 무게는 모든 CME 투여군에서 대조군에 비해 증가하였으며, CME 100은 33.
밀리타리스 동충하초 추출물은 대식세포 RAW 264.7 cell의 증식을 1 μg/ml 농도에서 증가시켰고 20 μg/ml 이상의 농도에서는 억제하였다.
4%로 대조군에 비해 증가되었다(200 : 1과 50 : 1 통계적으로 유의). 본 실험에서 CME 100의 NK 세포 활성이 가장 높아 Kim 등이 보고30)한 CME 300에서 NK 세포 활성이 가장 높았던 결과와는 용량 차이가 있지만 밀리타리스 동충하초 추출물이 NK 세포의 활성을 증가시킴을 확인하였다.
모든 실험군에서 실험이 진행된 14일간 약 5% 정도의 체중이 증가되어 면역억제제인 cyclophosphamide 및 CME 투여가 실험동물의 체중에는 영향을 주지 않음을 알 수 있었다(Table I). 비장의 무게는 모든 CME 투여군에서 대조군에 비해 증가하였으며, CME 100은 33.5%, CME 300은 14.4% 증가하여 CME 100이 가장 효과가 좋았다. 따라서 밀리타리스 동충하초 추출물은 비장세포의 증식을 촉진하는 것으로 생각된다.
7 cell을 사용한 다른 보고에 비하여 수십~수백 배 낮은 농도이다. 이 결과들은 밀리타리스 동충하초의 세포 증식에 영향을 미치는 농도가 세포의 종류에 따라 차이가 있을 것을 암시한다. 밀리타리스 동충하초가 다양한 종류의 암세포 증식을 억제함이 보고되었다.
이 결과로 100 μg/ml CME가 RAW 264.7 cell 증식을 62.5% 억제한 것에 비하여 A549 cell의 억제율은 현저히 낮아 밀리타리스 동충하초에 대한 세포의 감수성이 서로 다름을 알 수 있다.
이상의 결과는 밀리타리스 동충하초 추출물이 IL-2와 TNF-α의 분비를 조절함을 나타내며, 앞서 보인 면역억제 마우스의 결과와 일치한다.
이상의 결과를 종합해 보면 밀리타리스 동충하초는 억제된 면역력을 회복, 증강시키며, 이러한 면역 증강작용은 일정한 농도 범위에서 일어나므로 밀리타리스 동충하초를 복용하는 경우 일정한 약리학적 농도를 유지하는 것이 중요할 것으로 생각된다.
3-5) 자생하는 동충하초는 다량 채취가어려워 대중적인 약재가 되지 못했으나 인공재배 기술이 개발되어 대량생산이 가능해짐에 따라 많은 연구가 시행되었고 대중화되었다.6-8) 예로부터 동충하초는 자양강장, 신장과 간의 보호작용, 면역기능 강화, 항균작용, 항종양작용, 산화방지, 혈당강하, 콜레스테롤과 중성지질 저하 효과 등이 알려져 있다.9-12) 시넨시스 동충하초(Cordyceps sinensis)와 밀리타리스 동충하초(Cordyceps militaris)가 대표적인 동충하초이며 가장 많이 연구되어 있다.
밀리타리스 동충하초는 폐암,간암,유방암,직장암 세포의 증식을 억제하는데 이러한 항암효과는 어떤 원리로 억제하는가?
밀리타리스 동충하초는 폐암, 간암, 유방암, 직장암 세포의 증식을 억제한다.16-18) 밀리타리스 동충하초의 항암효과는 세포사멸을 유도하는 caspase-3 활성 촉진과 세포의 생존을 조절하고 종양 형성에 기여하는 Akt의 비활성을 통해 암세포의 세포사멸을 유도하거나,16) telomerase 역전사효소의 전사기능을 억제시켜 암세포의 성장을 억제함으로서 나타난다.17) 항암 효과는 항암성분에 의한 직접적인 작용일 수도 있으나 면역기능을 강화시켜 나타내는 간접적인 작용일 수도 있다.
동충하초란?
동충하초는 자낭균강(Ascomycetes), 맥각균목(Clavicipitales), 맥각균과(Clavicipitaceae)에 속하며 전 세계적으로 400종 이상, 국내에 80여종이 자생하는1,2) 곤충의 충체내에서 자실체를 형성하여 기생하는 진균이다.3-5) 자생하는 동충하초는 다량 채취가어려워 대중적인 약재가 되지 못했으나 인공재배 기술이 개발되어 대량생산이 가능해짐에 따라 많은 연구가 시행되었고 대중화되었다.
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