[논문]감잎의 광노화 피부 개선에 미치는 효과(2)

이창현; 김남석; 최동성; 오미진; 마상용; 김명순; 유승정; 권진; 신현종; 오찬호

감잎의 광노화 피부 개선에 미치는 효과(2)
Effects of Persimmon leaf on the Photoaging Skin Improvement(2) 원문보기

동의생리병리학회지 = Journal of physiology & pathology in Korean Medicine, v.28 no.1, 2014년, pp.35 - 44

이창현 (우석대학교 한의과대학) , 김남석 (우석대학교 식품생명공학과) , 최동성 (우석대학교 식품생명공학과) , 오미진 (우석대학교 식품생명공학과) , 마상용 (우석대학교 대체의학과) , 김명순 (우석대학교 대체의학과) , 유승정 (동상면사람들) , 권진 (한국복지대학교 의료보장구과) , 신현종 (우석대학교 한의과대학) , 오찬호 (우석대학교 식품생명공학과)

Abstract ▼ AI-Helper

This study was performed to investigate the anti-photoaging effects of Persimmon leaf tea(PLT) in hairless mice(SKH-1) exposed to UVB radiation. The animals were divided into non-treated group (normal, N) and UV-radiated groups. UV-radiated groups were divided into only UV-radiated group(control, C) and UV-radiated and PLT treated experimental groups[first extraction treated group(PLT-I), second extraction treated groupe(PLT-II), and third extraction treated group(PLT-III)]. Three PLT treated experimental groups of mice were treated with both oral administration(300mg/Kg B.W./day) and topical application (100 ul of 2% conc./mouse/day) for 4 weeks. Anti-photoaging effects of Persimmon leaf were evaluated by MTT assay, anti oxidative reaction, MMP immunohistochemistry, gelatin zymography assay and RT-PCR observations. Treatment with Persimmon leaf tea(PLT)-I, and -III groups decreased immunohistochemical density of matrix metalloproteinases(MMP)-3 and -9 related to degradation of extracellular matrix in skin. Especially, immunohistochemical density of MMP-2 decreased in PLT-I, -II and -III groups in skin. On the effects of antioxidant function on the treatment with Persimmon leaf tea(PLT), treatment of HaCaT cells with extracts of PLT-I and PLT-II had also significantly reduced intracellular ROS produced by UVB irradiation in a dose dependent manner(PLT-I, p<0.05, p<0.01, p<0.001; PLT-II, p<0.01, p<0.001). Gelatin zymography assay revealed that PLT-II and PLT-III (200 ug/ml) had inhibitory effect on MMP-9 expression in UVB-radiated HaCaT cells. Western blot analysis revealed that PLT-1, -II and -III groups down-regulates the expression of inflammatory associated genes(IL-$1{\beta}$) and PLT-1 and -II groups down-regulates the expression of TNF-${\alpha}$ in a dose dependent manner. Our study suggests that Persimmon leaf tea(PLT) extracts participates in inhibitory effects on the morphological and molecular experiments related to photoaging skin on UVB irradiated hairless mice.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

그러므로 본 연구는 천연소재에서 항산화 기능을 갖고 있는 감잎의 피부 노화예방 및 조절을 확인하기 위해 HaCaT cell line 을 이용하여 항산화 기능과 주름개선 효과를 관찰하였고, hairless 마우스에 반복적인 UVB를 조사하여 광노화 피부를 유발시킨 후 감잎 열수추출물을 경구투여 및 도포를 하여 면역조직화학 염색법 및 분자생물학적 방법에 의하여 주름생성 물질과 염증관련 물질의 변화 등을 관찰하여 피부노화 개선 효과에 대한 유효성을 알아보고자 하였다.
현재까지 감잎의 연구는 감잎 추출물의 항산화 효과와 알레르기와 관련된 연구는 많이 진행되어 있으나 감잎 추출물의 광노화피부와 관련된 연구는 미흡한 실정이다. 그러므로 본 연구에서는 감잎 추출물의 광노화피부 개선 효과를 관찰하기 위하여 hairless mice를 이용하여 자외선에 의한 광노화 피부 억제인자들의 변화를 면역조직화학 염색 및 분자생물학적으로 관찰하였다.

제안 방법

β-actin을 internal control로 사용하여 TNF-α, IL-1β의 발현을 상대적으로 평가하였다.
25% Triton X-100에 30분 동안 두 번 담가 SDS를 제거하였다. 3차 증류수로 씻은 후 0.1% (w/v) Coomassie blue R-250 용액에서 30분 간 염색하여 관찰하였다.
HaCaT 세포를 60 mJ/cm²의 UV로 자극하고 16시간 동안 배양한 후 감잎차추출물(PLT-I, PLT-II, PLT-III)을 농도별로 처리(50, 100, 200, 300 ㎍/㎖)하고 DCFH-DA를 10 μM의 농도로 5분 동안 처리한 후 형광도를 측정하였다. DCF 형광도는 excitation 485 ㎚, emission 530 ㎚의 파장에서 Wallac 1420 VICTOR3 multilabel counter(PerkinElmer Life Science, Turku, Finland)로 측정하였다.
감잎차 추출물의 HaCaT 세포에서의 MMP-9의 활성에 대한 효능을 관찰하고자 gelatin zymographic assay를 시행하였다. HaCaT cell은 다양한 농도의 감잎차 추출물(PLT-I, -II, -III)로 1시간 동안 선처리 하였다. 60 mJ/cm2의 UVB로 자극을 하고 24시간 동안 배양한 후 배양액을 전기영동하였다.
HaCaT 세포를 60 mJ/cm2의 UV로 자극하고 16시간 동안 배양한 후 감잎차추출물(PLT-I, PLT-II, PLT-III)을 농도별로 처리(50, 100, 200, 300 ㎍/㎖)하고 DCFH-DA를 10 μM의 농도로 5분 동안 처리한 후 형광도를 측정하였다.
다양한 추출조건에서 추출한 감잎차 추출물(PLTs)이 UVB에 의하여 증가된 세포내 ROS에 미치는 영향을 관찰하고자 DCFH-DA assay를 시행하였다. HaCaT 세포에 60 mJ/cm2의 UVB로 자극하여 12시간을 방치한 후 감잎차 추출물을 농도별로 처리함과 아울러 DCFH-DA 시약을 처리하고, 5분 후 형광 흡광도를 측정하였다. 그림 16-18에서 보는 바와 같이 UVB의 자극은 세포 내 ROS의 생성을 유의성있게 현저히 증가시켰으며(2nd column, #p<0.
MMP-9의 분비를 측정하기 위하여 substrate gel zymography를 시행하였다²⁵⁾. HaCaT 세포를 3×10⁵cell/ml의 농도로 분주하였다.
Mosmann이 보고한 방법²⁴⁾에 따라 살아있는 세포의 효소활성으로 인한 tetrazolium dye인 MTT를 자줏빛의 불용해성 포르마잔으로 환원하는 원리를 이용한 MTT assay를 통하여 감잎이 HaCaT 세포의 생존에 미치는 효과를 측정하였다. HaCaT 세포를 96-well plate에 well 당 1×10⁵cells 밀도로 분주한 후 감잎을 농도별로 처리한 후 37℃, 5 % CO₂, 습도 100% 배양기에서 24시간 동안 배양하였다.
각각의 cycle은 95℃에서 30초 동안 denaturation, 62℃(TNF-α: 59℃)에서 30 초 동안 annealing, 72℃에서 40초 동안 extension시켰다. PCR product는 1 % agarose gel에서 전기영동 하였고, ethidium bromide로 염색을 한 후 Gel Doc(Bio-Rad, USA)을 사용하여 관찰하였다. β-actin을 internal control로 사용하여 TNF-α, IL-1β의 발현을 상대적으로 평가하였다.
Spectrophotometer를 이용하여 RNA의 농도를 측량한 후 M-MLV reverse transcriptase(Promega, Madison, WI, USA)에 의하여 cDNA를 합성하였고, specific primer 들을 이용한 PCR방법을 통하여 cDNA를 증폭하였다. PCR 증폭을 하기 위하여 TaqPCRxDNA polymerase, Recombinant (Invitrogen)을 사용하였고, 반응조건은 다음과 같이 하였다. 95℃에서 5분간 초기 denaturation 시킨 후 30 cycle을 증폭시켰다.
SKH-1 hairless mice의 피부조직의 세포외기질(extracellular matrix) 분해능의 지표를 관찰하기 위하여 MMP-2 항체를 이용하여 면역조직화학 염색을 시행하였다. MMP-2의 발현은 UVB를 조사하지 않은 정상군(N)(Fig.
SKH-1 hairless mice의 피부조직의 세포외기질(extracellular matrix) 분해능의 지표를 관찰하기 위하여 MMP-3 항체를 이용하여 면역조직화학 염색을 시행하였다. MMP-3의 발현은 UVB를 조사하지 않은 정상군(N)(Fig.
SKH-1 hairless mice의 피부조직의 세포외기질(extracellular matrix) 분해능의 지표를 관찰하기 위하여 MMP-9 항체를 이용하여 면역조직화학 염색을 시행하였다. MMP-9의 발현은 UVB를 조사하지 않은 정상군(N)(Fig.
SKH-1 hairless 생쥐 모델을 이용하여 UVB 조사 후 감잎 열수추출물을 경구투여하고 도포한 후 HaCaT세포에서의 세포독성, 활성산소종 생성 억제, 주름생성 및 염증관련 인자에 대한 분자생물학적인 관찰 및 MMP2, -3, -9발현에 대한 면역조직화학적 염색을 시행하여 광노화피부 억제 효과를 관찰한 바 다음과 같은 결과를 얻었다.
Total RNA는 Trizol reagent(Invitrogen)를 이용하였으며 제조회사의 방법에 준하였다. Spectrophotometer를 이용하여 RNA의 농도를 측량한 후 M-MLV reverse transcriptase(Promega, Madison, WI, USA)에 의하여 cDNA를 합성하였고, specific primer 들을 이용한 PCR방법을 통하여 cDNA를 증폭하였다. PCR 증폭을 하기 위하여 TaqPCRxDNA polymerase, Recombinant (Invitrogen)을 사용하였고, 반응조건은 다음과 같이 하였다.
최소홍반량은 hairless 생쥐의 등에 1x1㎠의 넓이로 소구획을 나눈 후 UVB를 30 mJ/㎠에서 80 mJ/㎠까지의 조사량을 10 mJ/㎠ 간격으로 조사한다. UVB 조사 후 24시간이 경과한 후에 경계가 분명하고 네 모서리가 뚜렷한 홍반을 보이는 가장 낮은 광량인 60 mJ/㎠을 최소홍반량으로 정하였다.
실험동물의 UVB 조사는 아크릴로 제작한 조사틀에 실험군 별로 각각의 생쥐를 가둔 후 생쥐의 등부위가 노출되도록 위쪽은 철망을 부착한다. UVB 조사량은 최초 1주간은 1 MED(minimal erythema dose)에 해당하는 60 mJ/㎠를 1주에 5회(200초)씩 조사하였고, 2주는 120 mJ/㎠(400초), 3주는 180 mJ/㎠(600초), 4주는 240 mJ/㎠(800초)로 1주에 5회씩 조사하여 총 4주간 실시하였다.
UVB를 조사한 HaCaT세포에서의 MMP-9의 활성에 대한 효능을 관찰하고자 gelatin zymography assay를 시행한 바 감잎차 (PLT)-II와 감잎차(PLT)-III 처리군의 200 ug/ml의 농도에서 MMP-9의 활성을 감소시켰다.
용량으로 1일 1회 경구 투여하였다. 각 실험군의 감잎차 도포액은 에탄올, 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 증류수를 각각 30:20:50(v/v/v)의 비율로 잘 혼합한 기본로션에 감잎차 동결건조물을 2% 농도(1 g/50 ㎖)로 첨가하여 제조한 후 1일 1회 도포액 100 ㎕를 hairless 생쥐의 귀에서 등부위 전체에 도포한 후 잘 문질러준 후 1시간 후에 UVB를 등부분에 조사하였다. 실험이 종료된 후 실험동물을 마취한 후 혈액을 채취한 후 혈액학적 분석에 사용하였고, 등쪽 피부조직을 절취하여 일부는 냉동고에 보관한 후 분자생물학적 검사에 사용하였고, 일부는 Bouin solution 과 10% 중성 포르말린 용액에 고정하여 광학 및 면역조직화학적 염색에 사용하였다.
최종적으로 2차 추출 후 다시 70℃의 따뜻한 물 2 L에 담구어 우려낸 것을 감잎차 추출물 III군(PLT-III)이라고 하였다. 각각의 회수한 감잎차 추출액은 여과하여 감압건조기에서 농축하고 동결건조하여 최종 수득물을 회수하였다. 회수한 시료는 PLT-I은 77.
정상군은 아무런 처치도 하지 않았으며, 대조군은 생리식염수 투여 후 무시료 도포액인 기본로션(vehicle)만을 도포한다. 감잎차 추출물 투여군은 각각 회수한 감잎차 동결건조물 300 mg을 10 ㎖의 증류수에 용해하여 300 mg/Kg B.W. 용량으로 1일 1회 경구 투여하였다. 각 실험군의 감잎차 도포액은 에탄올, 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 증류수를 각각 30:20:50(v/v/v)의 비율로 잘 혼합한 기본로션에 감잎차 동결건조물을 2% 농도(1 g/50 ㎖)로 첨가하여 제조한 후 1일 1회 도포액 100 ㎕를 hairless 생쥐의 귀에서 등부위 전체에 도포한 후 잘 문질러준 후 1시간 후에 UVB를 등부분에 조사하였다.
감잎차 추출물은 건조한 감잎 500g을 70℃의 따뜻한 물 2 L에 20분간 담구어 우려낸 것을 감잎차 추출물 I군(persimmon leaf tea, PLT-I)이라하였고, 1차로 추출한 후 다시 70℃의 따뜻한물 2 L에 담구어 우려낸 것을 감잎차 추출물 II군(PLT-II)이라고 하였다. 최종적으로 2차 추출 후 다시 70℃의 따뜻한 물 2 L에 담구어 우려낸 것을 감잎차 추출물 III군(PLT-III)이라고 하였다.
감잎차 추출물의 HaCaT 세포에서의 MMP-9의 활성에 대한 효능을 관찰하고자 gelatin zymographic assay를 시행하였다. HaCaT cell은 다양한 농도의 감잎차 추출물(PLT-I, -II, -III)로 1시간 동안 선처리 하였다.
감잎차 추출물이 HaCaT 세포에서 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β mRNA 발현에 미치는 영향을 관찰하고자 HaCaT 세포에 다양한 농도의 감잎차 추출물(PLT-I, -II, -III)을 2시간 선 처리하고, UV로 자극을 한 후 24시간을 배양하였다.
그 후 다시 0.1 M PBS로 15분간 2회 수세하고 나서 30 mg의 3-3' diaminobenzidine를 150 ㎖의 0.1 M PBS에 녹인 용액에서 5분간 반응시킨 후 과산화수소를 0.005% 되게 첨가하여 갈색의 발색반응을 약 15분간 시행하였다.
5 ㎎/㎖)용액 50 ㎕/㎖를 각 well에 넣고 3시간 동안 배양하였다. 그 후 배양액을 버리고 0.01N HCl로 만든 10% SDS를 100 ㎕/well씩 넣어 MTT-formazan crystal을 용해한 후 microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하여 세포독성을 확인하였다. 살아있는 세포의 백분율은 미처리 세포를 기준으로 계산하였다.
3% H₂O₂를 넣은 용액에서 endogeneous peroxidase를 제거하였다. 그 후 비특이적인 면역반응을 제거하기 위하여 30분간 정상혈청(normal serum, 1:50)으로 처리한다. UVB조사 후 변화가 있을 것으로 예상되는 사이토카인 MMP(matrix metalloproteinase)-2(1:100, Santa Cruz, CA, USA), MMP-3(1:100, Santa Cruz, CA, USA), MMP-9(1:100, Santa Cruz, CA, USA)를 일차항체로 이용한다.
다양한 추출조건에서 추출한 감잎차 추출물(PLTs)이 UVB에 의하여 증가된 세포내 ROS에 미치는 영향을 관찰하고자 DCFH-DA assay를 시행하였다. HaCaT 세포에 60 mJ/cm2의 UVB로 자극하여 12시간을 방치한 후 감잎차 추출물을 농도별로 처리함과 아울러 DCFH-DA 시약을 처리하고, 5분 후 형광 흡광도를 측정하였다.
동물실험은 우석대학교 동물실험윤리위원회의 승인(WS2012-008)을 받아 실시하였다. 모든 실험군은 정상군, 대조군, 감잎차 추출물 투여군으로 나누었다. 정상군은 아무런 처치도 하지 않았으며, 대조군은 생리식염수 투여 후 무시료 도포액인 기본로션(vehicle)만을 도포한다.
배지를 62.5 mM Tris–HCl (pH 6.8), 10% glycerol, 2% SDS, and 0.00625% (w/v) bromophenol blue가 함유된 sample buffer에 섞고, 0.1% gelatin이 함유된 7.5% acrylamide/bisacrylamide (29.2:0.8) separating gel에 loading 한후 4℃, 100V에서 전기영동 하였다.
본 실험에서 감잎차 추출물이 HaCaT 세포에서 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β mRNA 발현에 미치는 영향을 관찰하고자 HaCaT 세포에 다양한 농도의 감잎차 추출물(PLT-I, -II, -III) 을 2시간 전처리하고, UV로 자극을 한 후 24시간을 배양한 후 TNF-α, IL-1β mRNA의 발현은 RT-PCR을 이용하여 분석하였다.
01N HCl로 만든 10% SDS를 100 ㎕/well씩 넣어 MTT-formazan crystal을 용해한 후 microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하여 세포독성을 확인하였다. 살아있는 세포의 백분율은 미처리 세포를 기준으로 계산하였다. 모든 실험은 3번 반복하였다.
세포배양 실험의 자외선 조사는 20W Ultraviolet B(UVB) lamp(Sankyo G20T10E, 20W, Japan)에서 조사한 광원을 UV Light meter(UV-340, UVA+UVB, Lutron, Taiwan)로 측정한 후 UVB 강도(intensity)가 0.3mW/cm²가 되는 높이에서 3x10⁵cells/㎖의 농도로 DMEM medium에 부유시켜 6 well plate에 분주한후 감잎차 추출물을 실험의 종류에 따라 농도별로 전처리(0.01, 0.1, 0.5, 1 ㎎/㎖)한 후 24시간 동안 배양한 후 60 mJ/㎠를 1회 조사하였다.
HaCaT 세포를 3×10⁵cell/ml의 농도로 분주하였다. 실험시작 전 무혈청배지로 교환한 후 감잎추출물을 농도별(50, 100, 200 ㎍/㎖)로 1시간 동안 처리하였다. 이 후 세포를 60 mJ/cm²세기의 UVB로 자극시키고 다시 24시간 배양하였다.
각 실험군의 감잎차 도포액은 에탄올, 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 증류수를 각각 30:20:50(v/v/v)의 비율로 잘 혼합한 기본로션에 감잎차 동결건조물을 2% 농도(1 g/50 ㎖)로 첨가하여 제조한 후 1일 1회 도포액 100 ㎕를 hairless 생쥐의 귀에서 등부위 전체에 도포한 후 잘 문질러준 후 1시간 후에 UVB를 등부분에 조사하였다. 실험이 종료된 후 실험동물을 마취한 후 혈액을 채취한 후 혈액학적 분석에 사용하였고, 등쪽 피부조직을 절취하여 일부는 냉동고에 보관한 후 분자생물학적 검사에 사용하였고, 일부는 Bouin solution 과 10% 중성 포르말린 용액에 고정하여 광학 및 면역조직화학적 염색에 사용하였다.
UVB조사 후 변화가 있을 것으로 예상되는 사이토카인 MMP(matrix metalloproteinase)-2(1:100, Santa Cruz, CA, USA), MMP-3(1:100, Santa Cruz, CA, USA), MMP-9(1:100, Santa Cruz, CA, USA)를 일차항체로 이용한다. 일차항체의 희석배율은 구입한 회사에 따라 차이가 있으므로 각각의 항체에 대한 positive control test를 실시하여 적정한 항체 희석 배율을 정한후 4℃의 moisture chamber에서 24시간 염색하였다. 2차항체는 1차항체 반응 후 5분간 3회 0.
자외선 조사장치는 실험실에서 자체 제작한 캐비넷 내에 20W Ultraviolet B(UVB) lamp(Sankyo G20T10E, 20W, Japan)를 부착한 후 조사한 광원을 UV Light meter(UV-340, UVA+UVB, Lutron, Taiwan)로 측정한 후 UVB 강도(intensity)가 0.3 mW/cm2가 되는 높이에서 조사하였다. 실험동물의 UVB 조사는 아크릴로 제작한 조사틀에 실험군 별로 각각의 생쥐를 가둔 후 생쥐의 등부위가 노출되도록 위쪽은 철망을 부착한다.
전체 RNA를 세포에서 추출하였고, TNF-α, IL-1β mRNA의 발현은 RT-PCR을 이용하여 분석하였다.
3 mW/cm²가 되도록 UV Light meter(UV-340, UVA+UVB, Lutron, Taiwan)로 측정하여 조사 높이를 정한 후 최소홍반량 (minimal erythema dose)을 결정하였다. 최소홍반량은 hairless 생쥐의 등에 1x1㎠의 넓이로 소구획을 나눈 후 UVB를 30 mJ/㎠에서 80 mJ/㎠까지의 조사량을 10 mJ/㎠ 간격으로 조사한다. UVB 조사 후 24시간이 경과한 후에 경계가 분명하고 네 모서리가 뚜렷한 홍반을 보이는 가장 낮은 광량인 60 mJ/㎠을 최소홍반량으로 정하였다.
감잎차 추출물은 건조한 감잎 500g을 70℃의 따뜻한 물 2 L에 20분간 담구어 우려낸 것을 감잎차 추출물 I군(persimmon leaf tea, PLT-I)이라하였고, 1차로 추출한 후 다시 70℃의 따뜻한물 2 L에 담구어 우려낸 것을 감잎차 추출물 II군(PLT-II)이라고 하였다. 최종적으로 2차 추출 후 다시 70℃의 따뜻한 물 2 L에 담구어 우려낸 것을 감잎차 추출물 III군(PLT-III)이라고 하였다. 각각의 회수한 감잎차 추출액은 여과하여 감압건조기에서 농축하고 동결건조하여 최종 수득물을 회수하였다.
피부 조직내 사이토카인, 효소 및 수용체에 대한 면역조직화학적 변화를 관찰하고자 피부조직을 절취한 후 Bouin solution에 24시간 고정한 후 일반적인 방법으로 파라핀 절편을 제작하였다. 파라핀 절편은 7 ㎛의 두께로 절단한 후 100% methanol에 0.
피부 최소홍반도를 측정하기 위하여 20W UVB lamp(Sankyo G20T10E, 20W, Japan)에서 조사한 자외선 강도가 0.3 mW/cm²가 되도록 UV Light meter(UV-340, UVA+UVB, Lutron, Taiwan)로 측정하여 조사 높이를 정한 후 최소홍반량 (minimal erythema dose)을 결정하였다. 최소홍반량은 hairless 생쥐의 등에 1x1㎠의 넓이로 소구획을 나눈 후 UVB를 30 mJ/㎠에서 80 mJ/㎠까지의 조사량을 10 mJ/㎠ 간격으로 조사한다.

대상 데이터

Human keratinocyte cell line인 HaCaT cell 내 ROS의 생성은 carboxy-H2DCFDA (5-(and-6)- carboxy - 2',7'- dichlorodihydrofluorescein diacetate (Molecular Probes, Eugene, OR, USA)를 사용하여 측정하였다.
Human keratinocyte cell line인 HaCaT cell은 CLS (Cell Lines Service)로부터 분양을 받아 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)(Hyclone; Logan, UT, USA)에 10% FBS, 100U/㎖ penicillin과 100㎍/㎖ streptomycin (Invitrogen; Carlsbad, CA, USA)를 첨가하여 배양하였다.
그 후 비특이적인 면역반응을 제거하기 위하여 30분간 정상혈청(normal serum, 1:50)으로 처리한다. UVB조사 후 변화가 있을 것으로 예상되는 사이토카인 MMP(matrix metalloproteinase)-2(1:100, Santa Cruz, CA, USA), MMP-3(1:100, Santa Cruz, CA, USA), MMP-9(1:100, Santa Cruz, CA, USA)를 일차항체로 이용한다. 일차항체의 희석배율은 구입한 회사에 따라 차이가 있으므로 각각의 항체에 대한 positive control test를 실시하여 적정한 항체 희석 배율을 정한후 4℃의 moisture chamber에서 24시간 염색하였다.
본 실험에 사용한 7주령, 숫컷, hairless 생쥐(SKH-1 hairless mice)는 오리엔트바이오에서 분양받아 1주일간 사육실에서 적응시킨 후 항온항습(22±2℃, 65±2% RH)하에서 사육하였고, 사료는 시판하는 고형사료를 공급하였다.
본 실험에 사용한 7주령, 숫컷, hairless 생쥐(SKH-1 hairless mice)는 오리엔트바이오에서 분양받아 1주일간 사육실에서 적응시킨 후 항온항습(22±2℃, 65±2% RH)하에서 사육하였고, 사료는 시판하는 고형사료를 공급하였다. 실험동물은 4개군으로 분류하여 군별로 5마리씩 배정하여 실험에 사용하였다. 동물실험은 우석대학교 동물실험윤리위원회의 승인(WS2012-008)을 받아 실시하였다.

데이터처리

각 군간 차이를 검증하기 위하여 t 검증(paired t-test)을 실시하고, 통계적 유의수준은 p<0.05로 실시하였다.
통계적 분석은 SPSS 12.0 for windows (SPSS Inc., USA)를 이용하여 평균과 표준편차를 산출하였으며, 일원배치 분산분석 (one-way ANOVA)을 적용하였다. 각 군간 차이를 검증하기 위하여 t 검증(paired t-test)을 실시하고, 통계적 유의수준은 p<0.

이론/모형

일차항체의 희석배율은 구입한 회사에 따라 차이가 있으므로 각각의 항체에 대한 positive control test를 실시하여 적정한 항체 희석 배율을 정한후 4℃의 moisture chamber에서 24시간 염색하였다. 2차항체는 1차항체 반응 후 5분간 3회 0.1 M PB로 수세과정을 거친 후에 Hsu 등²³⁾의 방법에 따라 biotinylated anti-IgG(Vector Laboratories, Inc., CA, USA)를 1:200으로 희석한 후 실온의 moisture chamber에서 30분 반응시켰다. 다시 5분간 3회 0.
Total RNA는 Trizol reagent(Invitrogen)를 이용하였으며 제조회사의 방법에 준하였다. Spectrophotometer를 이용하여 RNA의 농도를 측량한 후 M-MLV reverse transcriptase(Promega, Madison, WI, USA)에 의하여 cDNA를 합성하였고, specific primer 들을 이용한 PCR방법을 통하여 cDNA를 증폭하였다.

성능/효과

SKH-1 hairless mice의 피부조직의 세포외기질(extracellular matrix) 분해능의 지표를 관찰하기 위하여 MMP-2 항체를 이용하여 면역조직화학 염색을 시행하였다. MMP-2의 발현은 UVB를 조사하지 않은 정상군(N)(Fig. 7)의 표피의 상피세포층과 진피층에서는 미약하게 발현되었으나 UVB를 4주간 조사한 대조군 (C)(Fig. 7)의 표피 상피세포층과 진피층에서는 N군에 비해 비교적 강하게 발현되었다. UVB를 조사하면서 4주간 감잎차 추출물을 투여하고 도포한 PLT-I, -II, -III군의 표피 상피세포층에서는 C군에 비해 미약하게 발현되었다(Fig.
SKH-1 hairless mice의 피부조직의 세포외기질(extracellular matrix) 분해능의 지표를 관찰하기 위하여 MMP-3 항체를 이용하여 면역조직화학 염색을 시행하였다. MMP-3의 발현은 UVB를 조사하지 않은 정상군(N)(Fig. 8)의 표피의 상피세포층과 진피층에서는 미약하게 발현되었으나 UVB를 4주간 조사한 대조군 (C)(Fig. 8)의 표피 상피세포층과 진피층에서는 N군에 비해 비교적 강하게 발현되었다. UVB를 조사하면서 4주간 감잎차를 투여하고 도포한 PLT-I과 PLT-III군의 표피 상피세포층에서는 C군에 비해 미약하게 발현되었다(Fig.
SKH-1 hairless mice의 피부조직의 세포외기질(extracellular matrix) 분해능의 지표를 관찰하기 위하여 MMP-9 항체를 이용하여 면역조직화학 염색을 시행하였다. MMP-9의 발현은 UVB를 조사하지 않은 정상군(N)(Fig. 9)의 표피의 상피세포층과 진피층에서는 미약하게 발현되었으나 UVB를 4주간 조사한 대조군 (C)(Fig. 9)의 표피 상피세포층과 진피층에서는 N군에 비해 비교적 강하게 발현되었다. UVB를 조사하면서 4주간 감잎차를 투여하고 도포한 PLT-I과 PLT-II군의 표피 상피세포층에서는 C군에 비해 미약하게 발현되었다(Fig.
7)의 표피 상피세포층과 진피층에서는 N군에 비해 비교적 강하게 발현되었다. UVB를 조사하면서 4주간 감잎차 추출물을 투여하고 도포한 PLT-I, -II, -III군의 표피 상피세포층에서는 C군에 비해 미약하게 발현되었다(Fig. 7).
8)의 표피 상피세포층과 진피층에서는 N군에 비해 비교적 강하게 발현되었다. UVB를 조사하면서 4주간 감잎차를 투여하고 도포한 PLT-I과 PLT-III군의 표피 상피세포층에서는 C군에 비해 미약하게 발현되었다(Fig. 8)
9)의 표피 상피세포층과 진피층에서는 N군에 비해 비교적 강하게 발현되었다. UVB를 조사하면서 4주간 감잎차를 투여하고 도포한 PLT-I과 PLT-II군의 표피 상피세포층에서는 C군에 비해 미약하게 발현되었다(Fig. 9)
UVB를 조사한 HaCaT세포에서의 염증과 연관된 인자인 IL-1β와 TNF-α mRNA 발현에 미치는 영향은 PLT-I, PLT-II 및 PLT-III군은 IL-1β mRNA 발현을 농도의존적으로 감소시켰으며, TNF-α mRNA 발현은 PLT-I군과 PLT-II군에서만 농도의존적으로 감소시켰다.
감잎차 추출물의 세포내 활성산소종(ROS) 생성 억제 효과는 감잎차(PLT)-I과 감잎차(PLT)-II의 처리에 의하여 농도의존적으로 유의성있게 억제되었다.
감잎차 추출물이 HaCaT세포에 대한 세포독성을 MTT assay를 통하여 측정한 결과 감잎차(PLT)-I, 감잎차(PLT)-II 및 감잎차(PLT)-III은 1-200 ug/ml의 농도까지 세포독성이 나타나지 않았다.
001). 감잎추출물은 세포 내 ROS의 생성을 억제하는 기능을 수행하여 광노화 피부를 개선하는 효과가 있을 것으로 사료되었다.
본 실험에서 보는 바와 같이 UVB의 자극은 세포 내 ROS의 생성을 유의성있게 현저히 증가시켰으며(p<0.001), 이러한 ROS 의 생성은 감잎차 추출물(PLT)-I의 처리에 의하여 농도의존적으로 유의성있게 억제되었다(p<0.05, p<0.01, p<0.001).
본 실험의 동물실험에서 MMP-2의 발현은 4주간 감잎차 추출물을 투여하고 도포한 PLT-I, -II, -III군의 표피 상피세포층에서는 대조군에 비해 미약하게 발현되었고, MMP-3의 발현은 PLT-I 과 PLT-III군의 표피 상피세포층에서 대조군에 비해 미약하게 발현되었다. MMP-9의 발현은 PLT-I과 PLT-II군의 표피 상피세포 층에서 대조군에 비해 미약하게 발현되었다.
MMP-9의 발현은 PLT-I과 PLT-II군의 표피 상피세포 층에서 대조군에 비해 미약하게 발현되었다. 이상의 MMPs에 대한 실험결과는 감잎차 추출물 투여 및 도포군의 표피에서 대조 군에 비하여 미약한 면역반응을 나타낸 것은 감잎차 추출물 투여 및 도포에 의하여 표피에서의 MMPs의 발현이 억제된 것으로 보아 MMPs가 진피로 확산이 적게 됨으로써 콜라겐의 분해를 억제할 것으로 사료되었다. 또한 본 실험의 HaCaT 세포에서의 MMP-9의 활성에 대한 다양한 추출조건에서 추출한 감잎차 추
이상의 실험 결과로 감잎 추출물은 UVB에 의한 광노화 피부의 개선에 효과가 있을 것으로 사료되었고, 1차(PLT-I)와 2차 (PLT-II) 감잎 추출물이 더욱 효과적인 것으로 사료되었다.
이상의 실험결과로 대표적인 염증성 사이토카인인 TNF-α와 IL-1β에 있어서 UVB는 HaCaT 세포에서 이들 유전자의 발현을 증가시켰으며, 감잎차추출물 PLT-I과 PLT-II는 이들의 발현을 농도의존적으로 감소시켜 감잎 추출물은 자외선에 의한 염증 및 광노화 피부를 억제시킬 것으로 사료되었다.
출물의 효능을 관찰한 바 PLT-II와 PLT-III의 200 ug/ml의 농도에서 MMP-9의 활성을 감소시킴으로써 자외선에 대한 광노화 피부를 억제시킬 것으로 사료되었다.
피부조직의 세포외기질 분해능의 지표인 MMP-2, MMP-3및 MMP-9를 면역조직화학적 염색 반응은 UVB를 조사하면서 4주간 감잎차 추출물을 투여하고 도포한 PLT-I, -II, -III군의 표피 상피세포층의 MMP-2 발현은 대조군에 비해 미약하게 발현되었고, MMP-3과 MMP-9의 발현은 PLT-I과 PLT-III군의 표피 상피세포층에서는 대조군에 비해 미약하게 발현되었다.

후속연구

이상의 실험결과로 3종류의 감잎 추출물 중 PLT-Ⅰ군과 PLT-Ⅱ군이 UVB조사에 의한 광노화피부에 대한 동물실험과 HaCaT세포에서의 활성산소종 생성 억제, 주름관련 인자 (MMP-2, MMP-3 및 MMP-9) 및 염증과 연관된 인자(IL-1β와 TNF-α)의 개선효과가 우수한 것으로 입증되었으므로 향후 감잎의 생체 내 이용에 대한 다양한 연구가 추가적으로 이루어져야 할 것으로 사료되었다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	광노화는 어떤 임상적인 특징을 나타내는가?	광노화는 UVB에 의하여 피부주름이 조기에 형성되며, 피부가 건조해지며, 색소가 침착되고, 말초혈관이 확장되는 임상적인 특징을 나타낸다2,3). 또한 세포가 비전형적으로 발생하며, 표피진피 결합부위가 편평해지고, 아교질이 감소하고 탄력섬유가 소실되는 조직학적인 특징을 나타낸다4,5).
	피부 노화는 어떻게 구분되는가?	피부 노화는 나이가 증가하면서 개인의 유전적인 요인에 의하여 발생하는 내재적인 노화(intrinsic aging)와 자외선이나 외부 물질의 자극 등에 의한 산화적 스트레스에 의하여 발생하는 광노화(photoaging)로 나눌 수 있다1)
	광노화는 어떤 조직학적인 특징이 나타나는가?	광노화는 UVB에 의하여 피부주름이 조기에 형성되며, 피부가 건조해지며, 색소가 침착되고, 말초혈관이 확장되는 임상적인 특징을 나타낸다2,3). 또한 세포가 비전형적으로 발생하며, 표피진피 결합부위가 편평해지고, 아교질이 감소하고 탄력섬유가 소실되는 조직학적인 특징을 나타낸다4,5).

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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