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문제 정의
- 덜꿩나무는 우리나라 여러 지역에서 자생 및 재배하여 원료의 확보가 용이하지만 다른 인동과 식물에 비해 비교적 잘 알려지지 않아 성분과 활성에 대한 연구는 미비하다. 따라서 저자는 덜꿩나무 줄기로부터 이차대사산물을 분리 및 동정하고 활성을 검정하기 위하여 본 연구를 시작하였다. 본 논문에서는 덜꿩나무 줄기로부터 4종의 화합물을 분리, 정제하는 과정과, 스펙트럼 데이터를 해석하여 구조를 결정하는 과정을 기술하였다.
- 따라서 저자는 덜꿩나무 줄기로부터 이차대사산물을 분리 및 동정하고 활성을 검정하기 위하여 본 연구를 시작하였다. 본 논문에서는 덜꿩나무 줄기로부터 4종의 화합물을 분리, 정제하는 과정과, 스펙트럼 데이터를 해석하여 구조를 결정하는 과정을 기술하였다.
- 입체구조를 정확하게 결정하기 위하여를 측정하였다.
제안 방법
- (φ 12.5×15 cm, n-hexane-EtOAc =15:1→10:1→8:1→5:1→3:1→1:1→CHCl3-MeOH-H2O=33:3:1→30:3:1→27:3:1→24:3:1→16:3:1→12:3:1→10:3:1→7:3:1, 각 25 L) 를 실시하여 20개의 분획물(VEE-1−VEE-20)을 얻었다.
- Aldehyde proton signal δH 9.56 (H-28)과 δC 59.3 (C-17)사이에서 크로스 피크가 관측되었고, exo-methylene carbon signal δC 110.1 (C-30)과 δH 2.80 (H-19)의 크로스 피크가 확인되어 각각의 위치를 결정하였다.
- 2(C-27)이 관측되었다. Aldehyde기와 exo-methylene의 결합위치를 확인하기 위하여 gHMBC실험을 진행하였다. Aldehyde proton signal δH 9.
- O로 순차 분획하고 각 분획을 감압 농축하여 3개의 분획을 얻었다. EtOAc 및 n-BuOH 분획으로부터 SiO2, ODS 및 Sephadex LH-20 c.c.를 반복 실시하여, 4종의 화합물을 분리하였다.
- Nuclear magnetic resonance(NMR) spectrum은 Varian Inova AS 400(USA)으로 측정하였고, infrared (IR) spectrum은 Perkin model 599B(Waltham, USA)로 측정하였다. Fast atom bombardment mass spectrometry(FAB/MS)는 JEOL JMS-700(JEOL, Japan)을 사용하여 측정하였다. UV lamp는 Spectroline (Model ENF240 C/F, Spectronics Corporation, USA)을 사용하였고, 융점은 Fisher-Johns 융점 측정기(Fisher Scientific, USA)를 사용하여 측정하였고, 미보정하였다.
- Thin layer chromatography(TLC)는 Kieselgel 60 F254와 RP-18 F254S(Merck)를 사용하였고, 실험에 이용한 모든 시약은 특급시약을 사용하였다. Nuclear magnetic resonance(NMR) spectrum은 Varian Inova AS 400(USA)으로 측정하였고, infrared (IR) spectrum은 Perkin model 599B(Waltham, USA)로 측정하였다. Fast atom bombardment mass spectrometry(FAB/MS)는 JEOL JMS-700(JEOL, Japan)을 사용하여 측정하였다.
- Fast atom bombardment mass spectrometry(FAB/MS)는 JEOL JMS-700(JEOL, Japan)을 사용하여 측정하였다. UV lamp는 Spectroline (Model ENF240 C/F, Spectronics Corporation, USA)을 사용하였고, 융점은 Fisher-Johns 융점 측정기(Fisher Scientific, USA)를 사용하여 측정하였고, 미보정하였다.
- VEE-16 (5 g, Ve/Vt 0.658-0.767)에 대하여 SiO2 c.c. (φ 6×14 cm, CHCl3-MeOH-H2O=36:3:1, 19.5 L)를 실시하여 16개의 분획(VEE-16-1−VEE-16-16)으로 나누었고, 그 중 VEE16-13 (1.22 g, Ve/Vt 0.567-0.597)에 대하여 ODS c.c. (φ 4.5×7 cm, MeOH-H2O=1:3, 8,840 mL)를 실시하여 21개의 분획(VEE16-13-1−VEE-16-13-21)으로 나누었다.
- VEE-16-13-9 (80 mg, Ve/Vt 0.118-0.196) 에 대하여 ODS c.c. (φ 2×6 cm, MeOH-H2O=1:2, 184 mL)를 실시하여 8개의 분획(VEE-16-13-9-1−VEE-16-13-9-8)으로 나누 었고, 소분획 VEE-16-13-9-4 (23.1 mg, Ve/Vt 0.060-0.076)에 대하여 Sephadex LH-20 c.c. (φ 1×36 cm, 70% MeOH, 36 mL)를 실시하여 9개의 분획(VEE-16-13-9-4-1−VEE-16-13-9-4-9)으로 나누었으며, 화합물 3 (VEE-16-13-9-4-2, 8.5 mg, Ve/Vt 0.292-0.333, ODS TLC Rf 0.30, MeOH-H2O=1:1)을 분리하였다.
- 그 중에서 VEB-5 분획(705.4 mg, Ve/Vt 0.076-0.098)을 ODS c.c. (φ 4×6 cm, MeOH-H2O=1:3, 3.3 L)하여 14개의 분획(VEB-5-1−VEB5-14)으로 나누었고, 화합물 4 (VEB-5-11, 18.3 mg, Ve/Vt 0.534-0.687, ODS TLC Rf 0.40, MeOH-H2O=1:1)를 분리하였다.
- 그 중에서 VEE-11 분획[2.5 g, elution volume/total volume (Ve/Vt) 0.487-0.566]을 SiO2 c.c. (φ 4.5×15 cm, n-hexane-EtOAc =30:1→20:1→10:1→7:1→5:1→3:1→1:1, 각 3.3 L)하여 44개의 분획(VEE-11-1−VEE-11-44)으로 나누었고, 그 중 VEE-11-22 (147 mg, Ve/Vt 0.232-0.244)에 대하여 ODS c.c. (φ 3×5 cm, acetoneH2O=3:1, 730 mL)를 실시하여 9개의 분획(VEE-11-22-1−VEE11-22-9)으로 나누었고, 화합물 1 (VEE-11-22-4, 6.7 mg, Ve/Vt 0.221-0.278, ODS TLC Rf 0.50, acetone-H2O=15:1)을 분리하였다.
- 7(C-6)과 크로스 피크를 확인하여 각 methyl 기의 결합위치가 확인되었다. 그리고 입체구조를 확인하기 위하여 문헌을 조사하였다. 입체구조가 6R, 9R인 경우 C-9는 δC 77.
- 4개의 methyl기와 1개의 hydroxyl기, 2쌍의 이중결합과 1개의 ketone으로부터 norsesquiterpene임을 알 수 있었다. 당과 각 key group의 결합위치를 확인하기 위하여 gHMBC 실험을 진행하였다. 당의 anomer proton signal δH 4.
- 6 Hz)으로부터 당이 β-결합하고 있는 것으로 확인되었다. 당의 결합위치를 결정하기 위하여 gHMBC 실험을 실시하였다. 당의 anomer proton signal δH 4.
- 덜꿩나무 줄기를 80% MeOH로 추출하여 얻어진 추출물에 대하여 용매의 극성에 따라 EtOAc, n-BuOH 및 H2O로 순차 분획하고 각 분획을 감압 농축하여 3개의 분획을 얻었다. EtOAc 및 n-BuOH 분획으로부터 SiO2, ODS 및 Sephadex LH-20 c.
- 당과 각 methyl기의 결합위치를 확인하기 위하여 gHMBC 실험을 진행하였으며 화합물 3과 동일한 양상의 크로스 피크가 확인되어 당이 C-9에 결합됨을, 그리고 methyl기는 C-10이 C-9에, C-11과 C-12가 C-1에, 그리고 C-13이 C-5에 결합됨을 확인하였다. 또한 입체구조를 결정하기 위하여 NMR에서의 화학적 이동 값을 문헌과 비교하였다. 입체구조가 6R, 9R인 경우 C-9는 δC 75.
- 분리한 화합물의 구조는 NMR, IR, 및 MS data를 해석하여, betulinic aldehyde (1), koaburside (2), (6R,7E,9R)-9-hydroxymegastigma4,7-dien-3-one-9-O-β-D-glucopyranoside (3), 그리고 byzantionoside B (4)로 구조를 결정하였다.
- 소분획 VEE-16-13-4 (28.4 mg, Ve/Vt 0.016-0.023)에 대하여 ODS c.c. (φ 1.5×7 cm, MeOH-H2O=1:3, 126 mL)를 실시하여 5개의 분획(VEE-16-13-4-1−VEE-16-13-4-5)으로 나누었으며, 화합물 2 (VEE-16-13-4-2, 11.7 mg, Ve/Vt 0.096-0.126, ODS TLC Rf 0.30, MeOH-H2O =3:2)를 분리하였다.
- 얻어진 MeOH 추출물은 H2O (3 L)과 ethyl acetate (EtOAc,3 L×6)로 분배 추출하였고, 다시 H2O 층을 n-butyl alcohol (n-BuOH, 2.7 L×5)로 분배 추출하였다.
- 이 중 EtOAc및 n-BuOH 분획에 대하여 SiO2, ODS 및 Sephadex LH-20 column chromatography 를 반복 수행하여 4종의 화합물을 분리, 정제하였다.
- 이 추출물을 EtOAC, n-BuOH, 및 H2O 분획으로 나누었다.
대상 데이터
- 68(3H, s, 4-OCH3)이 관측되었고, 적분값 으로부터 3개의 -OCH3가 존재함을 알 수 있었다. 13C-NMR(100 MHz, CD3OD) 스펙트럼에서 당과 methoxy signal을 포함하여 15개의 탄소 signal이 관측되었다. 4개의 oxygenated olefin quaternary carbon signal δC 156.
- 0 Hz)으로부터 당이 β-결합하고 있는 것을 확인하였다. 13C-NMR(100 MHz, CD3OD) 스펙트럼에서 당을 포함하여 19개의 탄소 signal이 관측되었다. 1개의 공역 ketone carbon signal δC 202.
- 73(3H, s, H-24)이 관측되어 triterpenoid 화합물인 것으로 확인되었다. 13C-NMR 및 DEPT(100 MHz, CDCl3) 스펙트럼에서는 총 30개의 carbon signal과 각 탄소 signal의 다중도를 확인하였다. 탄소 30개의 signal로부터 triterpenoid 화합물임을 확인하였다.
- Column chromatography용 silica gel은 Kiesel gel 60(Merck, Germany)을, octadecyl silicagel(ODS)은 LiChroprep RP-18(Merck)을, 그리고 Sephadex LH-20(Amersham Biosciences, Sweden)를 사용하였다. Thin layer chromatography(TLC)는 Kieselgel 60 F254와 RP-18 F254S(Merck)를 사용하였고, 실험에 이용한 모든 시약은 특급시약을 사용하였다.
- Column chromatography용 silica gel은 Kiesel gel 60(Merck, Germany)을, octadecyl silicagel(ODS)은 LiChroprep RP-18(Merck)을, 그리고 Sephadex LH-20(Amersham Biosciences, Sweden)를 사용하였다. Thin layer chromatography(TLC)는 Kieselgel 60 F254와 RP-18 F254S(Merck)를 사용하였고, 실험에 이용한 모든 시약은 특급시약을 사용하였다. Nuclear magnetic resonance(NMR) spectrum은 Varian Inova AS 400(USA)으로 측정하였고, infrared (IR) spectrum은 Perkin model 599B(Waltham, USA)로 측정하였다.
- 본 실험에 사용한 덜꿩나무(V. erosum) 줄기는 2012년 경기도 과천시 대림원예 종묘에서 구입하여 사용하였으며, 우석대학교 김대근교수가 동정하였다. 표본시료(NPCL-20120402)는 경희대학교 천연물화학실에 보관되어 있다.
성능/효과
- 1H-NMR (400 MHz, CD3OD) 스펙트럼에서 3개의 olefin methine proton signal δH 5.86 (1H, d, J =1.2 Hz, H-4), 5.74 (1H, dd, J =15.6, 6.8 Hz, H-8), 5.60 (1H, ddd, J =15.6, 9.2, 0.8 Hz, H-7)이 관측되었고, coupling constant 값 (J =15.6 Hz)으로부터 trans 이중결합이 한 개 존재함을 확인하였다.
- 4(C-24)로 관측되어 수산기가 β-결합하고 있는 것으로 결정하였다. 1H-NMR 및 13C-NMR을 종합하여 분석한 결과, aldehyde기와 isopropenyl group에서 오는 exo-methylene과 고자장에서 singlet으로 관측되는 methyl proton 6개가 관측됨에 따라 lupane 골격의 triterpenoid 화합물임을 확인하였다. 화합물 1은 betulinic aldehyde로 구조 동정하였으며, 문헌과 비교한 결과 산딸나무 열매와 코르크 참나무에서 분리 보고된 바 있다(Monaco와 Previtera, 1984; Lee 등, 2009).
- 4개의 methyl proton signal δH 1.92 (3H, d, J =1.6 Hz, H-13), 1.27 (3H, d, J = 6.0 Hz, H-10), 1.02 (3H, s, H-12), 0.99 (3H, s, H-11)이 확인되었으며, H-13은 allyl 위치에 있어 저자장으로 이동되어 관측됨이 확인되었다.
- 9 (C-6')의 화학적 이동 값을 통하여 당이 β-glucopyranose임을 확인하였다. 4개의 methyl기와 1개의 hydroxyl기, 1쌍의 이중결합과 1개의 ketone으로부터 norsesquiterpene임을 알 수 있었다. 당과 각 methyl기의 결합위치를 확인하기 위하여 gHMBC 실험을 진행하였으며 화합물 3과 동일한 양상의 크로스 피크가 확인되어 당이 C-9에 결합됨을, 그리고 methyl기는 C-10이 C-9에, C-11과 C-12가 C-1에, 그리고 C-13이 C-5에 결합됨을 확인하였다.
- 6(C-6')의 화학적 이동 값을 통하여 당이 β-glucopyranose임을 확인하였다. 4개의 methyl기와 1개의 hydroxyl기, 2쌍의 이중결합과 1개의 ketone으로부터 norsesquiterpene임을 알 수 있었다. 당과 각 key group의 결합위치를 확인하기 위하여 gHMBC 실험을 진행하였다.
- 4개의 oxygenated olefin quaternary carbon signal δC 156.0 (C-1), 154.7 (C-3, 5), 134.3 (C-4), 2개의 olefin methine carbon signal δC 96.0 (C-2,4)로부터 벤젠고리가 1개 존재하는 것을 알 수 있 었다.
- IR 스펙트럼으로부터 수산기(3,300 cm−1 )와 이중결합(1,600 cm−1)의 작용기를 갖는 것으로 확인되었다.
- IR 스펙트럼으로부터 수산기(3390 cm−1)와 공역 ketone기(1661 cm−1)의 작용기를 갖는 것으로 확인되었다.
- IR 스펙트럼으로부터 수산기(3399 cm−1)와 공역 ketone기(1645 cm−1)의 작용기를 갖는 것으로 확인되었다.
- Methoxy proton signal δH 3.80 (6H, s, 3-OCH3, 5-OCH3), 3.68 (3H, s, 4-OCH3)이 관측되었고, 적분값 으로부터 3개의 -OCH3가 존재함을 알 수 있었다.
- Methyl proton signal δH 1.27 (H-10)은 δC 138.2 (C-8), 76.9 (C-9)과 크로스 피크를 보이고, δH 1.02 (H-12)와 δH 0.99 (H-11)은 δC 37.1 (C-1), 56.7 (C-6), 48.2 (C-2)과 크로스 피크를 보이며, 또한 δH 1.92 (H-13)은 δC 165.9 (C-5), 126.1 (C-4), 56.7 (C-6)과 크로스 피크를 확인하여 각 methyl 기의 결합위치가 확인되었다.
- 4개의 methyl기와 1개의 hydroxyl기, 1쌍의 이중결합과 1개의 ketone으로부터 norsesquiterpene임을 알 수 있었다. 당과 각 methyl기의 결합위치를 확인하기 위하여 gHMBC 실험을 진행하였으며 화합물 3과 동일한 양상의 크로스 피크가 확인되어 당이 C-9에 결합됨을, 그리고 methyl기는 C-10이 C-9에, C-11과 C-12가 C-1에, 그리고 C-13이 C-5에 결합됨을 확인하였다. 또한 입체구조를 결정하기 위하여 NMR에서의 화학적 이동 값을 문헌과 비교하였다.
- 당으로부터 유래하는 carbon signal δC 103.1 (C-1'), 78.4 (C-5'), 78.0 (C-3'), 74.9 (C-2'), 71.6 (C-4'), 62.7 (C-6')의 화학적 이동 값을 통하여 당이 β-glucopyranose임을 알 수 있었으며, δH 4.79에서 나타나는 anomer proton signal의 coupling constant 값(J =7.6 Hz)으로부터 당이 β-결합하고 있는 것으로 확인되었다.
- 당의 anomer proton signal δH 4.33과 δC 76.9 (C9)의 크로스 피크가 확인되어, 당이 9번에 결합하는 것으로 확인되었다.
- 당의 anomer proton signal δH 4.79 (H-1')과 δC 156.0 (C-1)의 크로스 피크를 확인하여 당이 1번 위치에 결합하고 있음을 확인하였다.
- 0(C-1)의 크로스 피크를 확인하여 당이 1번 위치에 결합하고 있음을 확인하였다. 이를 종합하여 본 결과 1,2,3,5-4치환 벤젠고리에 glucose 한 분자와 methoxyl기 3개가 결합된 화합물임을 알 수 있었다. 이를 토대로 문헌과 비교한 결과, 화합물 2를 koaburside로 동정하였다(Kosuge 등, 1994; Shin 등, 2011).
후속연구
- 덜꿩나무 줄기로부터 분리된 이차대사산물에 대한 활성을 조사해 본 결과 betulinic aldehyde(1)은 human ACAT inhibitory activity를 가지고 있는 것으로 보고 되었고(Lee 등, 2009), koaburside(2), (6R,7E,9R)-9-hydroxymegastigma-4,7-dien-3-one9-O-β-D-glucopyranoside(3), 그리고 byzantionoside B(4)에 대한 활성은 보고된바 없다. 앞으로 이들 화합물들에 대한 다양한 활성을 검토하고 추가적인 물질 분리와 활성의 검정을 통하여 덜꿩나무에 대한 기능성 식품, 화장품 또는 의약품으로의 활용에 대한 연구를 추진하고자 한다.
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