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문제 정의
- 최근 알로에 베라 섭취에 의한 독성 간염이 보고되고 있으나, 아직까지 알로에 베라의 간에 대한 염증 효과가 명확히 밝혀지지 않았다. 본 연구는 알로에 베라 에탄올 추출물이 간세포의 염증 발현에 미치는 영향과 그 기전을 밝히기 위해 수행되었다. 0.
- 본 연구는 알로에 베라 추출물이 간세포의 염증성 사이토카인의 분비에 미치는 영향을 측정함으로써 알로에 베라에 의한 간의 염증 유발 기전을 밝히고, 알로에 베라의 안전성을 재평가하기 위한 기초 자료를 마련하고자 하였다.
- 염증성 사이토카인 M-CSF의 분비에 대한 알로에 베라 추출물의 영향을 확인하기 위해 실험을 수행하였다. IL-8 분비 측정 실험과 동일하게 추출물을 세포에 처리한 후 상층액을 100 μL 취하고, Quantikine Human M-CSF ELISA kit(R&D systems, Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 실험한 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
제안 방법
- HepG2 세포에 대한 알로에 베라 추출물의 세포 독성 여부를 알아보기 위해 MTT assay를 시행하였다. 항온수조에서 55℃의 열로 30분간 불활성화시킨 FBS를 10% 함유한 DMEM을 이용하여 HepG2 세포를 96 well plate에 분주(1×104 cells/well)하고 24시간 동안 배양시켰다.
- HepG2 세포에 열로 불활성화시킨 FBS를 5% 함유한 DMEM을 이용해 알로에 베라 추출물을 희석하여 농도별로 세포에 처리(100 μL/well)하고, 37℃ 배양기에서 반응시켰다.
- IL-8 분비 측정 실험과 동일하게 추출물을 세포에 처리한 후 상층액을 100 μL 취하고, Quantikine Human M-CSF ELISA kit(R&D systems, Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 실험한 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 또한 HepG2를 이용한 in vitro 실험에서도 IL-8은 간염증 유발 물질인 아세트알데히드 및 LPS에 의해 분비가 촉진되었고(Gutierrez-Ruiz 등 2001), HepG2 세포가 M-CSF mRNA를 발현시키는 것으로 나타났다. 따라서 인체를 대상으로 한 연구에서 간염 환자들에게서 유의적으로 증가되었다고 보고된 사이토카인인 IL-8과 M-CSF가 HepG2 세포에서도 분비되거나 유전자가 발현되므로, in vivo에서의 염증을 예측하기에 적절한 in vitro 지표로 사료되어 본 실험의 염증반응 지표로 선정하였다.
- 알로에 베라 추출물에 의한 HepG2 세포의 IL-8의 분비량을 측정하고, 이를 대조군에 대한 %비율로 나타내었다(Fig. 2). 그 결과, 알로에 베라 추출물은 0.
- 알로에 베라 추출물이 HepG2 세포에 염증을 유도하는지 알아보기 위해 염증성 사이토카인의 분비 정도를 측정하였다. 인체를 대상으로 한 Huang 등(1999)의 연구에 의하면 혈청 IL-1β, IL-2r, IL-6, TNF-α가 급성 C형 간염이나 만성 C간염 환자보다 간경화 및 간암 환자에서 더 높은 수준으로 유의적 증가를 보여 이들 지표가 간의 염증보다는 간경화 및 간암 등과 같은 간기능 손상과 더 밀접한 관련이 있는 것으로 나타났다.
- 알로에 베라 추출물이 HepG2 세포의 사멸에 영향을 미치는지를 알아보기 위해 0.001~100 μg/mL 농도의 알로에 베라 추출물을 처리하여 세포 생존율을 측정하였으며, 그 결과를 대조군에 대한 %비율로 표시하였다(Fig. 1).
- 알로에 베라 추출물이 간에 염증을 유발하는 기전을 알아보기 위해 알로에 베라 추출물이 염증성 사이토카인인 IL-8의 분비에 영향을 주는지를 측정하였다. 열로 불활성화시킨 FBS를 10% 함유한 DMEM을 이용하여 HepG2 세포를 48 well plate에 분주(1×105 cells/well)하고 24시간 동안 배양시켰다.
- O’Brien 등(2006)은 243종의 물질을 대상으로 간독성을 평가한 결과, HepG2 세포 시스템이 80%의 sensitivity와 90%의 specificity를 나타내어 인체의 간독성과 HepG2 세포를 이용한 연구 결과 간에 상관관계가 높다고 보고하였다. 이에 본 연구에서는 HepG2 세포를 이용한 in vitro 시스템을 알로에 베라에 의한 간세포 염증 실험에 사용하였다.
- 추출물은 열로 불활성화시킨 FBS를 5% 함유한 DMEM을 이용해서 농도별로 희석하여 세포에 처리(400 μL/well)하고 배양기에서 반응시켰다.
- 24시간 후 plate를 원심분리(500×g, 15분)하여 상층액을 50 μL 취하고, Quantikine Human CXCL8/IL-8 ELISA kit(R&D systems, Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 반응시킨 후 microplate reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정 후 각 well의 단백질을 정량하여 IL-8의 양을 단백질 양으로 나누어 보정하였다.
- IL-8 분비 측정 실험과 동일하게 추출물을 세포에 처리한 후 상층액을 100 μL 취하고, Quantikine Human M-CSF ELISA kit(R&D systems, Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 실험한 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정값을 단백질 양으로 나누어 보정하였다.
대상 데이터
- HepG2 세포는 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)에서 분양 받았으며, 10% FBS(Gibco, Grand Island, NY, USA)를 첨가한 DMEM(Gibco, Grand Island, NY, USA) 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다.
- 본 실험에 사용된 알로에 베라는 경상남도 거제의 것을 구입하여 동결견조한 후 분쇄하여 분말 상태로 만들어 실험에 사용하였다.
- 42 여과지(Whatman, Maidstone, UK)로 여과하여 불용성 잔여물을 제거하였다. 여과시킨 추출물을 감압농축기를 이용하여 에탄올을 모두 제거한 후 동결건조시켜 얻은 건조 추출물을 dimethyl-sulfoxide(DMSO)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 재용해하고 단계적으로 희석하여 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 각 실험군별 유의차는 Student’s t-test를 시행하여 95% 수준에서 유의성을 검정하였다.
- 모든 실험은 3회 실시하였으며, 실험결과는 평균±오차로 표시하였다.
성능/효과
- 0.001~100 μg/mL의 모든 농도에서 알로에 베라 추출물은 세포사멸을 유도하지 않아 세포 생존율에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(p<0.05).
- 0.001~100 μg/mL의 알로에 베라 추출물을 HepG2 세포에 처리하여 MTT assay를 시행한 결과, 모든 농도에서 세포사멸이 유도되지 않았다.
- 간세포에 대한 알로에 베라 추출물의 염증 유발 여부를 알아보기 위해 또 다른 염증성 사이토카인인 M-CSF의 분비를 측정한 결과(Fig. 3), 0.001~100 μg/mL의 알로에 베라 추출물은 36.3~61.5%까지 M-CSF의 분비를 유의적으로 증가시켰다 (p<0.05).
- 그 결과, 알로에 베라 추출물은 0.001~100 μg/mL의 농도에서 15.7~25.8%까지 IL-8의 분비를 유의적으로 증가시켰다(p<0.05).
- Gutierrez-Ruiz 등(2001)은 에탄올, lipopolysaccharide(LPS), 아세트알데히드 처리에 의해 HepG2 세포의 IL-8 분비가 각각 39, 51, 58% 증가하였다고 보고하였다. 그러나 이들 물질은 식품이 아닌 간염을 유발하는 대표적인 물질들인 반면, 본 실험에서의 알로에 베라는 건강기능식품이며, 세포사멸을 유도하지 않는 농도에서도 최대 25.8%의 IL-8 분비를 증가시킨 것은 알로에 베라가 간의 염증반응과 분명한 관련이 있음을 시사한다. IL-8은 염증 시 다양한 세포에서 분비가 증가되는 사이토카인이다.
- 건강기능식품은 약과는 달리 낮은 농도로 오랫동안 섭취 하는 경우가 많기 때문에, 세포괴사 등 심각한 독성을 나타내는 고농도보다는 약한 독성을 나타내는 저농도에서의 안전성을 평가하는 것이 바람직하다. 따라서 세포생존율에 영향을 미치지 않는 저농도에서 알로에 베라 추출물에 의해 IL-8과 M-CSF의 분비가 관찰된 것은 알로에 베라 추출물이 세포사멸이라는 심각한 독성을 유발하지 않더라도 염증성 사이토카인에 의해 매개되는 약한 염증반응과 관련한 독성을 나타낼 수 있음을 시사한다.
- 05). 본 연구 결과는 알로에 베라 추출물이 IL-8과 M-CSF와 같은 염증성 사이토카인 분비기전에 의해 간에 염증을 유발할 수 있음을 보여준다. 또한 알로에 추출물에 의해 유발될 수 있는 간염기전을 제시함으로써, 향후 수행될 추가 실험을 위한 기초 자료로 그 가치가 높을 것으로 사료된다.
후속연구
- 본 연구 결과는 알로에 베라 추출물이 IL-8과 M-CSF와 같은 염증성 사이토카인 분비기전에 의해 간에 염증을 유발할 수 있음을 보여준다. 또한 알로에 추출물에 의해 유발될 수 있는 간염기전을 제시함으로써, 향후 수행될 추가 실험을 위한 기초 자료로 그 가치가 높을 것으로 사료된다.
- 따라서 알로에 베라 추출물에 의한 간염은 간세포로부터 IL-8과 M-CSF와 같은 염증성 사이토카인의 분비에 의해 중개될 수 있음을 의미한다. 또한 이러한 결과는 HepG2 세포를 이용한 IL-8과 M-CSF의 분비 측정이 건강기능식품에 의한 독성 간염을 예측할 수 있는 유용한 in vitro 지표로 사용될 수 있음을 시사한다.
- 본 연구에서 간염은 알로에 베라 추출물에 의해 유발될 수 있는 간독성의 한 형태로 나타나, 알로에 베라 추출물을 건강기능식품으로서 안전하게 판매하고 섭취하기 위해 추가적인 기전 연구 및 안전성 실험이 선행되어야 할 것으로 보인다.
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