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문제 정의
- 본 연구에서는 표고 액체종균을 대량(140 L) 배양할 때에, 접종원을 고속균질기로 균질화하여 투입하고 산소를 폭기방법으로 공급하고, 균체가 다량으로 형성되는 대수기 및 대수기 이후에 균체가 이용할 수 있도록 질소양분을 대두박으로 충분히 공급하였다. 그 결과 배양액과 균사체가 분리되지 않는 고밀도 액체종균을 만들 수 있었으므로, 이러한 배양과정에서 액체종균의 품질을 균사체 내 밀도와 양분 함량으로써 알고자 하였다.
- 본 연구에서는 효율적으로 표고 액체종균을 생산하기 위하여, 액체배지에 폭기방법으로 산소를 공급하고, 대두박을 첨가하여 표고균사체 생장량과 잔존 배양액의 유리당 함량을 조사하였다. 그 결과 폭기방법은 균질화된 표고균사가 생장하면서 서로 뭉치지 않고 균질하게 증식하고, 대두박 첨가는 대수기 이후에도 지효성 질소영양원이 공급되도록 하는 효과가 있었다.
제안 방법
- 67 mL, 안티폼 204 (Sigma, A-6426) 2~3방울을 첨가하고, 1 L 삼각프라스크 내에 500 mL씩 넣고, 면전하여 121oC에서 60분간 고압살균되었다. 그리고 PDA에서 배양된 산조701호 배양체(1 cm 직경) 8~9개 조각을 1 L 삼각프라스크 내 500 mL 액체배지에 접종하여 배양초기에는 정치하고 배양후기에는 진탕(90 rpm)하면서 15~20일간 배양하였다.
- 이렇게 표고균사가 충분히 자라서 액체배지 내에 대두박이 거의 분해되는 시점에서 액체종균을 톱밥배지에 접종할 경우에는, 오염이 되지 않으면서 활착이 잘 진행되었다[5]. 그리고 대두박은 폭기 배양 중에 균사가 서로 뭉치지 않고 독립 입자로 자라도록 지지체 역할도 하였다. 이처럼 균사 지지체 역할을 하는 것으로는 수용액에 완전히 용해되지 않는 보리나 밀 등 부유성 당화 배지도 효과가 있다[14].
- 본 연구에서는 같은 기간 동안에 140 L 배양액에서 액체층과 균사 층이 분리되지 않는 고밀도로 부유된 표고 액체 균사체 약 55 g/L를 얻을 수 있었다. 그리고 이를 톱밥배지에 2 kg.f/ cm2의 압력으로 스파이럴형 노즐로 균사체를 분산시키면서 접종하였을 때, 24시간 후에는 배지에서 하얀 표고균사가 활착되는 것(Fig. 6)을 확인하였다.
- 액체종균은 수분과 양분이 풍부하고 폭기로 배양되므로 오염되면 급격히 증식되고 배양액 내 빠르게 분산된다. 따라서 폭기 배양 4일째부터 매일 배양균사체를 채집하여 슬라이드 글라스에 올리고 진한 Giemsa Staining Solution [關東化學(株), Cica-Reagent 100 mL Cat No. 17596-23]을 떨어뜨려 균사체와 세균류를 40~60초 동안 염색시킨 후 슬라이드 뒷면으로부터 증류수로 씻어낸 후 건조시켜 현미경에서 100~1000배율로 오염여부를 조사[5]하고 오염된 배양액통은 제거하였다.
- 폭기는 내경 지름 13~15 mm관에 연결된 내경 1 mm의 가느다란 10개 분지관을 통하여 압력 공기를 주입하는 것으로, 이를 통하여 배양액에 산소를 공급하면서 배양액도 순환시켰다. 배양실 온도는 20~22oC로 조절하였고, 폭기 진행 중인 배양기내부의 이산화탄소 농도는 배출구에서 IAQ (Indoor Air Quality)-CALC7545 (TSI Co.) 측정기로 측정하였다.
- 본 연구에서는 표고 액체종균을 대량(140 L) 배양할 때에, 접종원을 고속균질기로 균질화하여 투입하고 산소를 폭기방법으로 공급하고, 균체가 다량으로 형성되는 대수기 및 대수기 이후에 균체가 이용할 수 있도록 질소양분을 대두박으로 충분히 공급하였다. 그 결과 배양액과 균사체가 분리되지 않는 고밀도 액체종균을 만들 수 있었으므로, 이러한 배양과정에서 액체종균의 품질을 균사체 내 밀도와 양분 함량으로써 알고자 하였다.
- 배양된 표고 균사체의 생중량을 측정하기 위해서 폭기 배양 중인 140 L 중에서 매일 1L씩 분획하여 분석시료로 사용하였다. 분획시료에서 부유 균사를 1시간 동안 침전시켜서 배양된 균사체 부피(mL/L)를 측정하고, 원심분리하여 생중량(g/L)을 측정한 후, -10oC에 냉동보관하면서 화학적 특성 분석에 이용하였으며, 실험에서 각각의 결과는 매일 분취한 1 L 용량에 대하여 서술하였다.
- 유리당은 Im 등[11]과 Jung[12]의 시험방법을 준용하여, 표고 균사체 시료 20 g을 80% 에탄올 100 mL에 넣은 후 85oC 온탕에서 30분 간 초음파로 추출한 후 80% 에탄올 100 mL을 가하여 0.45 µm 멤버레인 필터로 여과한 후 프락토스, 글루코스, 말토스, 수크로스, 락토스를 HPLC로 분석 하였다.
- 액체배양에서는 배양 대수기에 많은 에너지와 양분이 지속적으로 필요하기 때문에 지효성 질소원(N)인 대두박(soybean meal)을 증량하였다. 즉 대두박을 배양액 140 L에, 대조구에서는 0.35 kg, 증량 처리구에서는 0.98 kg를 넣어서, 액체종균의 C/N율을 13.1[4]과 4.3으로 하여 배양시킨 균사량을 비교하였다 (Table 1).
- 배양균사체 내 총질소(T-N) 함량 분석은 경기도 농업기술원에 의뢰하였다. 표고 균사체 0.1 g에 진한 H2SO4 25 mL와 황산염 촉매제를 넣고 350oC에서 30분간 분해한 시료를 냉각시킨 후, 45% NaOH 60 mL, 진한 H2SO4 2~3방울을 가하여 나온 증류용액을 0.5 N-H2SO4로 적정하여 질소 함량을 계산하였다.
- 5 mL 첨가하여 20분간 가열, 냉각 후 C액(증류수 450 mL 내에 (NH4)6 Mo7O24·4H2O 25 g, 진한 황산 21 mL, 증류수 25 mL 내에 Na2HSO4·7H2O 3 g)을 1 mL 첨가하고 실온에서 반응시킨 후, 증류수 5 mL를 혼합하여 520oC에서 흡광도를 측정하였다. 환원당 함량은 글루코오스로 검량선을 작성하여 시료의 환원당 함량을 산출하였다.
대상 데이터
- 배양된 표고 균사체의 생중량을 측정하기 위해서 폭기 배양 중인 140 L 중에서 매일 1L씩 분획하여 분석시료로 사용하였다. 분획시료에서 부유 균사를 1시간 동안 침전시켜서 배양된 균사체 부피(mL/L)를 측정하고, 원심분리하여 생중량(g/L)을 측정한 후, -10oC에 냉동보관하면서 화학적 특성 분석에 이용하였으며, 실험에서 각각의 결과는 매일 분취한 1 L 용량에 대하여 서술하였다.
- 본 시험에는 표고 품종 산조701호를 사용하였다. 원균은 PDA (potato dextrose agar) 사면배지에서 24oC에서 13일 동안 배양되었다.
- 액체배양에서는 배양 대수기에 많은 에너지와 양분이 지속적으로 필요하기 때문에 지효성 질소원(N)인 대두박(soybean meal)을 증량하였다. 즉 대두박을 배양액 140 L에, 대조구에서는 0.
이론/모형
- 키틴 분석은 Hyun[8]의 시험방법을 준용하였다. 동결된 시료 0.
- 환원당은 Luchsinger와 Cornesky[6] 그리고 Nelson[7]의 방법을 준용하여 정량하였다. 표고 액체종균을 원심분리 (3,000 rpm, 10 min)하여 상층액 10g에 증류수 40 mL를 가하여 50 mL로 정용하였다.
성능/효과
- 본 연구에서는 효율적으로 표고 액체종균을 생산하기 위하여, 액체배지에 폭기방법으로 산소를 공급하고, 대두박을 첨가하여 표고균사체 생장량과 잔존 배양액의 유리당 함량을 조사하였다. 그 결과 폭기방법은 균질화된 표고균사가 생장하면서 서로 뭉치지 않고 균질하게 증식하고, 대두박 첨가는 대수기 이후에도 지효성 질소영양원이 공급되도록 하는 효과가 있었다. 배양 중 침전 균사체의 중량은 13일째에 가장 많았으며, 배양용기의 배출구에서 이산화탄소 농도는 13일째에 가장 높았다.
- 상층 수용액에서 환원당은 폭기 12일째에 거의 소비되었다. 그리고 배양균사체에서 총질소(T-N)량은 폭기 배양 13일째에 최고 수준이며, 키틴함량과 5종의 유리당 중에서 수크로즈함량은 폭기 배양 18일째에 가장 높았으나, 에르고스테롤 함량은 폭기 배양 22일째에 가장 높았다. 이와 같은 결과를 종합적으로 판단할 경우 표고액체 종균으로서 사용 적기는 균사활력이 가장 왕성하고 균체량이 많은 배양 18일째로 판단되었다.
- 따라서 액체배양체 내 균사활력, 배양균사량, 키틴함량, 에르고스테롤함량, 액체 배지 내 유리당 함량과 균사활력등으로 판단하여 볼 때, 가장 적합한 액체종균은 폭기 배양 18일 전후였다. 하지만 액체종균의 제조방법에 따라서는 폭기 배양일 수를 단축할 수도 있을 것으로 판단되었다.
- 2, 3). 따라서 액체종균 배양기에서 균체량과 배출되는 이산화탄소 농도는, 배양 초기부터 13일째까지는 함께 증가하였다. 이 결과는 균체량이 점점 증가하는 동안 균사활성은 왕성하였으나, 초기 투입된 질소영양원이 점차로 고갈되면서 균사활성이 감소하고, 균체내 축적된 양분이 재활용됨으로써 균사생장이 안정화되기 때문으로 생각되었다.
- 배양 중 이산화탄소 농도와 균체내 질소함량을 측정한 결과, 이산화탄소 농도는 폭기 시작 일부터 증가하다가 13일째 3000 ppm으로 최고에 이른 후 서서히 감소하였고, 균체 내 질소함량은 13일째 급격히 축적된 후 다시 급격히 감소한 후 안정화되었다(Fig. 1). 그러나 배양기에서 분취한 1 L를 1시간 정치하여 조사한 균체량은 폭기 7일째부터 지속적으로 증가하였다(Fig.
- 그 결과 폭기방법은 균질화된 표고균사가 생장하면서 서로 뭉치지 않고 균질하게 증식하고, 대두박 첨가는 대수기 이후에도 지효성 질소영양원이 공급되도록 하는 효과가 있었다. 배양 중 침전 균사체의 중량은 13일째에 가장 많았으며, 배양용기의 배출구에서 이산화탄소 농도는 13일째에 가장 높았다. 상층 수용액에서 환원당은 폭기 12일째에 거의 소비되었다.
- 6 g/L)을 얻었다. 본 연구에서는 같은 기간 동안에 140 L 배양액에서 액체층과 균사 층이 분리되지 않는 고밀도로 부유된 표고 액체 균사체 약 55 g/L를 얻을 수 있었다. 그리고 이를 톱밥배지에 2 kg.
- 한편 에르고스테롤은 곰팡이 세포 내 원형질 내 분포하는 스테롤물질로서 실제 활력있는 세포질 함량을 추정하는 데 이용된다[10]. 이번 결과에서 에르고스테롤 함량(Fig. 4)은 호흡량이 가장 높고 균체내 질소축적량이 가장 높은 13일째 높았으며(Fig. 1), 균체량이 많고(Fig. 3) 균체내 총 질소량(Fig. 4)이 최대가 된 때와 거의 일치하였다. 한편 에르고스테롤 함량은 12일째 거의 최고점인 112.
- 그리고 배양균사체에서 총질소(T-N)량은 폭기 배양 13일째에 최고 수준이며, 키틴함량과 5종의 유리당 중에서 수크로즈함량은 폭기 배양 18일째에 가장 높았으나, 에르고스테롤 함량은 폭기 배양 22일째에 가장 높았다. 이와 같은 결과를 종합적으로 판단할 경우 표고액체 종균으로서 사용 적기는 균사활력이 가장 왕성하고 균체량이 많은 배양 18일째로 판단되었다.
- 3), 이는 첨가된 고형 대두박이 원심분리할 때에 균사체와 함께 침전되어 포함된 것으로, 균사생장과 함께 점차 용해되어 감소한 것으로 생각된다. 즉 균사벽의 실제 구성물인 키틴분석 결과(Fig. 4)에서 보면, 균체량은 배양 11일째까지는 느리게 증가하였고 그 이후에 대수적으로 급격히 증가하였다. 한편 15일째 이후 균사량의 변동(Fig.
- 폭기 배양 17일째에 분획된 시료를 1L의 매스실린더에서 1시간 동안 침전하여 얻은 균사체 부피(mL/L)는 대조구에서 68 mL/L인데 비하여, 대두박 증량 처리구에서는 85 mL/L로 25% 더 증가되었다. 이 분획된 1L의 용액을 원심분리하여 얻은 균사체 생중량은 대조구 35.
- 이것은 글루코스를 20 g/L 함유한 배지에서 구름버섯 균사체가 배양 6일째 환원당을 거의 소비한 것[16]보다는 느렸다. 한편 균사체내 유리당 함량은 배양 8주째부터 증가하여 18일 째에는 5종 총유리당 함량은 최대치인 88.0 mg/kg 되었으며 이후에는 점점 감소되었다(Fig. 5). 이런 변화는 균사체내 수크로스 함량의 변화와 거의 일치하며(Fig.
후속연구
- 액체 종균 내 균사체량은 투입된 영양원, 배양 온도, 폭기되는 공기량, 폭기구 구조, 접종원의 상태와 투입량 등에 따라 달라지는 것으로 보고된 바 있다[15]. 따라서 이와 같이 폭기 배양 중의 배출구에서의 이산화탄소 농도의 측정으로 액체 종균의 제조 상황을 수치적으로 확인이 가능할 것으로 판단되었다.
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