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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 닭의 품종 간 스트레스 반응 정도를 살펴보고자 한국 재래닭 및 단관 백색 레그혼종에 대하여 각각 고밀도 및 표준 밀도로 분리 사육하고, 밀사에 따른 품종 간 스트레스 정도를 비교 분석하였다. 스트레스 지표로서 품종 간 체중 변화, 조직별 세포의 텔로미어 함량, DNA 손상율 및 HSPs 유전자 발현율을 분석하고, 이들 지표들로서 품종 간 스트레스 반응 정도를 비교 고찰하였다.
제안 방법
- 5℃에서 30분간 반응시켰다. PN buffer로 세척 건조한 표본은 propidium iodide solution(Sigma Chem)으로 염색하고, 적녹 파장대의 필터(WIB filter)를 부착한 형광 현미경(Model AX-70, Olympus, Tokyo, Japan)으로 접합 발현 양상을 관찰하였다. 관찰한 임의의 간기 핵들을 디지털 카메라(Model DP-70, Olympus, Tokyo, Japan)로 촬영하고, 이를 컴퓨터에 저장 후 이미지 분석 프로그램(MetaMorphⓇ, UIC, Pennsylvania, USA)을 이용하여 개체 별 최소 100개 이상의 세포를 대상으로 핵 대비 telomeric DNA 함량을 분석하였다.
- Quantitative PCR은 real-time PCR machine(Model LC480, Roche, Mannheim, Germany)을 이용하여 cDNA 5 μL(10 ng/μL), primer(5 pmol/μL) 각각 0.5 μL, SYBR Green(Roche, GmbH, Mannheim, Germany) 10 μL, ddH2O 5μL를 넣어 최종 volume이 20 μL이 되도록 하고, 95℃에서 5분 처리하여 최초 변성시킨 후 95℃ 10초 변성, 60℃ 30초 접합, 72℃ 10초간 신장 반응을 40회 반복하면서 진행 중 실시간 형광 모니터링하였다.
- Real-time PCR을 위한 primer 제작은 reference gene(Actin) 및 HSP70, 90-α, 90-β 및 HMGCR을 표적 유전자(target gene)로 하여 primer-dimer가 형성되지 않도록 제작하였다(Table 1).
- Lysis solution을 제거한 다음, 전기영동 장치에 electrophoresis buffer(pH>13)를 채우고, 10분 정도 침지한 후, 25 V, 300 mA로 30분간 전기영동하였다. 건조된 슬라이드는 propidium iodide solution으로 5분간 염색하고, 냉장 초자수로 수세 후 형광 현미경으로 관찰하였다. 관측된 상은 디지털 카메라로 촬영하고, 개체 별 20개의 세포를 대상으로 Comet Score software v1.
- 9% sodium citrate(Sigma Chem) 용액으로 저장 처리하였다. 고정 처리는 혈액에서와 동일하게 하고 표본을 제작하였다. 제작된 슬라이드 표본은 RNase(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, USA)로 처리 후, 에탄올로 탈수 건조시킨 후 FISH에 제공하였다.
- PN buffer로 세척 건조한 표본은 propidium iodide solution(Sigma Chem)으로 염색하고, 적녹 파장대의 필터(WIB filter)를 부착한 형광 현미경(Model AX-70, Olympus, Tokyo, Japan)으로 접합 발현 양상을 관찰하였다. 관찰한 임의의 간기 핵들을 디지털 카메라(Model DP-70, Olympus, Tokyo, Japan)로 촬영하고, 이를 컴퓨터에 저장 후 이미지 분석 프로그램(MetaMorphⓇ, UIC, Pennsylvania, USA)을 이용하여 개체 별 최소 100개 이상의 세포를 대상으로 핵 대비 telomeric DNA 함량을 분석하였다.
- 건조된 슬라이드는 propidium iodide solution으로 5분간 염색하고, 냉장 초자수로 수세 후 형광 현미경으로 관찰하였다. 관측된 상은 디지털 카메라로 촬영하고, 개체 별 20개의 세포를 대상으로 Comet Score software v1.5(TriTek Corp. Sumerduck, VA, USA)로 분석하였다. 분석 항목으로는 tail 내 DNA 함유율(% DNA in tail; tail intensity/total comet intensity × 100), tail 내 DNA 생성률(tail moment; % DNA in tail × tail length) 및 올리브 모먼트(olive moment; tail intensity × total length/total comet intensity)를 조사하였다.
- 따라서 본 연구에서는 닭 품종별 고밀도 사육구와 대조구 간에 혈액 및 간 조직으로부터 HSP70, HSP90-α, HSP90-β 및 HMGCR 유전자의 mRNA 발현율을 분석 비교하여 이의 결과를 Table 5와 6에 제시하였다.
- 분석 항목으로는 tail 내 DNA 함유율(% DNA in tail; tail intensity/total comet intensity × 100), tail 내 DNA 생성률(tail moment; % DNA in tail × tail length) 및 올리브 모먼트(olive moment; tail intensity × total length/total comet intensity)를 조사하였다.
- 따라서 본 연구에서는 닭의 품종 간 스트레스 반응 정도를 살펴보고자 한국 재래닭 및 단관 백색 레그혼종에 대하여 각각 고밀도 및 표준 밀도로 분리 사육하고, 밀사에 따른 품종 간 스트레스 정도를 비교 분석하였다. 스트레스 지표로서 품종 간 체중 변화, 조직별 세포의 텔로미어 함량, DNA 손상율 및 HSPs 유전자 발현율을 분석하고, 이들 지표들로서 품종 간 스트레스 반응 정도를 비교 고찰하였다.
- 품종 간 스트레스 정도를 비교 분석하기 위하여 경남과학기술대학교 종합농장에서 부화하여 사육 중인 단관 백색 레그혼종 순계(Single Comb White Leghorn) 82수 및 한국 재래닭 적갈색종 82수를 비교 대상으로 하였다. 시험계들은 두 품종 공히 40주령 때 고 밀도구(311 cm2/수) 및 대조구(540 cm2/수)로 분리하고, 50주령까지 10주간 사육하였다. 시험계의 사양 관리는 강제 환기 및 자동 온도 조절 시스템이 완비된 무창 계사 내 2단 4열 케이지 형태로 칸 당 90 cm(W) × 90 cm(L) × 66 cm(H)의 철망 배터리형 케이지에서 사육하였고, 사료 급이는 자유 채식시켰으며, 점등 관리는 16시간 고정 점등하였다.
- 시험계들의 HSPs 및 HMGCR 유전자 발현 분석을 위하여 개체의 혈액으로부터 RNA를 분리하였다. 채혈 직후 Histopaque(Sigma Chem)을 이용하여 순수 백혈구를 분리하였고, 분리한 백혈구 세포는 QIAampⓇ RNA Blood Mini Kit(Qiagen GmbH, Hilden, Germany)를 이용하여 RNA를 추출하고, cDNA를 합성하였다.
- 시험계의 사양 관리는 강제 환기 및 자동 온도 조절 시스템이 완비된 무창 계사 내 2단 4열 케이지 형태로 칸 당 90 cm(W) × 90 cm(L) × 66 cm(H)의 철망 배터리형 케이지에서 사육하였고, 사료 급이는 자유 채식시켰으며, 점등 관리는 16시간 고정 점등하였다.
- 고정 처리는 혈액에서와 동일하게 하고 표본을 제작하였다. 제작된 슬라이드 표본은 RNase(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, USA)로 처리 후, 에탄올로 탈수 건조시킨 후 FISH에 제공하였다. 접합 처리는 Hybridization 용액(13 μL formamide, 5 μL hybridization buffer, 200 ng chicken telomeric DNA probe)을 떨어뜨리고, 85℃에서 5분간 변성시킨 후, 38.
- 시험계들의 HSPs 및 HMGCR 유전자 발현 분석을 위하여 개체의 혈액으로부터 RNA를 분리하였다. 채혈 직후 Histopaque(Sigma Chem)을 이용하여 순수 백혈구를 분리하였고, 분리한 백혈구 세포는 QIAampⓇ RNA Blood Mini Kit(Qiagen GmbH, Hilden, Germany)를 이용하여 RNA를 추출하고, cDNA를 합성하였다. Real-time PCR을 위한 primer 제작은 reference gene(Actin) 및 HSP70, 90-α, 90-β 및 HMGCR을 표적 유전자(target gene)로 하여 primer-dimer가 형성되지 않도록 제작하였다(Table 1).
- 텔로미어 함량 분석은 혈액, 간, 비장 및 난소 조직을 대상으로 하였으며, DNA 및 HSPs 분석은 혈액으로부터 시료를 분리하여 이용하였다. 혈액은 40주령 및 50령 때 시험구 별 무작위로 10수씩 추출하여 각 개체의 익 정맥으로부터 채혈하였고, 각 조직들은 시험 종료 때인 50주령에 동일 개체들을 대상으로 도살 후 부위별 채집을 하였다.
- 06M KCl(Sigma Chem, St Louis, MO, USA)을 이용하여 실온에서 15분간 저장 처리하고, 이후 methanol과 acetic acid가 3:1로 혼합된 고정액으로 고정 처리한 다음, 3회 정도 반복 후 세포액을 슬라이드 위에 떨어뜨려 표본을 제작하였다. 혈액 외 각 조직들은 채집 후 D-PBS(Gibco, Invitrogen Corp. Grand Island, N.Y, USA) 용액으로 세척한 다음 세절하고, RPMI 1640(Gibco) 배양액으로 재세척 후 0.9% sodium citrate(Sigma Chem) 용액으로 저장 처리하였다. 고정 처리는 혈액에서와 동일하게 하고 표본을 제작하였다.
- 텔로미어 함량 분석은 혈액, 간, 비장 및 난소 조직을 대상으로 하였으며, DNA 및 HSPs 분석은 혈액으로부터 시료를 분리하여 이용하였다. 혈액은 40주령 및 50령 때 시험구 별 무작위로 10수씩 추출하여 각 개체의 익 정맥으로부터 채혈하였고, 각 조직들은 시험 종료 때인 50주령에 동일 개체들을 대상으로 도살 후 부위별 채집을 하였다. 시험에 관련된 닭의 관리 및 취급은 본 대학 동물실험윤리위원회(IACUC)의 규정을 준수하였으며, 사전 승인을 받았다.
대상 데이터
- 품종 간 스트레스 정도를 비교 분석하기 위하여 경남과학기술대학교 종합농장에서 부화하여 사육 중인 단관 백색 레그혼종 순계(Single Comb White Leghorn) 82수 및 한국 재래닭 적갈색종 82수를 비교 대상으로 하였다. 시험계들은 두 품종 공히 40주령 때 고 밀도구(311 cm2/수) 및 대조구(540 cm2/수)로 분리하고, 50주령까지 10주간 사육하였다.
데이터처리
- 시험구 간 체중, telomeric DNA 함량, DNA 손상율, HSPs 및 HMGCR 유전자 발현율의 통계 분석은 2 × 2 요인 시험 설계에 따라 SAS 통계 패키지(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)의 GLM procedure를 이용하여 품종 간, 사육 밀도 간 및 품종 × 사육 밀도에 대한 유의성을 검정하고, 요인별 차이를 분석하였다.
이론/모형
- DNA 손상율은 Comet assay로 분석하였다. 1% agrose로 도포한 슬라이드에 혈액과 0.
- Reference gene을 이용한 각 표적 유전자의 상대적 정량 값은 Livak과 Schmittgen(2001)이 제시한 2—△△Ct 방법으로 분석하였다.
- 닭 품종 별 고밀도 사육구와 대조구 간에 스트레스 반응 정도를 살펴보고자 혈액 세포 내 DNA 손상율을 Comet assay법으로 분석하고, 이의 결과를 Table 4에 제시하였다. 일반적으로 개체들이 스트레스에 노출되면 세포들의 DNA 손상이 급격히 증가되어 apoptosis가 촉진된다(Chen et al.
성능/효과
- 닭의 품종 간 및 계통 간 텔로미어 길이에 대한 변이 연구는 거의 찾아보기 어려웠으나, 본 연구 결과, 텔로미어 길이는 유전적 차이로 인해 품종 간 변이가 존재하는 것으로 사료된다.
- 또한, 품종 간에 있어 40주령과 50주령 모두 레그혼이 재래닭에 비하여 백혈구세포의 텔로미어 함유율이 높게 나타났으나, 시험 기간 동안 품종 간 텔로미어 감축율의 차이는 없는 것으로 나타났다. 더불어 비장 세포의 경우에도 두 품종 공히 고밀도구가 대조구에 비해 유의하게 낮은 텔로미어 함유율을 보였으나, 간이나 난소 세포의 경우에는 처리 간 차이가 없었다. 이러한 결과는 백혈구 및 비장 조직의 경우, 면역과 직접적 관련이 있는 세포들로서 다른 조직과 달리 외적 스트레스 요인에 매우 민감하게 작용하여 텔로미어 감축에 큰 영향을 받는 것으로 여겨진다.
- 또한 품종과 시험구 간 상호 작용이 없는 것으로 분석되어, 각각 독립적 요인인 것으로 나타났다. 따라서 밀사와 같은 환경적 스트레스가 품종에 관계없이 세포 내 DNA 손상을 유의하게 증가시키는 것으로 보이나, WL과 KNC 간에 스트레스에 따른 품종 간 DNA 손상 정도의 차이는 없는 것으로 사료된다.
- 한편, 품종 간 DNA 손상 정도는 모든 지표에서 차이가 없는 것으로 분석되었다. 또한 품종과 시험구 간 상호 작용이 없는 것으로 분석되어, 각각 독립적 요인인 것으로 나타났다. 따라서 밀사와 같은 환경적 스트레스가 품종에 관계없이 세포 내 DNA 손상을 유의하게 증가시키는 것으로 보이나, WL과 KNC 간에 스트레스에 따른 품종 간 DNA 손상 정도의 차이는 없는 것으로 사료된다.
- 분석 결과, 시험 개시 시기인 40주령의 백혈구 세포의 텔로미어 함량은 두 품종 공히 시험구별 차이가 나타나지 않았으나, 시험 종료 때인 50주령의 경우, KNC와 WL 모두 고밀도 사육구에서 유의적으로 낮은 텔로미어 함유율을 나타내었으며, 시험 기간 동안 텔로미어의 감축율 또한 고밀도에서 유의적으로 높게 나타났다. 또한, 품종 간에 있어 40주령과 50주령 모두 레그혼이 재래닭에 비하여 백혈구세포의 텔로미어 함유율이 높게 나타났으나, 시험 기간 동안 품종 간 텔로미어 감축율의 차이는 없는 것으로 나타났다. 더불어 비장 세포의 경우에도 두 품종 공히 고밀도구가 대조구에 비해 유의하게 낮은 텔로미어 함유율을 보였으나, 간이나 난소 세포의 경우에는 처리 간 차이가 없었다.
- 분석 결과, WL과 KNC의 HSP70, HSP90-α, HSP90-β 및 HMGCR 유전자의 발현 양상이 혈액과 간 조직에서 거의 유사한 결과 형태를 보였으며, HMGCR을 제외한 대부분의 유전자들에서 품종 간 및 사육 밀도 간 발현량의 차이를 나타내었다.
- Comet assay의 분석 값으로 전체 핵 대비 DNA 파손율을 나타내는 % DNA in tail, tail 내 DNA 생성률을 제시하는 Tail Moment 및 DNA 파손 분포와 정도를 상대적으로 나타내는 Olive Moment가 있다. 분석 결과, 닭 품종 별 고밀도 사육구와 대조구 간에 공히 밀사구가 대조구에 비해 모든 Comet 지표에서 유의적으로 높은 분석 값을 나타내었다. 한편, 품종 간 DNA 손상 정도는 모든 지표에서 차이가 없는 것으로 분석되었다.
- 분석 결과, 두 품종 공히 밀사에 따라 HSP90-α 유전자 발현량이 유의적으로 증가하였고, HSP70의 경우, WL에서만 차이를 보였으며, 반응 정도는 공히 WL이 KNC에 비해 높게 나타났다.
- KNC와 WL의 백혈구, 간, 비장 및 난소 세포에 대한 상대적 telomeric DNA 함유율을 측정하고, 품종 간 및 사육 밀도 간 분석 결과를 Table 3에 제시하였다. 분석 결과, 시험 개시 시기인 40주령의 백혈구 세포의 텔로미어 함량은 두 품종 공히 시험구별 차이가 나타나지 않았으나, 시험 종료 때인 50주령의 경우, KNC와 WL 모두 고밀도 사육구에서 유의적으로 낮은 텔로미어 함유율을 나타내었으며, 시험 기간 동안 텔로미어의 감축율 또한 고밀도에서 유의적으로 높게 나타났다. 또한, 품종 간에 있어 40주령과 50주령 모두 레그혼이 재래닭에 비하여 백혈구세포의 텔로미어 함유율이 높게 나타났으나, 시험 기간 동안 품종 간 텔로미어 감축율의 차이는 없는 것으로 나타났다.
- 시험 결과, 체중 및 증체량에 있어 KNC와 WL의 품종 간 차이는 없는 것으로 나타났으나, 두 품종 공히 밀사에 따른 스트레스구는 대조구에 비해 유의한 체중의 감량을 나타내었다(P<0.01).
- , 2013). 이상의 결과들을 종합하여 볼 때, 품종과 관계없이 닭에 있어 고밀도 사육이 개체들에 민감한 환경적 스트레스 요인임을 시사하고, 품종 간 스트레스의 반응 정도는 분석 항목 간 다소의 차이는 있으나, 대체적으로 WL이 KNC에 비해 스트레스에 보다 민감하게 반응하는 것으로 사료된다.
- 닭의 품종 간 및 계통 간 텔로미어 길이에 대한 변이 연구는 거의 찾아보기 어려웠으나, 본 연구 결과, 텔로미어 길이는 유전적 차이로 인해 품종 간 변이가 존재하는 것으로 사료된다. 이상의 결과로 부터 한국 재래닭과 단관 백색 레그혼종 간 텔로미어 함유율은 유전적 요인에 의해 본질적으로 다소의 차이가 있는 것으로 보이나, 스트레스 와 같은 외적 요인에 의한 반응 정도에는 큰 차이가 없는 것으로 사료된다.
- , 2008b). 이상의 연구 보고들과 같이 본 시험에서도 고밀도 사육과 같은 외적 사양 관리 스트레스는 닭의 성장에 직접적인 영향을 미치는 것으로 보이나, 품종 간 체중 감량에 기인된 스트레스 반응 정도의 차이는 거의 없는 것으로 사료된다.
- 품종 간에 있어 KNC가 WL에 비하여 HSP90-α, HSP90-β 및 HSP70의 유전자 발현율이 유의적으로 높게 나타났고, 고밀도 사육 처리구가 대조구에 비해 HSP90-α 및 HSP70의 발현율이 높게 나타났다.
- 이러한 결과는 백혈구 및 비장 조직의 경우, 면역과 직접적 관련이 있는 세포들로서 다른 조직과 달리 외적 스트레스 요인에 매우 민감하게 작용하여 텔로미어 감축에 큰 영향을 받는 것으로 여겨진다. 한편, 모든 조직에서 품종과 사육 밀도 간 상호 작용이 없는 것으로 분석되어 각 요인들이 독립적으로 텔로미어 함유율에 영향을 미치는 것으로 사료된다. 이러한 결과는 닭의 고밀도 사육에 따른 밀사 스트레스가 세포 내 텔로미어의 감축을 촉진시킨다는 여러 보고와 일치되는 양상으로 외적 스트레스 요인이 텔로미어 감축 속도에 직접적으로 영향함을 재차 입증하였다(Beloor et al.
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