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제안 방법
- 각 조직의 glutathione 함량은 조직 homogenate 분획 0.2 ml에 3차 증류수 0.3 ml과 0.4% sulfosalicylic acid 0.5 ml을 가하여 혼합한 후 원심분리 시킨 뒤 상등액 0.3 ml에 5,5’-dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB) 발색시약을 첨가하여 412 nm 흡광도에서 측정하였으며, glutathione의 표준 검량 곡선에 의해 함량을 산출하여 조직 g당 mg으로 표시하였다[3].
- 동물실험은 4주간 각 실험 식이를 급여하면서 사육한 후 실험 최종일에 12시간 절식시키고, 디에틸에테르로 가볍게 마취시켜 해부하였다. 개복 후 복부 대동맥으로부터 채혈하여 혈액을 채취하였고, 실온에서 약 30분간 방치시킨 후 3,000 rpm에서 20분간 원심분리 하여 얻은 혈청은 혈청 생화학적 분석에 제공하였다. 채혈 후 각 조직을 적출하여 0.
- 동물실험은 4주간 각 실험 식이를 급여하면서 사육한 후 실험 최종일에 12시간 절식시키고, 디에틸에테르로 가볍게 마취시켜 해부하였다. 개복 후 복부 대동맥으로부터 채혈하여 혈액을 채취하였고, 실온에서 약 30분간 방치시킨 후 3,000 rpm에서 20분간 원심분리 하여 얻은 혈청은 혈청 생화학적 분석에 제공하였다.
- 식이 조성은 Table 1와 같으며, 실험군은 정상군(N), 알코올 투여 대조군(C), 알코올+2.5% (w/w) 와송(2.5OM), 알코올+5% (w/w) 와송(5OM), 알코올+2.5% (w/w) 발효 와송 (2.5FOM), 알코올+5% (w/w) 발효 와송(5FOM) 투여군과 간기능 개선제로 알려진 silymarin (SM)을 식이 중에 0.1% (w/w)의 농도로 투여하여 양성 대조군으로 나누어 실험을 진행하였다. 동물 사육 및 실험동물 사용에 대한 국립 보건 연구소의 지침에 따랐으며, 동아대학교 동물실험 윤리심의 위원회의 승인(승인번호: DIACUC-승인-13-4)을 받아 진행하였다.
- 온도 22±2℃, 습도 50±5%, 명암주기 12시간(09:00~21:00)이 자동 설정된 동물 사육실에서 사육하였으며, 사육 기간 중 식이 섭취량은 매일 측정하였고, 체중은 매주 한번 일정한 시간에 측정하였다. 알코올 투여는 알코올에 의한 급성독성을 방지하기 위해 10%농도로 시작하여 20% 농도로 1주일마다 단계적으로 높이고, 30%의 알코올 투여와 함께 4주간 식이를 급여하였다.
- 온도 22±2℃, 습도 50±5%, 명암주기 12시간(09:00~21:00)이 자동 설정된 동물 사육실에서 사육하였으며, 사육 기간 중 식이 섭취량은 매일 측정하였고, 체중은 매주 한번 일정한 시간에 측정하였다.
- 6%) 에 접종하여 37℃, 24시간 동안 정치배양 한 후 와송 분말에 접종하였다. 유산균 접종은 배양한 유산균 혼합균을 원심 분리시킨 뒤 배양액을 제거하여 균체를 5% (v/w) 수준으로 접종하였으며, 발효되는 동안의 건조를 막기 위하여 멸균수를 뿌려주면서 37℃에서 48시간 동안 고체 배양한 후 발효 와송을 얻었다[7]. 발효 후 발효물은 60℃에서 8시간 동안 열풍 건조한 후 분말화하여 식이에 사용하였다.
- 적출한 간 조직으로부터 homogenate 분획의 조제는 조직을 일정량 취해 ice-cold potassium phosphate buffer 용액(0.1 mM/l potassium phosphate containing 1 mM/1 sodium EDTA and 1 mM/l dithiothreitol, pH 7.4)을 9배 양을 첨가하여 IKA-ULTRA-TURRAX T25 basic homogenizer (IKAWERKE GMBH & CO., KG, Staufen, Germany)를 이용하여 균질액을 제조하였다.
- 개복 후 복부 대동맥으로부터 채혈하여 혈액을 채취하였고, 실온에서 약 30분간 방치시킨 후 3,000 rpm에서 20분간 원심분리 하여 얻은 혈청은 혈청 생화학적 분석에 제공하였다. 채혈 후 각 조직을 적출하여 0.9% 생리식염수로 세척하고 여과지로 물기를 제거한 후 무게를 측정하고 분석시료로 제공하였다.
- japonicus 추출물 투여 농도가 높을수록 대조군에 비해 더 높은 조직의 지질 개선능 및 지질과산화 억제능을 보이며, 조직에서 항산화 활성을 나타내어 간장 보호 효능의 가능성을 시사해 주고 있다. 한편, 미생물을 이용한 천연물 발효는 미생물이 분비하는 각종 효소와 세포 내 조직에 있던 생리활성 물질들이 유리되기 때문에 생체이용률이 높아지는 것으로 알려져 있어[16] 본 연구에서는 와송 분말과 유산균 발효시킨 발효 와송 분말을 알코올성 유발 지방간 흰쥐에 각각 식이로 투여하여 흰쥐 조직의 과산화지질 및 혈중 지질에 미치는 효과를 비교 검토하였다.
- 혈청 중의 AST, ALT, ALP, LDH, γ-GTP, cholinesterase 활성 및 triglyceride는 의료 전문 수탁 검사기관인 아이케이 사이언스(부산, 한국)에 의뢰하여 분석하였다.
대상 데이터
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실험 재료 및 발효 조건
건조 와송(둥근바위솔, Orostachys malacophyllus (OM))은 2013년 4월 ㈜풀그린(서울, 한국)에서 구입한 후 건조시켜 분쇄 후 시료로 실험에 사용하였다. 본 실험에 사용한 시판되고 있는 3종의 유산균 혼합물(Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus) (Yogourmet, Quebec city, Canada)을 MRS배지(peptone 10%, beef extract 10%, yeast extract 9%, dextrose 36%, polysorbate 1.
- 건조 와송(둥근바위솔, Orostachys malacophyllus (OM))은 2013년 4월 ㈜풀그린(서울, 한국)에서 구입한 후 건조시켜 분쇄 후 시료로 실험에 사용하였다. 본 실험에 사용한 시판되고 있는 3종의 유산균 혼합물(Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus) (Yogourmet, Quebec city, Canada)을 MRS배지(peptone 10%, beef extract 10%, yeast extract 9%, dextrose 36%, polysorbate 1.8%, ammonium citrate 3.6%, sodium acetate 9%, magnesium sulfate 0.2%, manganese sulfate 0.1%, dipotassium phosphate 3.6%) 에 접종하여 37℃, 24시간 동안 정치배양 한 후 와송 분말에 접종하였다. 유산균 접종은 배양한 유산균 혼합균을 원심 분리시킨 뒤 배양액을 제거하여 균체를 5% (v/w) 수준으로 접종하였으며, 발효되는 동안의 건조를 막기 위하여 멸균수를 뿌려주면서 37℃에서 48시간 동안 고체 배양한 후 발효 와송을 얻었다[7].
- 실험동물은 6주령의 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐를 ㈜대한 바이오링크(충북 음성, 한국)로부터 구입하여 환경에 적응 시킨 후 체중이 동일하게 난괴법으로 분류하여, 각 실험군당 6마리씩 나누어 동물 사육실에서 사육하였다. 온도 22±2℃, 습도 50±5%, 명암주기 12시간(09:00~21:00)이 자동 설정된 동물 사육실에서 사육하였으며, 사육 기간 중 식이 섭취량은 매일 측정하였고, 체중은 매주 한번 일정한 시간에 측정하였다.
데이터처리
- 실험으로부터 얻어진 결과는 one-way ANOVA 검정에 의한 평균치와 표준오차(mean ± SE)로 표시하였고, 각 실험군 간의 유의성 검증은 Duncan’s multiple range test로 나타내었다[10].
이론/모형
- 각 조직으로부터 얻은 homogenate 분획의 과산화지질 함량은 TBARS 방법[24]에 준하여 측정하였다. 단백질 1 mg을 함유한 분획 용액 1 ml에 각각 TBA (thiobarbituric acid) 시약2 ml을 가하여 잘 혼합하고, 끓는 물에서 30분간 반응 시킨뒤 실온에서 방냉하여 3,000 rpm으로 10분간 원심분리 한 후 상등액을 535 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 이 상층액에서 cytosol 분획과 microsome 분획을 얻어 실험에 제공하였다. 간 조직의 Homogenate, mitochondria 및 microsome 분획의 단백질 농도는 Bradford 방법[4]에 준하여 bovine serum albumin을 표준 물질로 하여 측정하였다.
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