[논문]PDMS 채널 내부에 성장된 산화아연 나노막대를 이용한 H7N9 인플루엔자 바이러스 전기화학 면역센서

한지훈; 이동영; 박정호

doi:10.5369/jsst.2014.23.4.278

PDMS 채널 내부에 성장된 산화아연 나노막대를 이용한 H7N9 인플루엔자 바이러스 전기화학 면역센서
Electrochemical Immunosensor Based on the ZnO Nanorods Inside PDMS Channel for H7N9 Influenza Virus Detection 원문보기

Journal of sensor science and technology = 센서학회지, v.23 no.4, 2014년, pp.278 - 283

한지훈 (고려대학교 전기전자공학과) , 이동영 (고려대학교 전기전자공학과) , 박정호 (고려대학교 전기전자공학과)

Abstract ▼ AI-Helper

In this study, we propose an immunosensor using zinc oxide nanorods (NRs) inside PDMS channel for detecting the influenza A virus subtype H7N9. ZnO with high isoelectric point (IEP, ~9.5) makes it suitable for immobilizing proteins with low IEP. In this proposed H7N9 immunosensor structure ZnO NRs were grown on the PDMS channel inner surface to immobilize H7N9 capture antibody. A sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method with was used 3,3',5,5' tetramethylbenzidine (TMB) for detecting H7N9 influenza virus. The immunosensor was evaluated by amperometry at various H7N9 influenza antigen concentrations (1 pg/ml - 1 ng/ml). The redox peak voltage and current were measured by amperometry with ZnO NWs and without ZnO NWs inside PDMS channel. The measurement results of the H7N9 immunosensor showed that oxidation peak current of TMB at 0.25 V logarithmically increased from 2.3 to 3.8 uA as the H7N9 influenza antigen concentration changed from 1 pg/ml to 1 ng/ml. And then we demonstrated that ZnO NRs inside PDMS channel can improve the sensitivity of immunosensor to compare non-ZnO NRs inside PDMS channel.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구를 통해 PDMS 채널 내부에 형성된 산화아연 나노막대가 가진 생체적합성, 넓은 표면적, 등전점을 이용해 단백질을 고정할 수 있는 특성이 전기화학적 면역센서의 감도 향상에 영향을 끼칠 수 있음을 보이고자 한다.
이를 위해 면역센서의 분석에는 광열 편향 분광법 (photothermal deflection spectroscopy, PDS)[6], 화학발광법 (chemiluminescence)[7,8], 질량분석법(mass spectrometry)[9], 전기화학 측정법(electrochemistry)[10-12] 등이 사용된다. 이 가운데 전기화학 측정법은 낮은 농도의 항원 검출이 가능하고, 손쉬운 측정방식으로 인해 많은 연구가 활발히 진행되고 있는 분야 이며 본 논문에서는 일반적인 금속 전극만을 사용한 구조보다 민감도 향상을 위해 산화아연의 나노막대를 PDMS 내부에 성장시켜 미소량의 H7N9 인플루엔자 바이러스를 신속히 측정할수 있는 마이크로채널 기반의 전기화학적 면역센서의 제작 및 특성 분석 결과를 보인다.
이 논문에서는 PDMS 채널 내부에 산화아연 나노막대를 형성하고 그 위에 H7N9 인플루엔자 바이러스 샌드위치 ELISA 구조를 형성하여 산화아연 나노막대를 이용하지 않았을 시와 비교해 그 특성을 검증하는 연구를 진행하였다. 산화아연 나노막대가 가지고 있는 생체적합성, 넓은 표면적, 단백질의 고정화의 용이성을 이용한 H7N9 인플루엔자 바이러스 검지는 전기화학 측정법인 전류법으로 1 pg/ml, 100 pg/ml, 1 ng/ml의 항원 농도 에서 뚜렷히 구분되는 전류값이 측정되었으며 또한 이를 Fig.
6를 통해 TMBHRP의 산화/환원 반응 원리를 나타내었으며, 식(1)에 따라 TMB는 HRP 효소에 의해 산화되어 TMB 라디칼(radical)과 수소이온, 전자를 생성하고 식(2)에 따라 산화된 TMB는 작업전극에 서의 전기화학 반응에 의해 환원되며 이러한 과정이 순환적으로 반복되며 일어난다. 이러한 원리를 이용해 순환전압전류법으로 TMB의 산화 최대순간전류가 발생하는 전위차를 확인하고 전류법으로 H7N9 인플루엔자 항원의 농도를 측정하고자 한다.

제안 방법

5(a)와같이 PDMS 채널 내부에 산화아연 나노막대 성장 후, H7N9 샌드위치 ELISA 구조를 형성한 PDMS 채널과 Fig. 5(b)와 같이 PDMS 채널 내부에 산화아연 나노막대의 성장 없이 H7N9 샌드위치 ELISA구조를 형성한 PDMS 채널을 각각 DRP-110 칩과 결합하여 H7N9 인플루엔자 바이러스 검지를 위한 면역센서를 제작하였다.
Fig. 4(c)와 같이 DRP-110 칩을 포텐시오스텟(DRP-STAT200, Drop Sense Inc.)에 연결하여 순환전압전류법 및 전류법을 측정하였다.
25 V를 일정하게 작업전극과 기준전극에 인가하여 80초간 전류를 측정하였으며, 이를 통해 항원의 농도(1 pg/ml, 100 pg/ ml, 1 ng/ml)를 측정할 수 있다. PDMS 채널 내부에 산화아연 나노막대를 형성한 H7N9 인플루엔자 바이러스 면역센서와 산화아연 나노막대를 형성하지 않은 면역센서로 전류법 측정을 진행하였으며, 이에 대한 결과를 Fig. 8, Fig. 9에 나타내었다.
PDMS 채널 내부에 형성한 산화아연 막대의 영향을 비교 분석하기 위하여 앞에서 언급한 방법으로 산화아연 나노막대를 마이크로채널 내부에 형성한 전기화학적 면역센서와 산화아연 나노막대를 채널 내부에 성장하지 않고 나머지 구조는 동일한 두가지 전기화학적 면역센서를 제작하였다. 이 두 가지 면역센서의 채널 내부에 각각 H7N9 인플루엔자 바이러스를 포획항체/ 항원/검출항체–HRP(influenza A H7N9, A/Shanghai/1/2013, Sino Biolo-gical Inc.
핫플레이트(hot plate) 위에서 소프트베이크(soft bake)를 진행한 뒤, 자외선 노광기(UV exposure)를 이용해 노광을 진행하였다. 그 뒤 핫플레이트 위에서 PEB(Post Exposure Bake)를 진행한 후, SU-8 현상액을 이용해 현상하여 SU-8 몰드를 제작하였다. 이어서 실가드(sylgard) A와 실가드 B를 10 : 1 로 교반기를 이용해 혼합한 후, 제작된 SU-8 몰드 위에 부어 건조오븐(dry oven) 내에서 경화를 진행하였다.
5 ug/ml, 농도)를 파이펫(pipet)을 이용하여 채널 내부의 표면 위에 파이펫팅(pipetting)하여 4 ^oC 냉장고에서 24 시간 동안 고정화 작업을 진행한 뒤, 세척용액(washing solution)을 이용하여 비특이적으로 고정되어있는 포획항체를 제거하였다. 그 후, 2% 소혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)용액을 코팅하여 1시간 동안 상온에서 고정화시켜 항원-항체 반응 이외의 비특이적인 결합이 이뤄질 수 없도록 하였다. 다시 세척용액을 이용하여 비특이적으로 고정되어있는 소혈청 알부민을 제거하고 H7N9 항원(1 pg/ml, 100 pg/ml, 1 ng/ml, 농도)을 포획항체 위에 파이펫팅하여 상온에서 2시간 동안 배양(incubation) 하였다.
다시 한번 더 세척용액을 이용해 비특이적으로 결합되어있는 H7N9 항원을 제거하고, 검출항체-HRP 결합체(1 ug/ml, 농도)를 파이펫팅하여 상온에서 1시간동안 배양하였다. 마지막으로 세척용액을 이용해 비특이적으로 결합된 검출항체-HRP를 제거하여 H7N9 샌드위치 ELISA 구조를 완성하였다. Fig.
본 논문에서는 PDMS 채널 내부에 산화아연 나노막대를 성장 시킨 후, H7N9 인플루엔자 바이러스를 포획항체/항원/검출 항체-HRP(Horseradish Peroxidase)로 샌드위치 ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 구조를 형성하여 순환전압전류법(cyclic voltammetry)을 이용해 산화 최대순간전류(oxidation peak current)가 발생하는 전위차를 확인하고 전류법(amperometry)을 통해 H7N9 항원 농도(1 pg/ml~1 ng/ml)별 전류량 비교를 진행하였다. 전류법은 일반적으로 산화된 TMB를 측정할 때 많이 사용되는 측정법으로써, TMB의 기질로 사용되는 HRP(Horseradish Peroxidase)효소가 불특정 다수의 다른 기질과도 반응하기 때문에 TMB의 산화에 의해 발생된 산화 최대순간전류가 나타나는 고정된 전위차를 면역센서에 지속적으로 인가하고 그때에 발생 되는 전류를 측정하여 항원의 농도를 알아낼 수 있다는 장점을 가진다[19].
순환전압전류법을 통해 측정된 산화 최대순간전류가 발생하는 0.25 V를 일정하게 작업전극과 기준전극에 인가하여 80초간 전류를 측정하였으며, 이를 통해 항원의 농도(1 pg/ml, 100 pg/ ml, 1 ng/ml)를 측정할 수 있다. PDMS 채널 내부에 산화아연 나노막대를 형성한 H7N9 인플루엔자 바이러스 면역센서와 산화아연 나노막대를 형성하지 않은 면역센서로 전류법 측정을 진행하였으며, 이에 대한 결과를 Fig.
이 두 가지 면역센서의 채널 내부에 각각 H7N9 인플루엔자 바이러스를 포획항체/ 항원/검출항체–HRP(influenza A H7N9, A/Shanghai/1/2013, Sino Biolo-gical Inc.)로 샌드위치 ELISA 구조를 형성하기 위해 포획황체(0.5 ug/ml, 농도)를 파이펫(pipet)을 이용하여 채널 내부의 표면 위에 파이펫팅(pipetting)하여 4 oC 냉장고에서 24 시간 동안 고정화 작업을 진행한 뒤, 세척용액(washing solution)을 이용하여 비특이적으로 고정되어있는 포획항체를 제거하였다.
그 뒤 핫플레이트 위에서 PEB(Post Exposure Bake)를 진행한 후, SU-8 현상액을 이용해 현상하여 SU-8 몰드를 제작하였다. 이어서 실가드(sylgard) A와 실가드 B를 10 : 1 로 교반기를 이용해 혼합한 후, 제작된 SU-8 몰드 위에 부어 건조오븐(dry oven) 내에서 경화를 진행하였다.
제작된 PDMS 채널 내부에 산화아연 나노막대를 성장시키기 위해 수열방식을 사용하였으며, 씨앗용액(seed solution)은 에탄올(C2H5OH, 분자식)에 초산아연(Zn(CH3 COO)2 · 2H20, 분자식) 을 혼합하여 50 nM이 되도록 제작하였고, 성장용액(growth solution) 은 헥사메틸렌테트라민((CH2)6N4 , 분자식)과 아연헥사수화물 (Zn(NO3)2 6H2O)을 초순수(D.I. water)와 혼합하여 각각 0.05 M이 되도록 제작하였다.
05 M이 되도록 제작하였다. 제작된 PDMS 채널을 씨앗용액에 담궜다가 빼내어 핫플레이트 위에서 건조를 진행한 뒤, 성장용액에 담궈 90^oC의 드라이 오븐(dry oven)내 에서 4시간 동안 산화아연 나노막대를 성장 시켰다. 형성된 산화아연 나노막대는 SEM(Scanning Electron Microscope)을 이용해 PDMS 채널 내부 표면을 관찰했고, Fig.
PDMS 채널의 형성은 Si wafer를 기판으로 사용하였으며 스핀코터(spin coater)를 이용해 2000 rpm에서 SU-8을 150 um의 두께로 코팅 하였다. 핫플레이트(hot plate) 위에서 소프트베이크(soft bake)를 진행한 뒤, 자외선 노광기(UV exposure)를 이용해 노광을 진행하였다. 그 뒤 핫플레이트 위에서 PEB(Post Exposure Bake)를 진행한 후, SU-8 현상액을 이용해 현상하여 SU-8 몰드를 제작하였다.

대상 데이터

(a)는 PDMS 채널이며 크기는 5 mm × 10 mm으로 제작하였다.
4(b)는 DRP-110 칩의 전극 형태를 보이며 크기는 10 mm × 34 mm이다. DRP-110 칩은 작업전극(working electrode :Carbon), 보조전극(counter electrode : Carbon), 기준전극(reference electrode : Silver)으로 총 3전극으로 구성되어있다. Fig.
H7N9 인플루엔자 바이러스 면역센서의 제작을 위해 사용한 전극은 Drop Sense사에서 판매하는 DRP-110 칩을 사용하였다. Fig.

이론/모형

제작된 면역센서의 산화/환원 최대순간전류를 측정하기 위해 포텐시오스텟을 이용하여 순환전압전류법 측정을 진행하였다. 제작된 PDMS의 주입구를 통해 TMB 기준용액(TMB substrate solution, EzWay Inc.

성능/효과

Fig. 10의 그래프를 통해 각 항원 농도에 따라 경향성을 가지며 다른 전류가 측정이 되는 것을 확인 할 수 있으며, PDMS 채널 내부에 산화아연 나노막대를 형성한 H7N9 인플루엔자 바이러스 면역센서와 나노막대를 형성하지 않은 면역센서에서 1ng/ml 항원에 대한 전류를 측정하였을 때, Table 2에서 나타낸 것과 같이 각각 3.80 uA, 2.70 uA가 측정되었으며 PDMS 채널 내부에 산화아연 나노막대가 있을 경우에 약 1.4배 증가하는 것을 확인하였다. 또한 80초간 0.
10과 같이 각각 다른 항원 농도에 대한 전류량 분석 시에도 경향성을 가지는 것을 확인하였다. PDMS 채널 내부에 산화아연 나노막대를 형성하지 않았을 시와의 비교 결과를 통해 약 1.4배 높은 감도를 가질 수 있는 것을 결과로 보여주었으며, 이는 산화아연 나노막대에 의한 표면적 증가로 인해 면역센서의 감도가 향상될 수 있음을 나타내며, 전기화학 바이오센서로의 활용이 가능함을 의미한다. 또한 본 연구에서 사용된 산화아연 나노 막대가 Fig.
4배 증가하는 것을 확인하였다. 또한 80초간 0.25 V를 일정하게 인가하였을 때 전류 역시 일정하게 측정되는 것을 확인하였으며 H7N9 인플루엔자 바이러스 검지가 면역센서에서 잘 이루어지고 있다는 것을 나타낸다.
4배 높은 감도를 가질 수 있는 것을 결과로 보여주었으며, 이는 산화아연 나노막대에 의한 표면적 증가로 인해 면역센서의 감도가 향상될 수 있음을 나타내며, 전기화학 바이오센서로의 활용이 가능함을 의미한다. 또한 본 연구에서 사용된 산화아연 나노 막대가 Fig. 2에서 확인할 수 있듯이 PDMS 채널 내부에 누워 있는 형태로 성장된 것을 관찰할 수 있다. 이는 산화아연 나노 막대 성장 후에 초순수를 이용한 과도한 린싱(rinsing)으로 인해수직으로 성장된 산화아연 나노막대가 쓰러진 것으로 생각된다.
이 논문에서는 PDMS 채널 내부에 산화아연 나노막대를 형성하고 그 위에 H7N9 인플루엔자 바이러스 샌드위치 ELISA 구조를 형성하여 산화아연 나노막대를 이용하지 않았을 시와 비교해 그 특성을 검증하는 연구를 진행하였다. 산화아연 나노막대가 가지고 있는 생체적합성, 넓은 표면적, 단백질의 고정화의 용이성을 이용한 H7N9 인플루엔자 바이러스 검지는 전기화학 측정법인 전류법으로 1 pg/ml, 100 pg/ml, 1 ng/ml의 항원 농도 에서 뚜렷히 구분되는 전류값이 측정되었으며 또한 이를 Fig.10과 같이 각각 다른 항원 농도에 대한 전류량 분석 시에도 경향성을 가지는 것을 확인하였다. PDMS 채널 내부에 산화아연 나노막대를 형성하지 않았을 시와의 비교 결과를 통해 약 1.
제작된 면역센서의 산화/환원 최대순간전류를 측정하기 위해 포텐시오스텟을 이용하여 순환전압전류법 측정을 진행하였다. 제작된 PDMS의 주입구를 통해 TMB 기준용액(TMB substrate solution, EzWay Inc.)을 주입 후, Table 1과 같이 포텐시오스텟을 설정한 뒤 TMB의 산화/환원 반응을 측정 하였으며, Fig. 7의 그래프를 통해 TMB의 산화 최대순간전류는 0.25 V에서 발생하며, 환원 최대순간전류는 0.1 V에서 발생하는 것을 확인하였다.
제작된 PDMS 채널을 씨앗용액에 담궜다가 빼내어 핫플레이트 위에서 건조를 진행한 뒤, 성장용액에 담궈 90^oC의 드라이 오븐(dry oven)내 에서 4시간 동안 산화아연 나노막대를 성장 시켰다. 형성된 산화아연 나노막대는 SEM(Scanning Electron Microscope)을 이용해 PDMS 채널 내부 표면을 관찰했고, Fig. 2와 같이 산화아연 나노막대가 잘 성장되었음을 확인하였다. Fig.

후속연구

이는 산화아연 나노 막대 성장 후에 초순수를 이용한 과도한 린싱(rinsing)으로 인해수직으로 성장된 산화아연 나노막대가 쓰러진 것으로 생각된다. 이를 보완하여 산화아연 나노막대를 수직형태로 성장시키고, 씨앗용액의 농도와 성장용액의 농도를 증가시켜 산화아연 나노막대를 밀집되게 만들고 더욱 길어지게 형성한다면 산화아연 나노막대의 표면적은 더욱 커지게 되어 항원농도를 달리하였을 때보다 향상된 감도를 가질 수 있을 것으로 생각한다. 이와 같이 산화아연 나노막대가 가지는 많은 장점을 이용해 다른 형태의 바이오센서로의 응용이 가능할 것으로 판단되며 더 넓은 범위의 항원 검지가 가능하다면 이를 상업적으로도 이용 가능하다고 생각한다.
이를 보완하여 산화아연 나노막대를 수직형태로 성장시키고, 씨앗용액의 농도와 성장용액의 농도를 증가시켜 산화아연 나노막대를 밀집되게 만들고 더욱 길어지게 형성한다면 산화아연 나노막대의 표면적은 더욱 커지게 되어 항원농도를 달리하였을 때보다 향상된 감도를 가질 수 있을 것으로 생각한다. 이와 같이 산화아연 나노막대가 가지는 많은 장점을 이용해 다른 형태의 바이오센서로의 응용이 가능할 것으로 판단되며 더 넓은 범위의 항원 검지가 가능하다면 이를 상업적으로도 이용 가능하다고 생각한다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	H7N9 인플루엔자 바이러스의 특징은?	H7N9과 같은 조류 인플루엔자 바이러스의 발병원인은 조류 인플루엔자 바이러스에 감염된 조류와의 접촉으로 발생하며, 특히 바이러스에 감염된 조류의 배설물은 감염의 주요 매개체이다. H7N9 인플루엔자 바이러스는 H1N1처럼 사람에서 사람으로 전파가능성 은 낮으나 60대 이상의 성인 남성에게는 높은 발병률을 보이며, 발병 시 극심한 호흡기 질환을 일으키고 약 30%의 매우 높은 사망률 때문에 이를 검출할 수 있는 면역센서의 제작이 요구된다[3-5].
	바이러스 검지를 위한 면역센서는 높은 감도 및 선택성, 그리고 특정 항원/항체의 상호결합에 의한 신호검출 특성이 우수해야하는데 이를 위해 면역센서의 분석에서 사용하는 방법은?	바이러스 검지를 위한 면역센서는 높은 감도 및 선택성, 그리고 특정 항원/항체의 상호결합에 의한 신호검출 특성이 우수해야 한다. 이를 위해 면역센서의 분석에는 광열 편향 분광법 (photothermal deflection spectroscopy, PDS)[6], 화학발광법 (chemiluminescence)[7,8], 질량분석법(mass spectrometry)[9], 전기화학 측정법(electrochemistry)[10-12] 등이 사용된다. 이 가운데 전기화학 측정법은 낮은 농도의 항원 검출이 가능하고, 손쉬운 측정방식으로 인해 많은 연구가 활발히 진행되고 있는 분야 이며 본 논문에서는 일반적인 금속 전극만을 사용한 구조보다 민감도 향상을 위해 산화아연의 나노막대를 PDMS 내부에 성장시켜 미소량의 H7N9 인플루엔자 바이러스를 신속히 측정할수 있는 마이크로채널 기반의 전기화학적 면역센서의 제작 및 특성 분석 결과를 보인다.
	H7N9과 같은 조류 인플루엔자 바이러스의 발병원인은?	H7N9의 발병 증상에 대해 국제보건기구는 현재까지 극심한 폐렴으로 발전하면서 열과 기침, 숨가쁨을 동반한 증상을 보였다면서도, 여기에 대한 정보는 여전히 제한적이라고 언급하였다[2]. H7N9과 같은 조류 인플루엔자 바이러스의 발병원인은 조류 인플루엔자 바이러스에 감염된 조류와의 접촉으로 발생하며, 특히 바이러스에 감염된 조류의 배설물은 감염의 주요 매개체이다. H7N9 인플루엔자 바이러스는 H1N1처럼 사람에서 사람으로 전파가능성 은 낮으나 60대 이상의 성인 남성에게는 높은 발병률을 보이며, 발병 시 극심한 호흡기 질환을 일으키고 약 30%의 매우 높은 사망률 때문에 이를 검출할 수 있는 면역센서의 제작이 요구된다[3-5].

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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