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문제 정의
- TLC와 HPLC분석은 대한민국약전13)에 근거하여 amygdalin을 지표성분으로 설정하여 杏仁과 桃仁을 감별하는데 유효한지 검증하고자 하였다.
- 본 연구에서는 기원식물이 모두 Prunus屬에 속하고 약용 부위가 동일하여 혼·오용이 빈번하게 일어나는 杏仁과 桃仁에 대하여 자연상태, 약재상태, 내부형태 및 이화학성분 분석을 통하여 정확한 기원품의 감별요점을 찾고자 하였다.
- 이에 저자는 각 기원별 杏仁과 桃仁의 한약재를 자연상태, 약재상태, 내·외부형태 및 이화학패턴차이를 통하여 연구한 결과를 보고하고 감별기준을 새롭게 제시하고자 한다.
가설 설정
- 1. 내배유 세포가 3층이다. --------------------------桃仁 Persicae Semen
- 1. 잎이 披針形 혹은 卵狀披針形이며, 萼片은 반듯하다. (복숭아)
- 2. 扁心形으로 두께가 0.5∼0.8cm이다.
- 3. 종자가 작고 맛이 쓰며 合點의 비대칭정도가 심하지 않다
- 4. 약간 비대칭이다.
제안 방법
- HPLC에는 Agilent 1200 series (Agilent, USA)으로 분석된 데이터는 Agilent Chemstation (Agilent, USA)을 통해 처리하였다. 컬럼은 Aegipak C18-L (4.
- TLC분석은 플레이트에 하단으로부터 10 mm 되는 위치에 10 µL씩 점적하였고, 점적시 직경이 최소가 되도록 하였으며 시료간의 간격은 적정정도를 유지하였다.
- 내부형태관찰은 FAA로 고정하고 rapid dehydration를 거쳐 파라핀 포매 후 절삭하였다. 이후 modified Ju's triple stain method11)로 염색 후 광학현미경으로 관찰하였다.
- 외부형태관찰은 자연상태와 약재상태로 나누어 문헌내용을 바탕으로 육안적 관찰과 Stereoscope를 통하여 비교하여 관찰하였으며, 특히 약재상태의 길이와 폭의 분석은 각 샘플별 10개를 무작위 추출하여 버니어캘리퍼스를 이용하여 측정하였다.
- 외부형태는 Stereoscope(ZEISS, Germany)를, 내부형태는 Photoscope (NIKON, Japan), Microscope (NIKON, Japan)를 사용하여 관찰하였다. 여기에 사용된 시약 및 용매는 1등급 제품을 사용하였다.
- 이후 modified Ju's triple stain method11)로 염색 후 광학현미경으로 관찰하였다.
대상 데이터
- TLC플레이트는 TLC Silica gel 60 (MERCK, Germany)제품을 사용하였으며, 전개용매는 특급을 사용하였다.
- 5 mL/min이었고 시료는 15µL를 주입하였다. UV 검출기의 파장은 214 ㎚로 설정하였다.
- 우석대학교 한의과대학 본초학교실에서 동정·건조하여 보관중인 표본을 사용하였다. 아울러 시중에서 유통되는 한약재를 구입하여 동정한 후 사용하였다(Table 1).
- 외부형태는 Stereoscope(ZEISS, Germany)를, 내부형태는 Photoscope (NIKON, Japan), Microscope (NIKON, Japan)를 사용하여 관찰하였다. 여기에 사용된 시약 및 용매는 1등급 제품을 사용하였다.
- 우석대학교 한의과대학 본초학교실에서 동정·건조하여 보관중인 표본을 사용하였다.
- 추출용매는 HPLC등급의 MeOH (이상 100%, Fisher, USA)를 기기 분석에는 HPLC 등급의 DW, Acetonitrile (이상 100%, Fisher, USA)를 사용하였다. 이화학패턴 분석에 쓰인 지표성분은 amygdalin을 사용하였으며 구조식은 Fig. 1 과 같다.
- 6× 150 mm, 3µm pore size)을 사용하였다. 추출용매는 HPLC등급의 MeOH (이상 100%, Fisher, USA)를 기기 분석에는 HPLC 등급의 DW, Acetonitrile (이상 100%, Fisher, USA)를 사용하였다. 이화학패턴 분석에 쓰인 지표성분은 amygdalin을 사용하였으며 구조식은 Fig.
- 컬럼은 Aegipak C18-L (4.6× 150 mm, 3µm pore size)을 사용하였다.
성능/효과
- 1. 자연상태에서 杏仁은 잎이 卵形이며 桃仁은 披針形으로 구별이 되었으며, 아르메니아 살구, 살구, 개살구, 시베리아 살구는 樹皮의 코르크질 발달 정도와 花瓣의형태, 과실의 맛에 따라서, 복사나무와 산복사나무는 萼片의 털의 유무로 구별이 가능하였다.
- 2. 약재상태에서는 杏仁과 桃仁類의 감별은 기존의 약재의 크기 및 폭을 기준으로 하는 감별은 유의성이 없었다. 표면 維管束의 형태에서 桃仁類 한약재의 경우 維管束 무늬가 평행하나 杏仁類 한약재는 그물모양의 維管束 무늬의 가지가 뚜렷한 차이를 나타냈다.
- 3. 樹皮는 코르크질이 발달되었으며, 果實은 떫은 맛이 강하다.
- 3. 樹皮는 코르크질이 발달되지 않았으며, 果實은 달다
- 3. 내부형태에 있어서는 기존의 석세포와 공문의 형태를 기준으로한 감별은 유의성이 없었다.
- 4. 이화학 성분연구에서는 10종의 샘플의 TLC패턴의 차이는 없었으며, amygdalin의 지표성분 함량과 크로마토그램의 패턴 비교에서는 평균적으로 杏仁이 더 높은 함량을 보였고 전체적으로는 AS-1 (3.47 mg/mL)>AS-4>AS-2>AS-3>PS-4~6>PS-1~3 (2.68 mg/mL) 순이었다. 향후 채집샘플의 다양성과 새로운 지표성분의 설정을 통한 추후 연구가 필요한 것으로 판단된다.
- 하지만 10종 杏仁과 桃仁 샘플 모두 표면에 평행한 維管束무늬가 있었으며, 각 杏仁類와 桃仁類 샘플에서 維管束 형태에서 뚜렷한 차이를 나타내었다. 4종 杏仁(AS-1~4)의 경우에는 평행한 유관속무늬에서 갈라져 나온 작은 유관속 가지가 뚜렷했으나, 6종 桃仁류 샘플에서는 모두 나타나지 않아 크게 杏仁類와 桃仁類 한약재의 주요한 감별 요점이었다.
- TLC분석에서는 모두 동일한 패턴을 보였으며 종간에 뚜렷한 특징은 보이지 않아 TLC를 통한 杏仁과 桃仁의 감별은 유효하지 않았으며, 기존의 연구와도 일치하는 결과를 보였다6,7).
- ① 杏仁 4종과 桃仁 2종의 기원별 약재의 내부형태는 각 품목에서 뚜렷한 감별 요점을 찾을 수 없었다.
- 杏仁과 桃仁의 각 샘플 TLC 패턴을 살펴보면 지표성분으로 설정한 amygdalin은 Rf값 0.68에서 나타났으며 각 기원별 샘플에 대해서도 모두 동일한 패턴을 관찰할 수 있어, 기원별 뚜렷한 차이는 없었다. 이 외에 Rf값 0.
- 각 그룹별 감별에서 杏仁의 4종 기원별 약재의 경우 아르메니아살구가 다른 3종에 비해 크기가 컸으며 살구나무와 개살구나무 시베리아살구의 경우 모양의 형태에 좌우 대칭의 정도에서 약간의 차이를 나타냈으나 다소 주관적이고 뚜렷하지 않아 주요한 감별기준이 될 수 없었다. 桃仁의 2종 기원별 약재 중 복숭아나무의 종자의 경우 扁長卵形 혹은 扁橢圓形으로 상대적으로 크고 납작하며 표면 주름골이 얇은 특징이 있으며 산복사의 경우 類圓形으로 상대적으로 비교적 작고 통통하며 표면주름 골이 두꺼워 복숭아나무와 비교하여 크기와 維管束 주름의 깊이에서 차이를 나타냈다.
- 외부형태에서 杏仁과 桃仁의 각 기원별 약재는 황갈색 난원형 또는 심장형으로 모두 비슷하여 다소 모호하였다. 각 샘플별 약재 상태를 크기 및 폭을 측정하여 기존의 길이와 높이를 기준으로 한 감별법과 비교하여 검증한 결과는 약재의 높이로 杏仁과 桃仁의 감별은 杏仁(AS-1~4)과 도인 중 복숭아나무의 종자(PS-1~3)에서는 유효한 감별법이었으나 산복사(PS-4~6)의 경우에는 평균 높이 6.01 mm로 모든 종류의 杏仁과 비슷하거나 오히려 더 높았다. 이러한 차이는 길이높이 차이와 길이/높이 비에서도 같은 양상을 보이며 이것은 단순히 전체적인 크기에 의한 높이 차이가 아니었다.
- 8). 각각의 샘플에 대해서 amygdalin 함량을 비교해보면 먼저 4종 杏仁類 한약재의 amygdalin 함량은 평균 3.18 mg/mL, 2종 桃仁類 한약재의 amygdalin 함량은 평균 2.85 mg/mL로 桃仁類 한약재에 비하여 杏仁類 한약재의 amygdalin 함량이 다소 높았다. 기원식물별 약재의 amygdalin 함량은 살구나무 종자(AS-1)가 3.
- 기 확립된 분석법에 의한 HPLC분석에서 amygdalin은 머무름시간 9.6분으로 나타났으며 (Fig. 7), 지표성분의 검량선 확인 결과 직진성은 (r2≥0.99) 유의하였고, 杏仁 및 桃仁의 amygdalin 함량 분석을 위한 정량한계 (LLOQ, lower limit of quantitation) 농도는 1 µg/mL이었으며, 검출한계는 0.5µg/mL이었다(Table 3, 4).
- 기원식물별 약재의 amygdalin 함량은 살구나무 종자(AS-1)가 3.47 mg/mL로 가장 높은 함량을 보였으며 AS-4 > AS-2 > AS-3 > PS-4~6 > PS-1~3 순으로 높은 함량을 보였다.
- 다만 각 桃仁類와 杏仁類 2종으로 구분하여 내부형태를 살펴보면 2종 모두 표면의 石細胞는 타원형 또는 원형에 가깝고 種皮에는 작은 유관속이 통과하며 외배유세포는 1층이었다. 내배유세포에서 杏仁類 한약재의 경우 1층으로 이루어져 있으며, 桃仁類 한약재의 경우 3층으로 이루어져 杏仁과 桃仁의 그룹별 한약재 구별하는 가장 큰 차이를 보였다. 子葉에서는 杏仁의 경우 다각형의 박벽세포로 구성되어 있고 세포내 함유 물은 대개 전분립으로 구성되어 있으며 桃仁의 경우 원형의 박벽세포로 구성되어 있으며 세포내 함유물은 지방유가 대부분이었다(Fig.
- 의 연구와 상응하였는데, 이는 대상 한약재가 모두 Prunus속에 속하며 약용부위가 종자로 동일한 이유로 판단된다. 다만 본 연구에서는 8.7분대에 지표성분으로 설정하지 않은 미지의 피크가 검출되었는데, 복숭아나무 종자에서 가장 높은 피크를 보였으며 아르메니아살구의 종자에서는 검출되지 않아 가장 큰 차이를 보였다. 이는 HPLC 패턴 비교를 통한 杏仁과 桃仁類 한약재의 비교 감별 가능성을 보였으며, 추후 샘플의 다양성과 새로운 지표성분의 설정을 통한 추가 연구가 필요하다고 생각한다.
- 표면 維管束의 형태에서 桃仁類 한약재의 경우 維管束 무늬가 평행하나 杏仁類 한약재는 그물모양의 維管束 무늬의 가지가 뚜렷한 차이를 나타냈다. 따라서 약재상태에서는 기존의 크기 및 폭에 따른 감별 보다는 維管束의 형태에 따른 약재 감별기준이 더 객관적으로 유효하였다.
- 01 mm로 아르메니아살구>산복사>살구나무>개살구>시베리아살구>복숭아나무 순으로 나타났다. 또한 길이 높이 차이는 아르메니아살구가 11.32 mm, 복숭아나무 9.88 mm, 개살구 9.47mm, 시베리아살구 9.04 mm, 살구나무 7.78 mm, 산복사 6.8 mm 순 이었으며, 길이 높이 비는 복숭아나무 3.27, 아르메니아살구 2.83, 개살구나무 2.81, 시베리아살구 2.74, 살구나무 2.37, 산복사 2.15순 이었다(Table 2).
- 또한 버니어캘리퍼스를 이용하여 약재상태의 크기를 측정한 결과 각 기원별 杏仁의 평균 높이는 살구나무 5.7 mm, 개살구나무 5.22 mm, 시베리아살구 5.2 mm, 아르메니아살구 6.19 mm였으며, 桃仁 중 복숭아나무의 종자(PS-1~3)의 평균 높이는 4.37 mm, 산복사(PS-4~6)의 평균 높이는 6.01 mm로 아르메니아살구>산복사>살구나무>개살구>시베리아살구>복숭아나무 순으로 나타났다.
- 47 mg/mL로 가장 높은 함량을 보였으며 AS-4 > AS-2 > AS-3 > PS-4~6 > PS-1~3 순으로 높은 함량을 보였다. 아울러 가장 낮은 함량을 보인 복숭아나무 종자의 평균 함량은 2.68 mg/mL로 가장 높은 함량을 보인 살구나무 종자에 비해 0.77배 적었다 (Table 5).
- 이에 본 연구에서 새롭게 내부형태를 이용한 감별을 시도하였으며, 내배유세포에서 杏仁類 한약재의 경우 1층으로 이루어져 있으며, 桃仁類 한약재의 경우 3층으로 이루어져 杏仁과 桃仁의 그룹별 한약재 구별하는 가장 큰 차이를 보였다.
- 전처리 된 杏仁과 桃仁 추출물의 HPLC분석 결과와 chromatogram을 살펴보면 杏仁과 桃仁의 각각의 기원별 샘플에서 모두 공통적으로 amygdalin이 검출되었으며 머무름 시간은 9.6분으로 동일하였고 전체적인 패턴의 양상은 비슷하였다(Fig. 8). 각각의 샘플에 대해서 amygdalin 함량을 비교해보면 먼저 4종 杏仁類 한약재의 amygdalin 함량은 평균 3.
- 따라서 높이에 의한 감별은 산복사(PS-4~6)의 경우에는 유효하지 않았다. 하지만 10종 杏仁과 桃仁 샘플 모두 표면에 평행한 維管束무늬가 있었으며, 각 杏仁類와 桃仁類 샘플에서 維管束 형태에서 뚜렷한 차이를 나타내었다. 4종 杏仁(AS-1~4)의 경우에는 평행한 유관속무늬에서 갈라져 나온 작은 유관속 가지가 뚜렷했으나, 6종 桃仁류 샘플에서는 모두 나타나지 않아 크게 杏仁類와 桃仁類 한약재의 주요한 감별 요점이었다.
후속연구
- 또한 桃仁類 한약재에 비하여 杏仁類 한약재의 amygdalin 함량이 다소 높게 나온 점은 潘15)의 연구와 일치하는 결과를 보여주며, 기원식물별 약재의 amygdalin의 함량은 개체 간에 다소 차이를 나타냈으나 Fukuda9)의 연구 결과에서 지적했듯이 채집된 지역의 환경적 차이와 채집시기 등에 의하여 지표 성분의 함유량은 다소간에 차이를 보일 수 있기 때문에 절대적인 감별요점으로 삼기에는 부적합하였고 추후 다양한 지역과 채취시기에 따른 비교연구가 필요할 것으로 판단된다.
- 이상의 연구내용은 杏仁과 桃仁의 위품 및 기원품을 감별하는데 있어 임상 및 연구분야에서 매우 유용할 것으로 기대 된다. 또한 추가적인 연구를 통하여 내부형태 및 이화학 성분 분석에서 좀 더 정확도 높은 감별기준의 제시와 각 기원별 약재에 대해서 유의미한 효능차이의 규명이 필요할 것으로 판단된다.
- 7분대에 지표성분으로 설정하지 않은 미지의 피크가 검출되었는데, 복숭아나무 종자에서 가장 높은 피크를 보였으며 아르메니아살구의 종자에서는 검출되지 않아 가장 큰 차이를 보였다. 이는 HPLC 패턴 비교를 통한 杏仁과 桃仁類 한약재의 비교 감별 가능성을 보였으며, 추후 샘플의 다양성과 새로운 지표성분의 설정을 통한 추가 연구가 필요하다고 생각한다.
- 이상의 연구내용은 杏仁과 桃仁의 위품 및 기원품을 감별하는데 있어 임상 및 연구분야에서 매우 유용할 것으로 기대 된다. 또한 추가적인 연구를 통하여 내부형태 및 이화학 성분 분석에서 좀 더 정확도 높은 감별기준의 제시와 각 기원별 약재에 대해서 유의미한 효능차이의 규명이 필요할 것으로 판단된다.
- 68 mg/mL) 순이었다. 향후 채집샘플의 다양성과 새로운 지표성분의 설정을 통한 추후 연구가 필요한 것으로 판단된다.
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