Objectives : The purpose of this study was to investigate effects of Houttuyniae Herba water extract (HC) on calcium release and production of various inflammatory mediators such as nitric oxide (NO), interferon-inducible protein (IP)-10, platelet derived growth factor (PDGF)-BB, keratinocyte-derive...
Objectives : The purpose of this study was to investigate effects of Houttuyniae Herba water extract (HC) on calcium release and production of various inflammatory mediators such as nitric oxide (NO), interferon-inducible protein (IP)-10, platelet derived growth factor (PDGF)-BB, keratinocyte-derived chemokine (KC), vascular endothelial growth factor (VEGF), interleukin (IL)-4, and IL-5 in lipopolysaccharide (LPS)-induced RAW 264.7 mouse macrophages. Methods : NO production was measured by Griess reagent assay. Intracellular calcium level was measured with Fluo-4 assay. Levels of cytokines were measured by High-throughput multiplex bead array cytokine assay based on xMAP (multi-analyte profiling beads) technology. Results : HC significantly decreased NO production for 24 hrs incubation at the concentrations of 10, 25, 50, 100, and $200{\mu}/mL$ in LPS-induced RAW 264.7 (P < 0.05). HC significantly decreased production of IP-10, KC, VEGF, and PDGF-BB for 24 hrs incubation at the concentrations of 50, 100, and $200{\mu}/mL$ in LPS-induced RAW 264.7 (P < 0.05). HC also significantly decreased intracellular calcium release for 24 hrs incubation at the concentrations of 25, 50, 100, and $200{\mu}/mL$ in LPS-induced RAW 264.7 (P < 0.05). But HC did not show any significant effect on production of IL-4 and IL-5 in LPS-induced RAW 264.7. Conclusions : The results suggested that HC has anti-inflammatory property related with its inhibition on the production of NO, IP-10, KC, VEGF, and PDGF-BB in LPS-induced macrophages via calcium pathway.
Objectives : The purpose of this study was to investigate effects of Houttuyniae Herba water extract (HC) on calcium release and production of various inflammatory mediators such as nitric oxide (NO), interferon-inducible protein (IP)-10, platelet derived growth factor (PDGF)-BB, keratinocyte-derived chemokine (KC), vascular endothelial growth factor (VEGF), interleukin (IL)-4, and IL-5 in lipopolysaccharide (LPS)-induced RAW 264.7 mouse macrophages. Methods : NO production was measured by Griess reagent assay. Intracellular calcium level was measured with Fluo-4 assay. Levels of cytokines were measured by High-throughput multiplex bead array cytokine assay based on xMAP (multi-analyte profiling beads) technology. Results : HC significantly decreased NO production for 24 hrs incubation at the concentrations of 10, 25, 50, 100, and $200{\mu}/mL$ in LPS-induced RAW 264.7 (P < 0.05). HC significantly decreased production of IP-10, KC, VEGF, and PDGF-BB for 24 hrs incubation at the concentrations of 50, 100, and $200{\mu}/mL$ in LPS-induced RAW 264.7 (P < 0.05). HC also significantly decreased intracellular calcium release for 24 hrs incubation at the concentrations of 25, 50, 100, and $200{\mu}/mL$ in LPS-induced RAW 264.7 (P < 0.05). But HC did not show any significant effect on production of IL-4 and IL-5 in LPS-induced RAW 264.7. Conclusions : The results suggested that HC has anti-inflammatory property related with its inhibition on the production of NO, IP-10, KC, VEGF, and PDGF-BB in LPS-induced macrophages via calcium pathway.
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문제 정의
본 연구에서는 LPS로 유발된 마우스 대식세포 RAW 264.7의 염증촉발매개물질, 예를 들면 IP-10, PDGF-BB, KC 등의 과잉증가에 대한 어성초(魚腥草) 물추출물(HC)의 작용을 알아보기 위하여 in vitro 실험을 수행하여 다음과 같은 결론을 얻을 수 있었다.
이에 본 연구에서는 淸熱解毒效能을 가지고 있는 어성초를 물추출하여 제조한 시료(HC)를 대상으로 mouse macrophage RAW 264.7 cells의 cell viability, 그리고 LPS에 의해서 유발되는 마우스 RAW 264.7 cells의 NO 생성증가, 세포내 calcium 증가, IP-10, PDGF-BB, KC, VEGF와 같은 염증 촉발물질(proinflammatory mediators)의 생성증가에 미치는 효과를 조사하였다.
약리작용으로는 항균작용(抗菌作用), 면역증강작용(免疫增强作用), 항염증작용(抗炎症作用), 이뇨작용(利尿作用), 진해작용(鎭咳作用)이 있는 것으로 알려져 있다1,7-11). 이에 본 연구진은 어성초(魚腥草) 물추출물의 세포독성과 항염활성에 미치는 효과를 검증해보고자 어성초(魚腥草)를 열수추출하여 제조한 시료(HC)를 대상으로 마우스 대식세포 RAW 264.7의 세포생존율(cell viability)과 지질다당체 (lipopolysaccharide; LPS)로 유발된 RAW 264.7의 NO, 세포내 calcium, interferon-inducible protein(IP)-10, platelet derived growth factor(PDGF)-BB, keratinocyte-derived chemokine(KC), vascular endothelial growth factor(VEGF) 등의 염증촉발인자(proinflammatory mediators) 방출증가에 미치는 영향을 조사하여 유의한 항염활성 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
96 well plate에 1×104 cells/well의 농도로 분주되도록 1×105 cells/mL의 cell을 100 µL씩 넣고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간동안 배양한 후, 배지를 버리고 배양세포 표면을 PBS용액으로 씻어준 뒤, LPS(1 ㎍/mL) 단독 혹은 배지에 녹인 시료와 함께 각 well에 처리하고 24시간 동안 배양 후 상층액을 채취하여 멀티플렉스어세이를 실시하였는데, 세포배양 상층액을 분주하기 전에 96 well plate 타입의 Filter plate를 wash buffer로 세척 후, 특정항체가 결합되어 있는 beads를 분주한 후 다시 한번 wash buffer로 세척하고 세척이 끝나면 세척액을 모두 제거한 후 준비된 세포배양상층액과 표준물질(standard antibody)을 각 well에 50µL씩 분주하였고, 분주가 끝나면 실온에서 30분간 500 rpm 의 속도로 shaking한 뒤에, wash buffer를 이용, 3회의 세척을 실시하였으며, 세척이 끝나면 세척액을 모두 제거한 후 미리 혼합된 Detection Antibody를 각 well에 25 µL씩 분주하고 실온에서 30분간 500 rpm의 속도로 shaking한 뒤에, wash buffer를 이용, 3회의 세척을 실시하였고, 세척이 끝나면 세척액을 모두 제거한 후 미리 잘 섞인 Streptavidin-PE 를 각 well에 50 µL씩 분주하고 실온에서 30분간 500 rpm 의 속도로 shaking한 뒤에, wash buffer를 이용, 3회의 세척을 실시하고 세척이 끝나면 세척액을 모두 제거한 후 각 well에 Reading buffer를 120 µL씩 분주하고 실온에서 5분간 500rpm의 속도로 shaking한 후 Bioplex-200을 이용, 각 cytokine의 생성수준을 측정, 비교하였다15-18).
HC가 RAW 264.7 세포들의 세포생존율에 미치는 영향을 비교하였다. 24시간 처리한 결과 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 유의한 감소는 나타나지 않았다(Fig.
LPS 단독 혹은 다양한 농도의 시료와 함께 배지에 담아 세포가 분주되어 있는 96well plate의 각 well에 처리하고 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하고, 배양이 끝난 후 세포배양액을 버리고 100 µL의 Fluo-4 dye loading solution을 37℃에서 30분간 처리한 뒤, spectrofluorometer(excitation 485 nm; emission 535 nm)를 이용하여 세포내 칼슘의 양을 측정, 비교하였다17-18).
LPS를 단독처리하거나 혹은 다양한 농도의 시료와 함께 배지에 담아 각 well에 처리하고 24시간 동안 37℃, 5 % CO2 Incubator에서 배양한 후 세포배양 상등액 100 ㎕을 채취하여 여기에 그리스 시약 100 µL를 혼합하여 15분 동안 반응시킨 후 Microplate Reader를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정, 비교하였다13-14,17-18).
LPS에 의해서 유발되는 RAW 264.7의 세포내 칼슘증가에 미치는 시료의 영향을 알아보기 위하여 Fluo-4 calcium assay를 다음과 같이 실시하였다. LPS 단독 혹은 다양한 농도의 시료와 함께 배지에 담아 세포가 분주되어 있는 96well plate의 각 well에 처리하고 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하고, 배양이 끝난 후 세포배양액을 버리고 100 µL의 Fluo-4 dye loading solution을 37℃에서 30분간 처리한 뒤, spectrofluorometer(excitation 485 nm; emission 535 nm)를 이용하여 세포내 칼슘의 양을 측정, 비교하였다17-18).
대상 데이터
본 실험에 사용된 시약 중 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), heat-inactivated fetal bovine serum(FBS), penicillin and streptomycin, phosphate-buffered saline(PBS, pH 7.4)은 Gibco BRL(NY, USA)에서, multiplex cytokine assay kit는 Panomics(CA, USA)에서 구입하였으며, 기타 시약은 Sigma-Aldrich사(MO, USA)에서 구입하였으며, 사용된 기기는 research microscope(Becton dickinson, USA), centrifuge(Gyrozen, Korea), CO2 incubator(NUAIRE, USA), clean bench(Jeiothec, Korea), rotary vacuum evaporator (Eyela, Japan), water bath(Sae Han, Korea), vortex mixer(Vision Scientific Co, Korea), freeze dryer(Eyela, Japan), deep freezer(Gudero, Ilshin Lab, Korea), Microplate Reader(Bio-Rad, USA), spectrofluorometer(Dynex, UK), Bio-plex 200(Bio-Rad, USA) 등이다.
본 연구에 사용된 어성초(魚腥草)는 옴니허브 제약회사(대구, 한국)로부터 구입하였으며, 실험 전에 깨끗이 세척한 후 사용하였다.
실험에 사용된 대식세포는 mouse macrophage(RAW 264.7 cell line)이며, 한국세포주은행(KCLB, Korea)에서 구입하였다.
어성초(魚腥草) 50 g을 정확하게 중량을 측정한 뒤 환류추출기에 1차 증류수 2,000 mL와 함께 넣은 뒤 탕액이 끓는 시점으로부터 2시간 동안 가열하여 추출한 다음 추출액을 filter paper(Advantec No.2, Japan)로 감압 여과한 여과액을 rotary vacuum evaporator를 이용하여 농축액을 얻었으며, 이 농축액을 동결건조기를 이용하여 건조한 분말(수율;17.08%)을 시료로 사용하였다.
데이터처리
실험성적은 평균치 ± 표준오차 (Mean ± SEM)로 나타내었 으며, 대조군과 각 실험군과의 평균 차이는 Student t-test 로 분석하여 P < 0.05일 때 통계적으로 유의한 것으로 판정 하였다.
7 세포들의 세포생존율에 미치는 영향을 비교하였다. 24시간 처리한 결과 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 유의한 감소는 나타나지 않았다(Fig. 1).
3. HC는 LPS로 유발된 마우스 대식세포 RAW 264.7의 세포내 calcium 증가를 25 ㎍/mL이상의 모든 농도에서 유의하게 감소시켰다(P < 0.5).
HC가 LPS로 유발된 마우스 대식세포의 KC, IP-10, VEGF, PDGF-BB 생성증가에 미치는 영향을 비교하기 위해 24시간동안 처리한 결과에서는 50, 100, 200 ㎍/mL 의 모든 농도에서 모두 LPS에 의한 생성증가를 유의하게 억제시켰다. 이는 김25)이 어성초에서 추출한 성분들이 LPS로 유발된 RAW 264.
HC가 macrophage의 세포 생존율에 미치는 영향을 비교하기위해 24시간 동안 처리한 결과 25, 50, 100, 200, 400㎍/mL의 모든 농도에서 유의한 생존율감소는 나타나지 않았 으므로 세포독성은 없는 것으로 판단하였다. HC가 LPS로 유발된 마우스 대식세포의 NO 생성증가에 미치는 영향을 비교하기위해 24시간동안 처리한 결과에서는 10 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 LPS에 의한 NO 생성증가를 유의하게 억제시켰으며, LPS로 유발된 마우스 대식세포의 세포내 calcium 증가에 미치는 영향을 비교하기위해 24시간동안 처리한 결과에서는 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 LPS에 의한 세포내 calcium 증가를 유의하게 억제시켰다.
HC가 macrophage의 세포 생존율에 미치는 영향을 비교하기위해 24시간 동안 처리한 결과 25, 50, 100, 200, 400㎍/mL의 모든 농도에서 유의한 생존율감소는 나타나지 않았 으므로 세포독성은 없는 것으로 판단하였다. HC가 LPS로 유발된 마우스 대식세포의 NO 생성증가에 미치는 영향을 비교하기위해 24시간동안 처리한 결과에서는 10 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 LPS에 의한 NO 생성증가를 유의하게 억제시켰으며, LPS로 유발된 마우스 대식세포의 세포내 calcium 증가에 미치는 영향을 비교하기위해 24시간동안 처리한 결과에서는 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 LPS에 의한 세포내 calcium 증가를 유의하게 억제시켰다.
LPS(1 ㎍/mL) 단독 혹은 준비된 시료 HC(10, 25, 50, 100, 200 ㎍/mL)와 함께 RAW 264.7 세포들을 24시간 동안 배양한 결과 LPS로 인한 NO 생성증가를 HC가 10 ㎍/mL 이상의 농도에서 모두 유의(P < 0.05)하게 감소시켰다(Fig. 2).
LPS(1 ㎍/mL) 단독 혹은 준비된 시료 HC(25, 50, 100, 200 ㎍/mL)와 함께 RAW 264.7 세포들을 24시간 동안 배양한 결과 LPS로 인한 세포내 calcium 증가를 HC가 25 ㎍/mL 이상의 농도에서 모두 유의(P < 0.05)하게 감소시켰다 (Fig. 3).
LPS(1 ㎍/mL) 단독 혹은 준비된 시료 HC(50, 100, 200㎍/mL)와 함께 RAW 264.7 세포들을 24시간 동안 배양한 결과 LPS로 인한 PDGF-BB 생성증가를 HC가 50 ㎍/mL 이상의 농도에서 모두 유의(P < 0.05)하게 감소시켰다(Fig. 7).
LPS(1 ㎍/mL) 단독 혹은 준비된 시료 HC(50, 100, 200㎍/mL)와 함께 RAW 264.7 세포들을 24시간 동안 배양한결과 LPS로 인한 IP-10 생성증가를 HC가 50 ㎍/mL 이상의 농도에서 모두 유의(P < 0.05)하게 감소시켰다(Fig. 5).
LPS(1 ㎍/mL) 단독 혹은 준비된 시료 HC(50, 100, 200㎍/mL)와 함께 RAW 264.7 세포들을 24시간 동안 배양한결과 LPS로 인한 KC 증가를 HC가 50 ㎍/mL 이상의 농도에서 모두 유의(P < 0.05)하게 감소시켰다(Fig. 4).
이상의 결과, 어성초를 열수 추출하여 제조한 시료 HC는 대식세표의 생존율을 감소시키지 않으면서 LPS로 유발된 대식세포의 세포내 calcium증가를 억제하면서, NO, IP-10, PDGF-BB, KC, VEGF의 생성증가를 억제하는 등 유의한 항염효능을 가지고 있는 것으로 나타났다. 앞으로 어성초 물 추출물을 이용한 대식세포 관련 염증질환 치료제개발을 위하여 더욱 많은 연구가 필요할 것으로 판단된다.
후속연구
이와 같은 실험결과는 HC가 대식세포의 NO, IP-10, PDGF-BB, KC, VEGF 생성증가와 관련된 과잉염증반응 및 급만성의 염증질환을 조절할 수 있는 효능을 가지고 있음을 의미한다. 앞으로 HC의 항염효능규명을 위한 보다 세밀한 연구가 요구되어지는 바이다.
이상의 결과, 어성초를 열수 추출하여 제조한 시료 HC는 대식세표의 생존율을 감소시키지 않으면서 LPS로 유발된 대식세포의 세포내 calcium증가를 억제하면서, NO, IP-10, PDGF-BB, KC, VEGF의 생성증가를 억제하는 등 유의한 항염효능을 가지고 있는 것으로 나타났다. 앞으로 어성초 물 추출물을 이용한 대식세포 관련 염증질환 치료제개발을 위하여 더욱 많은 연구가 필요할 것으로 판단된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
어성초는 어떤 증상을 치료하는가?
어성초에는 청혈해독(凊熱解毒), 청리습열(淸利濕熱), 이뇨 통림(利尿通淋), 소종(消腫)하는 효능(效能)과 항균작용(抗菌作用), 항병독작용(抗病毒作用), 이뇨작용(利尿作用), 진통작용 (鎭痛作用), 지혈작용(止血作用)과 진해작용(鎭咳作用), 항종양 효과(抗腫瘍效果)가 있는 것으로 알려져 있다1-10). 폐렴(肺炎;pneumonia), 폐농양(肺膿瘍;pulmonary abscess), 열리 (熱痢;fever dysentery), 학질(瘧疾;malaria), 수종(水腫;edema), 임병(淋病;gonococcal), 백대(白帶;leucorrhea), 옹종(癰腫;tumor), 치질(痔疾;haemorrhoids), 탈항(脫肛;prolapse of the anus), 습진(濕疹;eczema), 개선(疥癬;scabies) 등의 증상을 치료한다1-5).
염증이란 무엇인가?
염증(炎症,inflammation)이란 외부상처 혹은 국소적 손상을 통하여 체내에서 일어나는 복잡한 반응으로서 홍색의 색깔을 띄우고(발적;redness), 부어오르며(종창;swelling), 열이나고(발열;heat), 통증(pain) 등의 증상을 수반하는 데 이러한 염증반응과 관련된 면역세포 중에 대표적인 것이 대식세포 (macrophage)이다. 대식세포는 감염체나 비정상적인 세포부산물 등으로부터 자극을 받으면 싸이토카인(cytokine)이나 일산화질소(nitric oxide;NO)와 같은 염증매개물질을 방출하여 염증반응을 유발하는 데, 제어되지 못하는 과잉의 염증반응은 급만성의 각종 염증질환의 발생과 연관되어진다.
어성초를 약용으로 사용하는 때는 언제인가?
어성초(魚腥草)는 따뜻하고 습윤한 기후를 좋아하며 그늘지고, 축축한 땅이나 물가에서 자라며1-6), 지역에 따라 차이는 있으나 보통 4월경에 싹이 트고, 초여름에 꽃이 피며, 결실기는 10-11월이다1-6). 여름철에 경엽(莖葉)이 무성하고, 화수(花穗)가 많을 때 채취하여 햇볕에 말린후 절단하여 약용(藥用)으로 사용한다1-6). 우리나라에서는 중부지방에서 자생 또는 재배되고 있으며, 중국에서는 장강(長江) 이남의 각(各) 성(省)에 분포한다1).
참고문헌 (26)
Chunkukhaniguadaehak Gongdonggyoujaepyouchanwewonhoi. Bonchohak. Seoul : Younglimsa. 1991 : 270-1.
Gansoshineihakwon. Chinese Meteria Medica. Hongkong : Shanghaigisulchulpansa. 1978 : 1439-41.
Na G, Sa MJ. Chungjipmyoungwibyulrokjeonmoon (Vol. 1). Daijoong : Joonggukwiyakhakwonyoungu. 1976 : 297.
Dae SM. Junggukyakjaehak(ha). Daibei : Upsuoguk. 1981 : 1058-9.
Ahn DG. Wonsaekhangukbonchodogam. Seoul : Kyohaksa. 1998 : 98.
Shin MK. Imsangbonchohak. Seoul : Younglimsa. 1997 : 574-5.
Park WS. Effect of White Ginseng-Ejung-tang Water Extract on Cytokine Production in LPS-induced RAW 264.7 Mouse Macrophages. Kor J Ori Med Physiol Pathol. 2012 ; 27(6) : 738-44.
Lee JY, Kim YJ, Park WS. Effects of White Ginseng-Ejung-tang Acupuncture Solution on Nitric Oxide and Hydrogen Peroxide Production in LPS-induced Mouse Macrophages. Kor J Acu. 2011 ; 28(1) : 61-9.
Park WS. Effect of Sacchromyces cerevisiae-Fermented Artemisiae Argi Folium on Nitric oxide Production of Macrophage Treated with Toxicants. Kor J Ori Med Physiol Pathol. 2009 ; 23(4) : 883-7.
Park WS. The Effect of Bacillus-Fermented Scutellariae Radix Acupuncture Solution on Interleukin Production in Mouse Macrophage Stimulated by Lipopolysaccharide. Kor J Acu. 2010 ; 27(2) : 95-105.
Park WS. Inhibitory Effect of Gallic acid on Production of Chemokine and Growth Factor in Mouse Macrophage Stimulated by Lipopolysaccharide. Kor J Ori Med Physiol Pathol. 2010 ; 24(4) : 586-91.
Lee JY, Park W. Anti-Inflammatory Effect of Myristicin on RAW 264.7 Macrophages Stimulated with Polyinosinic-Polycytidylic Acid. Molecules. 2011 ; 16(8) : 7132-42.
Lee JY, Park W, Yi DK. Immunostimulatory effects of gold nanorod and silica-coated gold nanorod on RAW 264.7 mouse macrophages. Toxicol Lett. 2012 ; 209(1) : 51-7.
Jeong HR, Kwak JH, Kim JH, Choi GN, Jeong CH, Heo HJ. Antioxidant and Neuronal Cell Protective Effects of an Extract of Houttuynia cordata Thunb (a Culinary Herb). Korean J Food Preserv. 2010 ; 17(5) : 720-6.
Jeong BC, Kim DC, Baek SH, Kim EH. The effect of Houttuynia cordata thunberg on the inhibition of growth of leiomyomas and apoptosis. J Kor Obstet Gynecol. 2007 ; 20(3) : 1-12.
Barnes PJ, Chung KF, Page CP. Inflammatory mediators of asthma: an update. Pharmacol Rev. 1998 ; 50 : 515-96.
Yoon SB, Lee YJ, Park SK, Kim HC, Bae H, Kim HM, Ko SG, Choi HY, Oh MS, Park W. Anti-inflammatory effects of Scutellaria baicalensis water extract on LPS-activated RAW 264.7 macrophages. J Ethnopharmacol. 2009 ; 125 : 286-90.
Kim HS. Isolation from Houttuynia Cordata and their anti-inflammatory activity. Graduate School of Joongbu University. 2010 : 75-81.
Lee JY, Lee YJ, Park WS. Anti-inflammatory Effects of Fermented Houttuyniae Herba Water Extract on LPS-induced Mouse Macrophage. Kor J Herbology. 2010 ; 25 : 27-34.
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